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标题: [求助]如何取乳鼠心脏？定位？ [打印本页]

作者: ROSE李 时间: 2012-5-21 13:05 标题: [求助]如何取乳鼠心脏？定位？

如何取乳鼠心脏？定位？怎样避免取原代时污染？先谢谢各位群友的热心指导。

作者: yychen 时间: 2012-5-21 13:06

操作好像很多人写过。
主要就是乳鼠固定消毒，用镊子撕开皮肤，然后更换器械，用眼科剪在胸廓左侧约心脏体表投影位置，水平切开肋骨，切口约1cm左右，挤出心脏。只要不剪开腹腔和肺。一般就不会污染。

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:06

操作好像很多人写过。
主要就是乳鼠固定消毒，用镊子撕开皮肤，然后更换器械，用眼科剪在胸廓左侧约心脏体表投影位置，水平切开肋骨，切口约1cm左右，挤出心脏。只要不剪开腹腔和肺。一般就不会污染。

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同意，也可剪成T字形状，用眼科镊一挤，心脏被挤出来后用眼科剪或眼科弯镊一夹就OK 啦，搜索本版有很多资源。

作者: ROSE李 时间: 2012-5-21 13:10

谢谢各位热心帮助，我反复污染近10次，刚消化完镜下就看见小颗粒在不停抖动，但数天后培养基仍然清亮，不知什么污染，细菌培养皿不长细菌。我快疯了！

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:10

刚消化完镜下就看见小颗粒在不停抖动，但数天后培养基仍然清亮，不知什么污染，细菌培养皿不长细菌。我快疯了！

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小颗粒是什么颜色的，怀疑是刚消化下来的细胞吧，就是那些亮亮的小圆点。不应该是污染也太快了吧。
PS，不长细菌是什么意思，笔误？

作者: windy+++ 时间: 2012-5-21 13:11

黑色，不是刚消化的细胞，在做布朗运动，只要它出现，细胞就不贴壁。不知那个环节污染，接种到血清琼脂糖培养基又没有菌落，培养液3天也不浑浊。我加新洁尔灭进去，它就不动了

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:11

那你的细胞培养的怎样，是否也受的了影响，心肌细胞有搏动吗。你怎么确定是污染的，细胞不贴壁吗

作者: xingyi08 时间: 2012-5-21 13:12

取元代第二天心肌细胞就死了，没有搏动，我每次贴壁去除成纤维细胞前，镜下看见那些小颗粒心都凉透了。培养基，血清换个便，还是一样。请大家指教啊

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:12

可以具体说一下你的操作过程吗，信息量有点少，具体一点的话大家说不定会帮助你的。

作者: ROSE李 时间: 2012-5-21 13:12

谢谢各位群友的热心帮助，请继续指点迷津。我是在乳鼠第五肋间横切皮肤，事先浸泡酒精3min,老鼠已经死亡，有些拉便便，是否浸泡太久了。切完皮肤，碘伏消毒，换器械切开肌肉，再换剪刀剪心脏，不过因为停跳，不好取，有时也用镊子夹取。取出心脏在无菌培养皿洗涤，剪碎，加胶原酶消化。吸取上清入加血清培养基，收集所有消化液后离心，加培养基吹散贴壁，此时就已经发现黑色小颗粒在做布朗运动，如此失败重复近10次，我现在处于绝望停工阶段，请大家多多指教。

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:13

在取乳鼠心脏时最好不要让其死亡，如果在酒精中泡的时间太长酒精会进入乳鼠的消化道和呼吸道，这样是不好的，再有就是死后的乳鼠取心脏时不容易取，而如果是在活体的状态下取时可以很容易的找到搏动的心脏，且此时心脏的活性也是比较好的。我平时就是用镊子夹住再酒精里过一遍，固定好乳鼠后再用酒精棉球擦一遍。
用两把眼科镊子（眼科弯镊最好）夹住皮肤分别向头和尾的方向一撕就可以把皮完整的撕开，并且可保证第一套器械不接触皮下的肌肉。在剑突左侧剪一十字形状的口。用两把眼科镊或一把眼科镊和一把眼科剪就可以取下心脏。实现准备好一高压消毒好的的培养皿，内放冷的PBS，取下的心脏放入其中。时间要尽量的短，最大程度的保证消化后的细胞活力。然后转入超净台。剩下的就是消化过程了。酶的浓度，消化的温度和次数，是吹打消化还是搅拌消化或振荡消化…….论坛里有关于乳鼠消化的一些注意事项。可以搜一下，对比自己的看看。

作者: flower-201 时间: 2012-5-21 13:13

我和你出现的问题一样一样，所有东西换了个遍，还是一样，郁闷中。。。。。。。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 13:14

我的问题跟你完全一样的，我现在所有环节都排除了一遍，还是没有找到原因，我看了上面的怀疑是手术时打开了腹腔导致污染

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 13:14

我手术时心脏基本上是在搏动情况下取的，但是细胞还是在第二天开始死亡，也只有半数贴壁，还有大量小黑点在做布朗运动

作者: ROSE李 时间: 2012-5-21 13:14

细菌污染2-3天培养基会混浊，镜下大量细菌，我的没有啊，但肯定是微生物因为新洁尔灭去完元代加进去，那些小黑点就不动了，到底是什么？请问楼上你和我的一样吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:15

保持心肌细胞活力好的办法：一个就是取材时的时间要尽量的短，另外在分次消化时要把握好消化的时间，防止胰酶对心肌细胞的损伤。再者就是注意无菌的操作了，因为做一次心肌细胞培养的时间很长，大概要3个小时多，期间很容易污染。关键是多做几次，更换不同的条件，摸索好适合自己的消化条件，同时在取材、消化、终止、离心、接种各方面注意无菌操作。另，取心脏时尽量不要打开腹腔，防止污染。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 13:15

我的差不多是在点板后几个小时开始出现小点，我仔细看了一下，这些小点不停的抖动，会推动细胞，使细胞无法贴壁，我做了5次了每次都有这种小黑点，细胞状态会越来越差，大部分无法贴壁，更别提搏动了，我的胰酶，培养基都是跟人混用的，都可以排除，我只能认为是消化时用的玻璃器皿的问题，这些我是洗液浸泡过夜，高温灭菌的，出问题的几率很低，我现在也找不到原因，头疼死了

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 13:15

我的是小亮点，在100倍镜下观察，像沙子一下，看不清具体形态，我调到400倍镜下看，是圆形小亮点，跟细胞差不多颜色，体积比细胞小很多，没有核，做布朗运动，包围细胞，使细胞无法贴壁，这种小点以出现，细胞就无法贴壁，而且小亮点会越来越多，现在也不知道这是细胞状态不好的产物还是这些小亮点导致细胞状态不好

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 13:16

园丁##，你说的注意点我都做过了，而且请了人来看我的操作，确认没有问题，人家也是用相同的操作的，但是我的细胞始终无法贴壁，原因应该是这些小点出现，但是实在不知道是在哪个环节引入的，不知道有没有战友遇到过这个问题

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:16 标题: 回复 #19 jrwyyplt 的帖子

这种情况确实没遇到过，你说小点会不停的抖动，还会推动细胞，使细胞无法贴壁。我确实不知道什么原因。
另，差速贴壁后是否进行了台盼蓝计数，大致看一下死活的细胞数目，是否是消化的原因导致细胞状态活性不好，从而无法贴壁。消化时是否用的多次消化。
另外是不是材料的原因，可换用SPF级别的乳鼠做一次排除一下这方面的原因。再看看其他战友的建议。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 13:17

我为了确认不是消化过度的原因，消化的时间非常短，消化下来的细胞也不多，所以消化过度的因素应该排除了，至于材料问题，我跟其他同学用了同一家的乳鼠，共用培养基，胰酶，操作也是在同学的全程指导下进行的，确认没有问题，但是她的心肌细胞可以贴壁，仔细观察下她的细胞也有小亮点，但是数量很少，不影响细胞贴壁，她的细胞也可以搏动。所以我实在找不到原因了

作者: 园丁## 时间: 2012-5-21 13:17 标题: 回复 #21 jrwyyplt 的帖子

实在是不清楚所谓的小白点是什么东东。
你在另外一个帖子说收集上清，离心，弃去上清，，弱弱的问一下消化后是否是将收集好的上清用含血清的培养基及时终止了，还是直接将收集到的上清离心。我在操作的过程中是提前将含血清的培养基放入离心管中，每次消化好后直接将上清转移到含血清的离心管中。再将10ml的离心管拧紧然后用封口膜封口，转移到4度冰箱中，待最后消化完后一起离心、重悬。另，你的帖子中说到用0.1%的胰酶消化时每次的时间是3分钟，时间是不是有点短啊，当时的消化液浑浊了吗。

作者: u234 时间: 2012-5-21 13:17

谢谢各位战友的热心帮助，请继续指点迷津。我是在乳鼠第五肋间横切皮肤，事先浸泡酒精3min,老鼠已经死亡，有些拉便便，是否浸泡太久了。切完皮肤，碘伏消毒，换器械切开肌肉，再换剪刀剪心脏，不过因为停跳，不好取，有时也用镊子夹取。取出心脏在无菌培养皿洗涤，剪碎，加胶原酶消化。吸取上清入加血清培养基，收集所有消化液后离心，加培养基吹散贴壁，此时就已经发现黑色小颗粒在做布朗运动，如此失败重复近10次，我现在处于绝望停工阶段，请大家多多指教。

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我们取新生小鼠心脏，不让其死亡，在酒精中沾一下即可。
1、用眼科剪从腹部一直剪到气管，在气管处剪一下，用眼科剪将心脏勾出即可
2、我们师姐用剪刀横断小鼠，心脏可直接暴露，剪下即可

作者: pengke1983 时间: 2012-5-21 13:18

我的心肌细胞中也有小黑点，做布朗运动，但是不影响细胞贴壁，细胞状态很好，12小时后有部分搏动，第二天达到高峰了。前段时间也是不搏动，我也怀疑是小黑点的问题，以前一次做10只鼠，后来改成20只就好了，我用的是分次消化，10只很容易就消化过了，碎片很多，取材的时候我是先用碘伏泡一次，再用75%酒精泡一次，时间短些，活着取，先用眼科剪将皮肤剪开，再换剪剪开肌肉，心脏就自动跳出来了，剪的时候尽量一下剪下来，不要让它碰到皮肤。

作者: ROSE李 时间: 2012-5-21 13:18

大家的热心指导，非常感谢。我的细胞里的小黑点加了新洁尔灭就不动了，我觉得还是像微生物。好头疼，又培养不出细菌。

作者: ROSE李 时间: 2012-5-21 13:19

谢谢各位大侠指导。小黑点是细胞活力问题。我采用分次消化，分次离心，及时用血清培养基保存于4度冰箱，最后集中贴壁接种，现在虽有小黑点，但细胞存活搏动。换液后黑点消失。感谢大家的热情帮助！感谢丁香园！

作者: viviwang1987 时间: 2012-5-21 13:20

各位的纯度和细胞存活率如何？
我现在纯度问题解决了，但是存活率还是非常低。不知道各位的胶原酶买了哪家公司的，消化时间多长？谢谢。

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