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标题: [求助]我培养的神经元为什么没有突起啊? [打印本页]

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:23 标题: [求助]我培养的神经元为什么没有突起啊?

各位老师：我最近在做新生鼠皮层神经元培养，已经培养第7天了，为什么突起还是不明显啊？我用的培养基是Neurobasal＋2%B27＋0.5mmol/L的L-谷氨酰胺＋100U/ml的青链霉素。具体培养过程如下：取出生一天的新生鼠4只，75％酒精消毒1－2分钟，断头取脑，体视显微镜下剥离脑膜，小心剥离皮层，至小烧杯中剪碎成1mm3左右大小的小块，加0.25％胰酶15ml，37度培养箱中消化15分钟，中途拿出吹打几次，用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，1500转离心5分钟，弃上清液，10ml的DMEM完全培养基清洗一次，轻轻吹打2－3次，再次离心（1500转离心5分钟），弃上清液，加入10mlNeurobasal＋2%B27＋0.5mmol/L的L-谷氨酰胺＋100U/ml的青链霉素的全培养基，轻轻吹打10－15次，200目滤网过滤，计数（因计数板当时不是太干净，计数不是太好），接种在培养瓶中（事先0.01％L-多聚赖氨酸包被过夜），3天后半量换液，以后每3天半换一次。培养24小时后，细胞呈圆形，折光性还可以，细胞密度也行。近几天，我看了下，细胞还是圆形，突起不明显，细胞状态也不少太好，个别有要飘起的迹象。以下，是我培养第7天皮层神经元细胞照片（400*）。请各位老师指导下啊，已经培养第7天了，为什么突起还是不明显啊？谢了啊！

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:23

我培养第7天皮层神经元细胞照片（400*）

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-21 16:27

我觉得可能有两个问题：
胰酶消化太过了。原代神经元的话用0.125%的胰酶消化就好了，因为胰酶对神经元的损伤是不可修复性的。
离心的时候1000转就足够了，转数太高了也会影响神经元的活性的。吹打的时候动作也要十分的小心的。
还有我没有看到你的照片呢

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:28

我还请教一下，我上面的操作过程、步骤有没有问题啊？另外取材时间长短是不是也影响突起生长呢？阿糖胞苷是不是也有必要加啊？浓度是多少啊？是不是还缺少其它营养成分呢？谢谢你的解答！

作者: windy+++ 时间: 2012-5-21 16:29

我取的是海马，我觉得你的操作步骤没有什么大的问题啊，但是我没有断头取脑啊，我觉得断头后太血腥了，怪吓人的，我给它冻僵了，但是不能冻死，直接取脑，这样是不是好些，因为取得过程中老鼠是活的，影响比较小吧。再就是要一只一只的做啊，时间长了肯定有影响的。我取了组织后都是先放在人工脑脊液中漂洗，再转移到无血清的培养液中暂时保存，等所有老鼠取完了，再一起吹打消化。呵呵
个人方法，仅供参考啊。

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:29

对了，“人工脑脊液”是什么啊？它的成分是什么啊？我都先暂时放在高糖DMEM中。
个人反思一下，由于不太熟悉，取材时间是有点长了，估计细胞活性受到很大影响，我下次尽量快点。另外，经过与本校做细胞培养的老师交流提醒后，我发现我配制的胰酶可能有问题，我用的是师姐留下的，估计早污染了，虽然高压过了，但毕竟放置时间有点长了，因此，我准备把胰酶重新配一下，用新鲜配制的PBS液配制，并重新过滤下，这一点，我想提醒一下刚涉足细胞培养的新手，包括我自己，配液一定用新鲜配制的双蒸水或者PBS（根据所配置液体的要求选择），然后，尽量自己配，不是不相信别人，而是，对自己负责，毕竟，养细胞的都挺不容易的，尤其是前期准备工作很繁杂。

作者: 66+77 时间: 2012-5-21 16:30

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作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:30

我刚调整下图片大小。以下是我培养第7天皮层神经元细胞照片（400*）

图片附件: 62429864.snap.jpg (2012-5-21 16:30, 20.12 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12201

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:30

麻烦各位老师帮忙分析下啊，神经元没有突起还有其它什么原因或者原代神经元培养要特别注意的地方啊？以备我下次培养时吸取教训啊！谢了啊！

作者: zranqi_1 时间: 2012-5-21 16:31

我之前养的皮层、海马细胞在2天后就贴好了，这次两天还没贴好，我觉得是没有包被好。

作者: 831226 时间: 2012-5-21 16:31

神经元在接种后一天后该是长轴突了，因此不能确定视野中的细胞是神经元还是杂质细胞。
无血清培养基不利于细胞贴壁，可以第一天用含血清的培养基孵育过夜，第二天再换成neurobasal 试试。
时间比较长了，胰酶的浓度应该跟其活性不太成比例了，最好重新配制，不过胰酶可以高压吗？会不会在高压过程中失活？

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:31

我是用0.01％的L-多聚赖氨酸包被的，刚开始贴壁还可以。胰酶我已经重新配制了，用注射滤器过滤除菌，没高压。

作者: kswl870 时间: 2012-5-21 16:33

看你的图片，有些模糊，我的感觉是你的图片里的神经元很少，或是有就是没活性的，应该是神经元可看到细胞核，且周围的光晕很好。我一直做大乳鼠的原代培养，培养基没有你的好，但神经元种的还是很好的。种植的神经元在6小时就可以贴壁，长出突起，24小时后，基本都贴壁了，若漂浮的神经元为活性丧失的，通过换液可以移除。
4只乳鼠的皮层组织，我用的胰酶0.25%，稀释为1：8（Dhank's 液），若乳鼠多了，胰酶可用1：7稀释，事先37度水浴箱预热（无菌操作），保证胰酶的温度为37度。取脑组织是在冰袋上平皿里4度的Dhank's 液中减为碎块的，倒入试管里冰袋上静置，取出上清液（取的干净些），此时离开冰袋，加入胰酶，量在5-6毫升，机械吹打力度要适当，见有浑浊时，立即用全培2-3毫升终止，混匀。静置后，取上清过100目尼龙网，用同样的毫升的Dhank's 液回收两次的上清，离心1000r5分钟，弃去上清，用15全培混匀沉淀细胞。
这是我种的四天的细胞，你可看看

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12202

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:34

你的神经元图片确实不错！挺羡慕的！
我发完贴后，又做了一批，胰酶和多聚赖氨酸重新过滤了下，取材时间也较前缩短，却污染了！真郁闷！
我的分离脑膜、夹取皮层是在解剖显微镜下操作的，由于解剖显微镜由于比较大，只好放在超净台外面，比较危险！之前同样在外面操作、且时间较长，却没有污染，真奇怪！养神经原细胞怎么这么难的呢？
一般取材时间（从断老鼠头到接种到培养瓶）多长时间为好啊？我用了快三个小时，这和神经元无突起不知道有没有关系？

作者: wu11998866 时间: 2012-5-21 16:34

无菌操作很重要，但你的培养基里有双抗，应该不容易污染的。
时间操作久没关系，我第一次种的时候就用了4小时。
说几点吧，看能不能帮你
1无菌取脑：在超净台内，直接剥离脑血管膜，显微眼科镊，可以整片脑膜剥离。
2Dhank's 液的PH值7.0（见你写的过程中，不知道是在什么溶液中剥离脑膜的，若剥离太久，细胞失去内环境液体也会损伤细胞活力的）
3胰酶作用的浓度0.25%（见前我说的稀释）
温度（保证37度，不能超出37度）
时间（加入停留2分钟）
另胰酶使用的时间不能太长，不能反复冻融
4机械的吹打（吹打的试管口要用酒精灯烧圆，不能有割口，会划伤细胞），力度适当，大约在20-30次，见浑浊就用全培终止消化
5多聚铺皿，过夜收起后，可用DMEM或三蒸水清洗一次，再种植细胞。另多聚有使用期限的，过期也会铺皿无效。

别着急，成功一次，你就有种细胞的感觉了

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:34

在你们的帮助下，我神经元总算养出来了！
这是我培养第六天的皮层神经元。我有一个疑问还想请教一下过往的各位老师，我的神经元已经培养快六天了，视野下，仍可见有很多亮点样东西，以细胞聚集处明显（如图红圈内）。不知道是什么东西？我这次种的密度有点大。

图片附件: 82181433.snap.jpg (2012-5-21 16:34, 32.63 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12203

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:37

还有一张，图中圈上的，发亮的，不知是什么东西。请各位老师帮忙解答一下啊！谢了啊！

图片附件: 56729807.snap.jpg (2012-5-21 16:37, 36.75 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12204

作者: KGZ564 时间: 2012-5-21 16:37

1: 注意消化的时间和组织吹打.
2:Neurobasal和B27有好几种,其中Neurobasal有的适合成年的神经组织,有的适合胚胎组织,B27有的用于做神经干细胞培养,有的适应于神经元培养,你的批号选对了吗?

作者: tianmei001 时间: 2012-5-21 16:37 标题: 回复 #18 KGZ564 的帖子

我用的是0.25％的胰酶消化13分钟。我选的B27什么批号我不知道，我们学校有实验室用它做胎鼠神经元培养，我和他们的一样批号，他们神经元养的很好！我想问一下，那聚集的（已在图中红笔圈出）亮点是什么呢？是种植时密度过大造成的吗？

作者: utt0989 时间: 2012-5-21 16:38

个人感觉是没有吹打均匀

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