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标题: [求助]怎样养鼠巨噬细胞系 RAW 246.7 [打印本页]

作者: remenb 时间: 2012-5-22 15:03 标题: [求助]怎样养鼠巨噬细胞系 RAW 246.7

我正在培养鼠巨噬细胞系 RAW 246.7,不知道应该用DMEM还是1640养,而且觉得好难消化下来,请问各位战友有什么好建议的

作者: sunnyB 时间: 2012-5-22 15:04

我是用的DMEM，还不错；胰酶的问题是你没有调PH值，偏碱一点就可以了。

作者: HP007 时间: 2012-5-22 15:38

我现在正在养这种细胞，状态很好的，用的是１６４０，也没什么特殊要求，

作者: whitesheep 时间: 2012-5-22 15:39

我用1640养，胰酶浓度不可以太高，0.025%胰酶+0.2%EDTA。刚开始时不太容易消化，传几代就好消化了。我曾经用0.25%胰酶+0.02%EDTA，把细胞都消化死了。注意不要消化过度，这种细胞还是很好养的。祝你好运！

作者: whitesheep 时间: 2012-5-22 15:49

哦，对了。我也用IMDM养过这种细胞，张得很好，但做流式时发现与1640比他的分化程度出现明显变化，建议你还是用1640吧，ADCC就让用1640。但是1640营养成分低需常换培养液（一天一次），不要当成污染。

作者: sunnyB 时间: 2012-5-22 15:49

个人认为用1640相对比较好。我的经验是开始的时候血清浓度要比较高一点，我曾经用的是50%，结果有95%成活，你可以试验一下的。

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-22 15:51

弃去培养液，PBS冲洗一下。加1-2毫升胰酶(0.025%胰酶+0.2%EDTA)，37度边观察边消化，细胞松动后，加0.5-1毫升10%FCS-1640（中和胰酶）。再加少许PBS，吹打下来。移入小试管中1000rpm,5min。再用PBS洗一次1000rpm,5min。用10%FCS-1640重悬细胞，分瓶

作者: woshituzhu 时间: 2012-5-22 15:51

我养的RAW246.7, 在消化完放入培养瓶内第一天长得很好,有一部都已经伸出伪足了,但不知道怎么的,第二天就开始大片的漂起来,第三天就全部都漂起来了.我用的DMEM(低糖)+10%胎牛血清. 请各位帮帮忙,是不是我的细胞污染了?

作者: 3648755 时间: 2012-5-22 15:51

有没有人做过这个细胞的转染，我每次转染的效率都非常低。

作者: 2541 时间: 2012-5-22 15:51

我用RAW264.7做过稳定转染的细胞株，效果还不错。
瞬转效率相对低一些，但也不会太低。
其实养RAW264.7的关键在于防止其分化成巨噬细胞，一般分化了的细胞状态都不会太好，而且也不会再生长了。
我用的是高糖DMEM+10%的胎牛血清。当然血清质量一定要好。
RAW264.7的传代一定要及时，一般隔天传，最好不要超过两天。传代的方法：弃去血清，直接加入胰酶（0.125%trypsin+0.03%EDTA),不要用PBS洗，这样剩余的血清可以缓解胰酶的消化作用。大约1分半后，将胰酶倒掉，轻轻拍打培养皿底部，可以看见细胞漂起来了。拍打有两个好处：一是可以去掉分化成巨噬细胞的那些细胞，那些细胞通常贴壁比较牢；二是RAW264.7对于机械的吹打比较敏感，可以省去吹打一步，使细胞状态更好。
然后加入一定血清的DMEM,离心，再重悬，计数，按照2.5-5.0*104/ml的密度传代。这样细胞状态通常都比较好。

作者: ending 时间: 2012-5-22 15:52

请问RAW细胞分化成巨噬细胞是什么样子？
RAW本来就是巨噬细胞啊，不懂

作者: wu11998866 时间: 2012-5-22 15:52

我也养这个细胞啊，以后多多帮忙啊，这个RAW264.7巨噬细胞是怎么来的啊

作者: summerxx 时间: 2012-5-22 15:52

Cell Biology

ATCC® Number:  TIB-71™
Price:  $203.00

Designations:  RAW 264.7 Depositors:  WC Raschke
Biosafety Level:
1  Shipped:  frozen
Medium & Serum:  See Propagation
Growth Properties:  adherent
Organism:  Mus musculus (mouse)  Morphology:  monocyte/macrophage

Source:  Tissue: ascites
Cell type: macrophage; Abelson murine leukemia virus transformed
Disease: Abelson murine leukemia virus-induced tumor
Cellular Products:  lysozyme [1207]

Permits/Forms:  In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location.
Related Cell Culture Products

Applications:  Biological response [92560]
transfection host (Roche FuGENE® Transfection Reagents
technology from amaxa)

Receptors:  complement (C3) [1207]

作者: summerxx 时间: 2012-5-22 15:53

Antigen Expression:  H-2d
Strain:  BALB/c
Age:  adult
Gender:  male
Comments:  This line was established from a tumor induced by Abelson murine leukemia virus. They are negative for surface immunoglobulin (sIg-), Ia (Ia-) and Thy-1.2 (Thy-1.2) This line does not secrete detectable virus particles and is negative in the XC plaque formation assay. The cells will pinocytose neutral red and will phagocytose latex beads and zymosan. They are capable of antibody dependent lysis of sheep erythrocytes and tumor cell targets. LPS or PPD treatment for 2 days stimulates lysis of erythrocytes but not tumor cell targets. Unpublished data communicated in Feb. 2007 by Dr Janet W. Hartley, Scientist Emerita, NIAID, indicates the expression of infectious ecotropic MuLV closely related, if not identical, to the Moloney MuLV helper virus used in the original virus inoculum. The cells also express polytropic MuLV, unsurprisingly based on the mouse passage history of the virus stocks.
Propagation:  ATCC complete growth medium: Dulbecco's modified Eagle's medium with 4 mM L-glutamine adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose, 90%; fetal bovine serum, 10%
Temperature: 37.0C
Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%
Subculturing:  Protocol: Subcultures are prepared by scraping.
For a 75 cm2 flask, remove all but 10 ml culture medium (adjust amount accordingly for other culture vessels). Dislodge cells from the flask substrate with a cell scraper; aspirate and add appropriate aliquots of the cell suspension into new culture vessels.

Subcultivation ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:6 is recommended

Medium renewal: Replace or add medium every 2 to 3 days.
Preservation:  Freeze medium: Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO
Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase
Related Products:  Recommended medium (without the additional supplements or serum described under ATCC Medium): ATCC 30-2002
recommended serum: ATCC 30-2020

References:  1135: Ralph P , Nakoinz I . Antibody-dependent killing of erythrocyte and tumor targets by macrophage-related cell lines: enhancement by PPD and LPS. J. Immunol. 119: 950-954, 1977. PubMed: 894031

作者: summerxx 时间: 2012-5-22 15:53

1207: Raschke WC , et al. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell 15: 261-267, 1978. PubMed: 212198
32443: Denlinger LC , et al. Regulation of inducible nitric oxide synthase expression by macrophage purinoreceptors and calcium. J. Biol. Chem. 271: 337-342, 1996. PubMed: 8550583
32466: Hambleton J , et al. Activation of c-Jun N-terminal kinase in bacterial lipopolysaccharide-stimulated macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2774-2778, 1996. PubMed: 8610116
32553: Taylor GA , et al. Identification of anovel GTPase, the inducibly expresed GTPase, that accumulates in response to interferon gamma. J. Biol. Chem. 271: 20399-20405, 1996. PubMed: 8702776
32901: Li YM , et al. Molecular identity and cellular distribution of advanced glycation endproduct receptors: relationship of p60 to OST-48 and p90 to 80K-H membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11047-11052, 1996. PubMed: 8855306
33046: Panneerselvam K , Freeze HH . Mannose enters mammalian cells using a specific transporter that is insensitive to glucose. J. Biol. Chem. 271: 9417-9421, 1996. PubMed: 8621609
33076: Lokuta MA , et al. Mechanisms of murine RANTES chemokine gene induction by newcatle disease virus. J. Biol. Chem. 271: 13731-13738, 1996. PubMed: 8662857
33162: Taylor MF , et al. In vitro efficacy of morpholino-modified antisense oligomers directed against tumor necrosis factor-alpha mRNA. J. Biol. Chem. 271: 17445-17452, 1996. PubMed: 8663413
92560: Standard Practice for Testing for Biological Responses to Particles in Vitro. West Conshohocken, PA: ASTM International; ASTM Standard Test Method F 1903-98R03.

作者: vvmmoy 时间: 2012-5-22 15:53

我就是用细胞刮把细胞刮下来，然后吹吹散就完事了，对细胞的损伤不是很大，再次铺板90%以上都能贴壁存活。

作者: ero11 时间: 2012-5-22 15:54

DMEM 培养基；细胞刮刮细胞。

作者: 04906 时间: 2012-5-22 15:54

鼠巨噬细胞系 RAW 246.7养起来算是挺方便的细胞种类了.生长力较强,传代时容易消化,细胞个体小,相对数目多,生长较快,有利于实验的进行.(当然,也是不好处--不作实验的空当也需每天照顾着)

我基本上是每天都传代,传代后细胞6小时左右可贴壁.
我们实验室的传代方法是:
1.细胞长至70%~80%密度时,需要分瓶传代,将瓶中的培养基倒掉,D-Hhanks液清洗两遍
2.加入约3ml的胰酶(0.1%的浓度,不加EDTA,RAW 246.7细胞很好消化)
3.消化两分钟左右,在镜下观察细胞状态,当视野中有几个漂起的细胞,贴壁的细胞之间分开,变圆时,立即倒掉胰酶,加入适量10%血清的培基(血清一般用的是新生牛血清,培基中DMEM,1640都用过,感觉前者容易让RAW 246.7细胞长成堆,但也要看细胞的性质了)
4.轻轻吹打下细胞,一分为二,最好再在显微镜下观察一下每瓶细胞的多少,之后放入培养箱.(吹打的时候力度不要过猛,应该用培养基把细胞冲下来. andy829210推荐的拍打瓶底的方法我准备试试)

据我所知,鼠巨噬细胞系 RAW 246.7是单核-巨噬系细胞,当长的"过老"时(比如传代不及时)细胞形态发生改变,由圆形/椭圆型变成巨多变型,长出伪足,此时的细胞就不是理想的实验对象了,它对刺激会不敏感.

作者: 101010 时间: 2012-5-22 15:54

我正在培养鼠巨噬细胞系 RAW 246.7,不知道应该用DMEM还是1640养,而且觉得好难消化下来,请问各位战友有什么好建议的

RAW 246.7细胞真的挺好消化的,你的问题看是不是有下面的原因:
1.胰酶的配置:最好用D-Hhanks液,不含钙镁(钙镁降低胰酶的作用),至少也应该用0.1%的浓度,即0.1克胰酶定容至100ml,注意溶解充分(我们实验室通常会在4度放置过夜,第二天过滤除菌)
2.胰酶是否失效:时间过久,长时间放置在37度预热等都可能是其失效.
3.细胞性质是否发生改变:比如分化成巨噬细胞

作者: 气泡 时间: 2012-5-22 15:55

我也是养巨噬细胞，但这个细胞是从师兄传下来的，师兄今年已经毕业了，所以也不知道他这个细胞是怎么来的，我是复苏的这个细胞，养了有一个星期了，可是细胞都长得不太好，都是一团一团的在长，不像各位大侠们发的照片的那种啊，我都要急死了，也不知道应该怎么做，我用的1640，小牛血清，请各位大侠指点一下啊，谢谢了。

作者: skytree 时间: 2012-5-22 15:55

鼠巨噬细胞系 RAW 246.7养起来算是挺方便的细胞种类了.生长力较强,传代时容易消化,细胞个体小,相对数目多,生长较快,有利于实验的进行.(当然,也是不好处--不作实验的空当也需每天照顾着)

我基本上是每天都传代,传代后细胞6小时左右可贴壁.
我们实验室的传代方法是:
1.细胞长至70%~80%密度时,需要分瓶传代,将瓶中的培养基倒掉,D-Hhanks液清洗两遍
2.加入约3ml的胰酶(0.1%的浓度,不加EDTA,RAW 246.7细胞很好消化)
3.消化两分钟左右,在镜下观察细胞状态,当视野中有几个漂起的细胞,贴壁的细胞之间分开,变圆时,立即倒掉胰酶,加入适量10%血清的培基(血清一般用的是新生牛血清,培基中DMEM,1640都用过,感觉前者容易让RAW 246.7细胞长成堆,但也要看细胞的性质了)
4.轻轻吹打下细胞,一分为二,最好再在显微镜下观察一下每瓶细胞的多少,之后放入培养箱.(吹打的时候力度不要过猛,应该用培养基把细胞冲下来. andy829210推荐的拍打瓶底的方法我准备试试)

据我所知,鼠巨噬细胞系 RAW 246.7是单核-巨噬系细胞,当长的"过老"时(比如传代不及时)细胞形态发生改变,由圆形/椭圆型变成巨多变型,长出伪足,此时的细胞就不是理想的实验对象了,它对刺激会不敏感.

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ATCC上的照片

图片附件: 50367775.snap.jpg (2012-5-22 15:55, 58.59 KB) / 该附件被下载次数 5
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