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标题: [求助]请大家帮忙看看我的细胞是不是黑胶虫污染了！ [打印本页]

作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:04 标题: [求助]请大家帮忙看看我的细胞是不是黑胶虫污染了！

各位战友，我的PA317细胞在转染了逆转录病毒质粒经过嘌呤霉素筛选后得到了一个稳定的细胞系，但是最近发现我的细胞培养液里面有很多黑色的小点，大部分在原地运动，有些呈现穿梭运动，但是培养上清仍然是清凉的，没有变混浊。用了双抗和卡那霉素、红霉素后没有什么效果，不知各位战友遇到过这种情况没有？应该如何解决？谢谢了！！现将我的细胞照片帖上来，请大家帮忙看看！

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作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:05

图2 是放大400倍时照片，细胞生长不佳，镜下可见大量的球形结构，内有大量的小黑点，局限于球形结构内做布朗运动，当球形结构破裂后释放进入培养液中，细胞形态发生改变

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作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:05

图3是另一张放大400倍照片，细胞生长不佳，镜下可见大量的黑色小黑点，在局部做布朗运动

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作者: 831226 时间: 2012-5-22 16:06

我也遇到过这种情况，有人说是黑胶虫污染，但究竟什么是黑胶虫目前没有个统一的说法，建议你先换个液，用PBS好好洗下，我的细胞就是这样处理后就好了。

作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:06 标题: 回复 #4 831226 的帖子

我几乎是每天都用PBS洗涤细胞，每次都用洗4遍，洗过之后细胞好了很多，但是过几天后又是老样子，而且细胞生长很慢，不知道你是否还用了什么抗生素没有？

作者: 831226 时间: 2012-5-22 16:07

从你的描述看你的细胞的确是被污染了，我的经验是所谓的黑胶虫抗生素是没有用的，其最大的特点就是细胞不会全部死亡但增殖很慢，如果实验要求不高可以将就用，最好是重新复苏了。

作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:07

我的细胞是转染了逆转录病毒质粒经过1个多月的嘌呤霉素筛选后才得到的珍贵细胞系啊，本来指望它产生逆转录病毒去感染其他的目的细胞建立稳定转染的细胞系呢，结果正准备冻存的时候就发现了这种情况，好郁闷啊！！

作者: hyuu 时间: 2012-5-22 16:07

镜下可见大量的球形结构，内有大量的小黑点，局限于球形结构内做布朗运动
这东西是什么？我得细胞里面也有，非常想知道这是什么？

作者: zhenxin 时间: 2012-5-22 16:08

球形结构，和细胞不在一个层面上，好像长在细胞上面，不知这个到底是什么东西，刚传代时不太明显，也不影响细胞生长，细胞长满了以后这个东西就很明显了，一团一团的。

作者: yychen 时间: 2012-5-22 16:08

在出现这个之前，有没有更换培养基或血清什么的？一直都是你在操作吗？出现前后你的又没有什么变化，细胞培养的地方，卫生条件，还是超净台环境变了？多久出现的现象呢？

作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:09

非常感谢上面各位战友的指点，看来这种情况不止我一个人碰到啊！！我的细胞是从湘雅医学院细胞中心购买的，当时刚刚拿来的时候，细胞里有很少的小黑点，但是在用我自己配制的细胞培基培养后，这种情况就越来越严重了，小黑点越来越多，但是早期并不影响细胞的生长，我特地去请了细胞中心的一位老师来帮忙看细胞，她说国内的细胞都有这种情况，只不过是程度上的差异，所以我当时也就没有管它了。但是早期的时候并没有这种球形结构，到了我转染质粒经过药物筛选后就出现这种球形结构了，现在怎么样也消除不了，我用了头孢噻钠后情况有一点好转，但是头孢噻钠用久了对细胞的生长又产生影响。所以现在是好后悔，不知道哪位战友有什么好办法？请多指导指导！！谢过！！

作者: is2011 时间: 2012-5-22 16:09

显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。

附-血清之生长测试
  材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
6-well TC plate (or 35mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)

  步骤：
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。
2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ ml。
3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。

  4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。
5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静置10 min。
6. 去除固定液，水洗二次。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
8. 去除染液，水洗二次。
9. 以肉眼计数群落数
10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %

比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。订购多量同一批号的优良血清，置于–70℃ 保存之
在《细胞培养中的细节问题〉看到的，希望对大家有用

作者: ALALA 时间: 2012-5-22 16:09

同意楼上观点，换好血清。我们也遇到过这样的问题，开始怀疑污染，把细胞室打扫了一遍，还熏蒸了，用了各种抗生素，没什么用。后来换血清就好了。

作者: bongte 时间: 2012-5-22 16:10

谢谢！我换一批血清看看怎么样!

作者: xueyouzhang 时间: 2012-5-22 16:10 标题: 回复 #14 bongte 的帖子

怎么样，换了血清后细胞长得如何？
而且你原来用的是什么血清？是不是国产的？现在换的是进口的血清吗？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-5-22 16:10

QUOTE:

原帖由 xueyouzhang 于 2012-5-22 16:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
怎么样，换了血清后细胞长得如何？
而且你原来用的是什么血清？是不是国产的？现在换的是进口的血清吗？

同意楼上各位的，建议用PBS洗后，换血清。应该用进口的。

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