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标题: [讨论帖]胃癌细胞培养心得及真菌感染应对方案 [打印本页]

作者: gmjghh 时间: 2012-5-24 19:35 标题: [讨论帖]胃癌细胞培养心得及真菌感染应对方案

本人的一点心得相与大家们共同分享。
本人养胃癌细胞sgc-7901已经半年多了，这半年来，可以说是及其不顺，同门的师哥师姐都说这个细胞很好养，增殖快，传代快，生命力旺盛，不容易感染，然，到我这里似乎就不像他们说的那样，问题接二连三的出现，但我从这一连串的失败中从一个懵懂无知者变成一个动作娴熟的能手，说句实在话还得感谢这批细胞给我带来的宝贵经验。
首先我要说一点：无菌操作
刚一接手细胞时，无菌相关事项早已耳熟能详，但我的第一批细胞在传第二代时不幸夭折，不明原因，总结一下还应该是操作的问题，被感染，虽没做细菌培养，但还应该是被感染致死。一师姐告诉说，她们从不穿隔离衣，戴手套，帽子，口罩，更有甚者还吸着烟进细胞室换液，细胞还是活的好好的，但现在看来根本不可取，无菌概念一定要强，才能保证不被污染。
第二点：营养充足。
复苏细胞后发现细胞状态不太好，本应该3天传代的但细胞就是不长，没办法，等，少则一周，多则半个月，好容易长满了，一传代，状态又不好，如此下去，几经周折。时间浪费，后来经验告知，在进行冻存，消化，传代等等操作前一天，一定要换液，让细胞吃的饱饱的才能经受你的折腾。
最后我说一下真菌感染的问题。
在我们培养第三批细胞的时候，突然被真菌感染了，由于我们的培养室是在医院里，院内感染主要是葡萄球菌和真菌，由于实验室条件简陋，真菌得以传播，前一天看见培养瓶里多了些棉絮状的东西，还不以为然，第二天看后大吃一惊，满视野的树枝状的菌丝，生长及其旺盛，细胞完全被覆盖，心里那个难受，好容易养了9瓶状态不错的细胞，这下又完蛋了。没办法弃之。
仅留下被感染较轻的一瓶，没办法细胞的源头没有了，师姐的货存被我们挖空了，于是死马当活马医，用氟康唑针剂每天3ml加完全培养基2梦ml对其换液，发现真菌居然飘起来了，吸出弃之，居然越来越少，3天后，一看不见一根菌丝，为以防万一，在培养基中加入定量氟康唑，注意调整ph值，ph稍偏碱最适，后来发现ph也是造成细胞不生长的又一原因。
总之，该注意的问题我们都注意的，就没问题，如操作出现的太不注意，出现问题分析起来就不容易。

作者: jujuba 时间: 2012-5-24 19:37

你们实验室做过胃癌的原代培养吗？方法如何？谢谢

作者: bananapeople 时间: 2012-5-24 19:37

原代细胞的培养主要工作是单个癌细胞的发离,有多种分离方法,最常用的是DNA酶,胶原酶和透明质酸酶联合消化肿瘤组织,将细胞分离成单个细胞悬液,然后用15%的胎牛血清1640培养基培养.另处一种方法是我自己创立的:用胰酶消化组织,但是时间必须严格控制好,具体的方法我不在此讲解了

作者: ha111 时间: 2012-5-24 19:38

sgc-7901我也有在养，比较好养。
细胞的无菌操作不能存在任何侥幸心理。能注意的地方一定要注意，刚开始的时候我觉得很烦，总是省掉了一些，可是各种各样的问题都来了，后来学乖了，现在操作的很严格，半年了养的十来株细胞没有任何问题。

作者: yapuyapu 时间: 2012-5-24 19:38

我养的细胞也被真菌污染过,都扔了,以后看来并不一定全部都要扔

作者: zhezhe 时间: 2012-5-24 19:39

学习了。在进行冻存，消化，传代等等操作前一天，一定要换液。第一次听到，有道理。

作者: tieshazhang 时间: 2012-5-24 19:39

从新手到能手是每个研究者的必经之路，能从中思考总结，则决定你日后更大的发展。
细胞污染后，用抗生素救回来虽然是一种可行的方法，但除非是对比较宝贵的细胞，如原代培养的，否则还是不要这样做。因为第一不清楚是否已经完全清楚干净；第二细胞的一些形状甚至遗传背景在感染因子的刺激已经发生变化。
我们用细胞还是要争取用来源清楚的。这就要求我们拿到一株细胞时，复苏，养起来之后，首先就要动存足够的种子。以后在使用时，也要避免一直在体外培养，传代5次左右就要复苏新的了。
希望对你有帮助。

作者: is2011 时间: 2012-5-24 19:39

楼上所言极是。
我也曾考虑过这些问题，很多东西知其然而不知其所以然，虽然我的细胞抗真菌有效，对实验也没出现什么影响，但开始总沉浸在胜利的喜悦中，后来想起，虽然我们肉眼在显微镜下看不出任何破绽，但我们不能肯定他的内部结构所含基因是否发生变化。或相关因素是否发生变化。所以谨记一句话，严格把握操作规程，争取不污染，因为污染后最头疼的事情就是对整个实验室及所有器具的消毒。

作者: is2011 时间: 2012-5-24 19:40

还想请版主谈谈细胞传代5次后更换新细胞的机理，传代次数多了状态就不好了，请问是老化了么？

作者: 黄花菜 时间: 2012-5-24 19:40

你好，能介绍一下在培养液中预防真菌污染的氟康唑浓度是多少吗？
还有如果以污染后排除污染培养基中的氟康唑浓度是多少呢？

作者: u234 时间: 2012-5-24 19:40

无菌观念是很重要的，但养细胞也不需这么严格。事实上，当你只养几瓶细胞的时候，还有时间去应付，但如果是养二三十瓶，加上做其它试验操作，那是应付不过来的，因此还是应该自己去摸索那些无菌操作是需要的，那些则是画蛇添足，这样才能最大限度的节约时间。

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-24 19:41

请问在培养液中预防真菌污染的氟康唑浓度是多少？我看到药店有千分之二的氟康唑针剂卖，你用得是哪种？怎样加到培养基中去？终浓度是多少？亟盼回答，不胜感激！

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