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标题: [求助]MTT试验中测IC50的意义和方法 [打印本页]
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-5-29 13:11     标题: [求助]MTT试验中测IC50的意义和方法



新手最艰难在做MTT，我一开始从设置100umol/L开始10倍稀释设立5个浓度，作出一组数据，量效关系还好，但是老板叫我测一下IC50，不太明白，希望高手给点拨和指点一下。谢谢！
作者: zhezhe    时间: 2012-5-29 13:11


像做抗肿瘤IC50就是对癌细胞的清除率为50%时对应的样品浓度,而如果是清除某种特定物质时就是清除率为50%时对应的样品浓度,关键还是看你用什么做为指标,从而用相应的指标来衡量.方法是以浓度为横坐标,表示方式所对应的数值为纵坐标,通过线性回归得到纵坐标值为50%时对应的横坐标数值,所得到的浓度即为IC50.
作者: zhezhe    时间: 2012-5-29 13:12

你做的什么实验我不太清楚，就以做抗肿瘤为例。那么结果是以抑制率为指标。样品的浓度选择要有一定的梯度，最高浓度样品对应的清除率应高于５０％，同样最低浓度样品对应的清除率也应低于５０％。做图时以浓度为横坐标，清除率为纵坐标，在纵坐标上找到清除率为５０％的点，做横线，找到与曲线相交的点，再向下找到这个点的横坐标对应的数值，得到的浓度就是IC50。当然也可以用回归方程来找IC50，只不过我觉得前者方便些。回归方程用Excel和SPSS都能做出来。做回归方程时要注意线性拟合度，不能太低，我做的时候一般要达到0.99以上，不过具体的界限我也不太清楚。用不同方法求出来的IC50一定会存在差异，这也是正常的，即使是用回归方程采用不同的拟合曲线结果也不同，只要前后方法一致、曲线同所得到的点比较吻合就行了。
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-5-29 13:12

我就是做的抗肿瘤增殖,但是我的药却起到促进增殖的作用
作者: zhezhe    时间: 2012-5-29 13:12

不要灰心，再重新做几次看看，看看是原料的问题还是手法的问题。或是从原料上入手，将原料提纯，或许结果能好一些。我也做过体外抗肿瘤，倒不象你有促进增殖作用，反而是清除率比较低，或者可以试试调整实验方法，做一些体内的指标，应该能有一定的收获。
作者: greenbee    时间: 2012-5-29 13:13


MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

MTT

步骤如下：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔
1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.
继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
作者: greenbee    时间: 2012-5-29 13:13

注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入
计算公式：
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025

有一个公式可供参考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例：
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

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一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显.
作者: TAT    时间: 2012-5-29 13:30

介绍的非常精彩了，对于新手，我还有一个建议。

相信对新手（甚至是老手）而言，MTT结果不稳定是个非常恼火的问题，因此如果老板不反对，可以不用96孔板来做，而用48孔板做，这样消耗的试剂和细胞比较多一些，但是由于体积较大，因此加样时的系统误差就减小了，特别是对于新手而言，可以减少看到复孔中上下起伏不定的OD值的机会，获得比较稳定和具有重复性的实验数据。，
作者: hold住    时间: 2012-5-29 13:30

有些是不是会有雌激素样作用呢
作者: 西子    时间: 2012-5-29 13:31


我前段时间也在做MTT,是在测骨髓基质干细胞诱导成骨成脂过程中的细胞生长情况。用的是96孔板，每空2×103，开始4天，OD值基本集中于0.7-0.9，后来，值陡然减小，基本在0.2-0.3徘徊，而且出来的曲线是锯齿型的，波动很大，请教，这是为什么呢？
作者: daod    时间: 2012-5-29 13:31



QUOTE:
原帖由 西子 于 2012-5-29 13:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我前段时间也在做MTT,是在测骨髓基质干细胞诱导成骨成脂过程中的细胞生长情况。用的是96孔板，每空2×103，开始4天，OD值基本集中于0.7-0.9，后来，值陡然减小，基本在0.2-0.3徘徊，而且出来的曲线是锯齿型的，波动很大，请教，这是为什 ...

是在用MTT做细胞生长曲线吧？是不是细胞贴满了影响生长有死亡的？镜下看看细胞活性
作者: wu11998866    时间: 2012-5-29 13:32


我曾经向SCI（IF2.46）投寄了一篇文章，没有录用。文章中我使用MTT检测细胞增殖情况。 但返回意见说：MTT的检测结果不稳定，建议使用其他方法检测细胞增殖。我现在还是不清楚原因。看了楼上的，感觉有点开窍了。

不过这篇文章为什么在国内的SCI上能发表了啊？还是国外认真，向他们学习！
作者: misswu61    时间: 2012-5-29 13:32


MTT的检测结果不稳定，建议使用其他方法检测细胞增殖。

请问：其他哪些方法检测细胞增殖结果是稳定的呢？
作者: 101010    时间: 2012-5-29 13:32

目前实验室常用的细胞活性测定方法包括MTT法、台盼蓝法、克隆形成法、放射性同位素掺入法等。

MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的formazan为水不溶性的结晶体，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的formazan，故有时重复性略差。另外MTT反应这一步，至少需要3h，不适合于观察某种药物的急性作用。

特点：灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。
作者: 伊莎贝拉    时间: 2012-5-29 13:33

有没有群友用3H-Tdr掺入法做肿瘤细胞株的增殖?不知怎样确定干预药物的浓度,盼作过的群友指导下
作者: u234    时间: 2012-5-29 13:33


做全对照不就行了。3H-Tdr结果比MTT要稳定，但是也要重复多次才能有比较好结果。小心3H的半衰期要10多年，而且具有挥发性。实验要注意防护。
作者: hustwb    时间: 2012-5-29 13:34


用cck8比较好，XTT也比MTT敏感，就是成本高点
作者: woshituzhu    时间: 2012-5-29 13:34


听说CFSE标记,流式检测细胞增殖好
作者: yhz1973    时间: 2012-5-29 13:35

我曾经向SCI（IF2.46）投寄了一篇文章，没有录用。文章中我使用MTT检测细胞增殖情况。 但返回意见说：MTT的检测结果不稳定，建议使用其他方法检测细胞增殖。我现在还是不清楚原因。看了楼上的，感觉有点开窍了。

不过这篇文章为什么在国内的SCI上能发表了啊？还是国外认真，向他们学习！

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不妨应用一下SRB染色法，这是美国国立癌症机构推荐使用的方法
作者: wsll    时间: 2012-5-29 13:35


看了楼上各位的发言，我还是不明白为什么要测IC50，测得对癌细胞的清除率为50%时对应的样品浓度是为了说明什么问题呢？又能说明什么问题呢？
作者: biabiade    时间: 2012-5-29 13:35

如果一种药物对肿瘤细胞体外的杀伤不论在什么浓度都达不到杀伤50%
那么下面的实验还怎么进行呢
这种药物对这个肿瘤细胞系没有体外杀伤能力
但是是否具有放射增敏性呢

在不能计算出ic50的情况下
想看药物对细胞的放射增敏现象
该选择怎样的药物浓度呢

不知道我表述清楚了没有~
作者: fqswdzd    时间: 2012-5-29 13:36

在抗肿瘤药物研究中，MTT实验用于体外测试药物对肿瘤细胞的生长抑制作用，注意，是生长抑制而不是清除率，概念上有质的差别。
作者: fqswdzd    时间: 2012-5-29 13:36

体外药物活性检测，特别是做药物筛选，一定要考虑工作量的大小和实验结果的可靠性，二者都要权衡。MTT和SRB的方法都可使用。从已有文献看，SRB法准确性和可靠性要高于MTT法，但我们只在做实体瘤细胞时使用SRB，对悬浮细胞如HL60时依然会使用MTT，就是权衡的结果。而至于克隆形成实验，虽然是细胞增殖的金标准，但周期太久，工作量巨大，不能用作筛药。
作者: fqswdzd    时间: 2012-5-29 13:37

回到最初群友的问题，100uM如果都没有60%以上的抑制率的话，只能说明该药物细胞毒作用很弱，不能作为细胞毒药物来使用。如果量效关系很好，取抑制率50%时的药物浓度就是该药的IC50。但“我就是做的抗肿瘤增殖,但是我的药却起到促进增殖的作用”，这话是什么意思呢？量效关系好却又促进增殖，呵呵，不能理解了。如果真的明确促进增殖，扔掉，别当抗肿瘤药来用。
作者: fqswdzd    时间: 2012-5-29 13:37

而楼上的问题，如果该药是新生血管生成抑制剂或者酪氨酸激酶抑制剂，那么低细胞毒是正常的。如果想作为细胞毒药物来用，是肯定不可以的。纵然有增敏放疗或化疗的可能，但工作量将相当巨大而失败的可能性也不小。如果一开始就想做增敏效果，那这个结果就太理想了。本身细胞毒低，表明其对身体正常组织的损害也可能很小，造成的副作用小，这正是增敏剂需要具备的特点。因此，取IC20的剂量与化疗联用，也就是其处在细胞亚毒性条件下看其能否对化疗有增敏作用，就可以了。记住，是IC20，即对细胞抑制率达到20%的药物剂量，不能高哦~



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