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标题: [求助]流式细胞结果分析，以及图形探讨 [打印本页]

作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:51 标题: [求助]流式细胞结果分析，以及图形探讨

小弟用流式细胞仪测肿瘤细胞膜耐药蛋白，采用空白对照，结果如下求教高手：
１.对照组

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作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:52

实验组１

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12381

作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:52

实验组２

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12382

作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:52

请教：１.实验组阳性率是否太高（不正常）
　　　２.实验组１和２是否有差别
　　　３.流式峰是否太过于集中，类似正态分布？？
　　　４.相同指标在不同处理组间的流式图形是否大体一致？？

作者: 二丫头466 时间: 2012-5-29 13:53

你这个结果没办法看啊，不论是对照组还是实验组，你怎么没有流式的阴性对照呢？

你把散点图有弄上来看看。

作者: gogo 时间: 2012-5-29 13:53

1. 再次对技术员操作流式表示遗憾。正是因为这种管理办法，长期以来不知道有多少像楼主这样拿到没有任何解释的数据，最后可能变出种种不科学结论的情况！
2. 正是因为操作流式的技术员只是技术员而不是流式专家，理论基础差的缺陷暴露无遗，直接体现在对应用对象的理解基本为零，检测和分析方案僵化。
3. 批判完了说正事。楼主得到的分析方案是错误的，这里面看得出来有特异峰，只不过特异峰没有和背景峰良好分离而已，反映被检测靶点在特异反应群细胞上的表达和低反应细胞相比变化还不够大。由于特异峰分离不良，这个时候应该考虑加上FS或者SS做出PMT1-SS或者PMT1-FS双参数图，根据经验判断应该可以得到明显改善的两群分离效果，这个时候的特异群才谈得上正确的百分比。
4. 即使是没有特异峰，整体峰移也绝不应该使用比例固定门来分析，而是应该使用MFI来衡量靶点表达的变化程度。

作者: 二丫头466 时间: 2012-5-29 13:53

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2012-5-29 13:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1. 再次对技术员操作流式表示遗憾。正是因为这种管理办法，长期以来不知道有多少像楼主这样拿到没有任何解释的数据，最后可能变出种种不科学结论的情况！
2. 正是因为操作流式的技术员只是技术员而不是流式专家，理论基础差 ...

你在哪里看到特异峰了，我甚至都没看出背景在哪里啊，难道说是右侧那个小峰是特异封，左侧大封是背景峰？如果用的是细胞系，我觉得可能性太小，整体封移的可能性比较大，此外，如果是细胞系，FS和SS似乎没有什么效果吧，大家的基本光学性质相当，能看出什么不同么？（请教中
）
第四点说的很对，整体峰移讨论百分比是很奇怪，建议用MFI或者KS曲线分析D-value来讨论.

作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:54

感谢以上几位大哥的指教，小弟用的是细胞系

散点图

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作者: moonlight45 时间: 2012-5-29 13:54

问个可能忽略的问题：对照加了抗体了么？

作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:55

空白对照未加抗体

作者: okhaha 时间: 2012-5-29 13:55

光看图不好说.要阳性%和平均荧光强度值再加统计才好说.看样子两组相差不大.另外对照是正常对照还是isotype?

作者: biabiade 时间: 2012-5-29 13:55

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2012-5-29 13:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
光看图不好说.要阳性%和平均荧光强度值再加统计才好说.看样子两组相差不大.另外对照是正常对照还是isotype?

对照组为空白对照，未加任何抗体

作者: 二丫头466 时间: 2012-5-29 13:56

你如果就展示这几个图是不可以发表的，由于你用了药物处理，因此可能会对背景荧光造成影响，所以每组都应该包括一个对照，因为你没给出对照的图，所以不知道是否做了，还是所有的实验就共用了一个阴性对照，如果都用一个对照应该是不可以的。

你这个最好不要做空白对照，因为特别是贴壁细胞，在消化下来时多少伤害细胞膜，非特异标记会比较明显，因此一定要做同型对照。在这种情况下，我比较赞同前面的意见，那个大峰很可能是背景峰，至于小峰是什么，我还觉得真难说，似乎是有一个群体表达了。

至于群友说的PMT1-SS或者PMT1-FS双参数来分离，我还没太搞懂。从你的细胞来看(散点图)，是典型的细胞系表型，SSC和FSC比较均一，并没有在SSC和FSC上表现出不同，（则会两个指标表示细胞颗粒度盒细胞大小，是细胞本身固有的光学特性，因此细胞系中比较均一，无明显分群，而在外周血中，淋巴细胞，粒细胞和单核细胞仅靠这两个特征就可以清晰的分为3团），如果你能够上几个图讲解一下就好了。

呵呵，其实我本身也不操作流式，也想借机会多学习啊。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-5-29 13:56

个人拙见：试验组2图均可见明显的主峰右侧的“肩峰”。不敢枉自断定它是阳性细胞细胞群体或者是阳性率较高的细胞群体，可以考虑用FL-1/ssc or fsc散点图来看看是否有分群现象，甚至可以通过该散点图作gate反过来看fsc/ssc上细胞群体的聚集现象。由于只有单一荧光，故只能这样分析了。分析方法还是用平均荧光强度来看相对客观！同时需要对照的支持。
但是，个人认为不能通过图中的M1、M2来分析！

作者: pencil菲 时间: 2012-5-29 13:57

个人认为：楼主的实验过程中，荧光抗体可能与细胞产生大量的非特异性结合，导致所有细胞均粘有荧光蛋白，整体峰值右移。楼主可以将细胞放到荧光显微镜下观察一下，不就清楚了？

作者: 社会主义好 时间: 2012-5-29 13:57

请问PMT1-SS PMT1-FS SSC和FSC都是啥意思?那本书能看到讲详细的实验原理阿?

作者: 社会主义好 时间: 2012-5-29 13:57

前面问题弄明白了。

FL-1/ssc or fsc散点图来看看是否有分群现象，甚至可以通过该散点图作gate反过来看fsc/ssc上细胞群体的聚集现象

请问这句话是啥意思啊

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