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标题: [求助]离心转速大时间长对细胞有影响么？ [打印本页]

作者: lgm 时间: 2012-5-30 16:43 标题: [求助]离心转速大时间长对细胞有影响么？

我养的帖壁细胞耐药株，细胞极其娇贵非常不好养，我复苏细胞采用1000r/min,离心10分钟，是不是有点时间长转速太大啊，细胞状态一直非常不好也找不出原因

作者: yapuyapu 时间: 2012-5-30 16:44 标题: 回复 #1 lgm 的帖子

离心时间过长对娇嫩细胞是有影响的！

作者: yapuyapu 时间: 2012-5-30 16:45

速度不大时间过长你可以试一下不离心直接用培养基培养第二天更换培养基

作者: mamamiya 时间: 2012-5-30 16:45

速度还行?? 转子半径不祥,离心力未知...
时间有点长 ...5min试

作者: pencil菲 时间: 2012-5-30 16:46

一般细胞离心都用800转5分钟就可以将大部分细胞离下来了，1000转稍微大了一点，10分钟时间可能长了一点，我建议先用800转离5分钟，如果细胞状态还不好就再缩短时间。
离心时间长了肯定会使细胞状态变差！

作者: lgm 时间: 2012-5-30 16:46

不知道楼主用的离心机是什么型号的，我以前用过比较古老的大的离心机，800r/min 5min就可以，现在用的离心机比较小，一般都用1500r/min 5min。无论怎么样10min，时间是长了些

作者: october7 时间: 2012-5-30 16:46

不离心不可以吗？既然娇嫩，就最好不要离了，胰酶消化好后，直接加培养基培养，你不放心，可以等细胞基本贴壁后换液。

作者: gemei0115 时间: 2012-5-30 16:46

800rpm 5min，如果娇贵的话可以加多点培养液和血清，就是在原10％FBS基础上外加1mlFBS，第二天换液，传代的时候也可以采取相同方法减少对细胞的损伤。

作者: lgm 时间: 2012-5-30 16:47

昨天又试了一管复苏，还是那个贴壁细胞耐药株SGC7901/ADR,离心采用500r 5分钟，今天看还是不行啊，也试着提高把百分之十的FBS提高到百分之十五，细胞还是不行，换液看似帖壁可始终细胞呈黄色小圆点就是不长啊，怎么办？？急！

作者: ququer787 时间: 2012-5-30 16:47

QUOTE:

原帖由 lgm 于 2012-5-30 16:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

昨天又试了一管复苏，还是那个贴壁细胞耐药株SGC7901/ADR,离心采用500r 5分钟，今天看还是不行啊，也试着提高把百分之十的FBS提高到百分之十五，细胞还是不行，换液看似帖壁可始终细胞呈黄色小圆点就是不长啊，怎么办？？急！ ...

那就不离心吧，直接培养了，贴壁后换液了

作者: lgm 时间: 2012-5-30 16:48 标题: 回复 #10 ququer787 的帖子

可是复苏贴壁细胞一般都要离心的,你的水温适宜吗?

作者: 969 时间: 2012-5-30 16:49

昨天又试了一管复苏，还是那个贴壁细胞耐药株SGC7901/ADR,离心采用500r 5分钟，今天看还是不行啊，也试着提高把百分之十的FBS提高到百分之十五，细胞还是不行，换液看似帖壁可始终细胞呈黄色小圆点就是不长啊，怎么办？？急！！！

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多传几代就可能会好点

作者: mamamiya 时间: 2012-5-30 16:49

我平时都用1000RPM，10MIN，
今天离心时用了5MIN，但是肉眼看好象没有细胞沉淀下来所以有继续转了10MIN ，过两天在侃侃长势如何把，我决的是不是5MIN 太短了点而？？

作者: mamamiya 时间: 2012-5-30 16:50

一般情况下，500g（相对离心力）5min就足够了。
但是很多离心机计算相对离心力不方便，特别是国产的简易型非低温非高速离心机，通常就用800~1000rpm离5min是足够把细胞沉淀下来的。
时间再长，转速再高的后果大多是细胞损伤甚至碎裂，不提倡。

作者: qqq111 时间: 2012-5-30 16:50

我们还常用一种不离心复苏细胞的方法：直接把冻存管中的细胞吸至培养瓶中直接培养，5h后待细胞大致贴壁后更换培养基。

作者: tuuu2 时间: 2012-5-30 16:50

冷冻细胞冷冻前的状态就好吗?冷冻降温过程不对也影响细胞的质量。离心首先要知道你所需的离心力是多少克？离心机的离心半径不同，同样转速下离心的效果截然不同，知道离心力算出你使用离心机离这种细胞的转速，同时时间与转速可依细胞的比重大小掌握，比重大的细胞转速低些，时间短点，否则反之。娇贵细胞更要注意这点！

作者: lgm 时间: 2012-5-30 16:51

也试过不离心直接将细胞复苏后直接放入培养瓶加培养基培养，第二天换液全是不贴壁的浮动的死细胞，怎么办啊，就是养不活！

作者: bohe221 时间: 2012-5-30 16:51

建议先直接用培养基培养，隔日在离心传代。我以前也碰到过这种情况，先让它恢复好再传。

作者: ero11 时间: 2012-5-30 16:51

我觉得楼主不能就把问题定格在离心速度上吧，你的培养液的酸碱性、细胞密度或者你的细胞需要添加生长因子等都需要考虑。

作者: zsxan1990 时间: 2012-5-30 16:52

我都是1000rpm 2min。我觉得细胞长得挺好的阿

作者: skytree 时间: 2012-5-30 16:52

我培养细胞瘤细胞系曾经误离过3000转,5分钟,细胞状态仍然不错.况且冻存时加入的DMSO量不是很大,就是不离心去除也不一定会影响细胞的状态.所以细胞状态不好,不一定是离心的问题.同意楼上的意见,并建议,用同批培养液同时培养另外的,比如已复苏的细胞,看是否是培养条件或培养液的问题.

作者: 莲花白 时间: 2012-5-30 16:53

3000R/3min！离心时间不宜长，转速差不多不影响什么的。你在离心前加FBS中和掉胰酶。800都离不下来没细胞还搞什么？！
离心后吹散时吹轻一点，吹几下，确定吹散即可。FBS不用加大量，就保持10％，还是不行就考虑买贴壁因子加进去好了。
信不信由你哦，试验是试出来的！！

作者: zsxan1990 时间: 2012-5-30 16:53

我最近也做了一个293细胞，但是2000r/m 10分钟，细胞也不沉淀。感觉是不是培养基的问题？细胞本身的问题会不会也影响沉淀？
有点迷惑

作者: star#room 时间: 2012-5-30 16:54

我觉得楼主首先要确定的就是复苏的细胞在冻存前的状态是不是很好，还有就是培养液酸碱度是不是合适，再有就是可以查一下文献看看是不是这种细胞需要加入一些特别的生长因子，我以前养细胞也试过不离心多用培养液冲洗几遍冻存管，跟离心的比较没什么大影响！

作者: greenbee 时间: 2012-5-30 16:54

我用的是甘油配制的冻存夜，直接复苏加培养液，不用离心第二天换液就可以了。离心500/5min就可以了呵呵仅供参考

作者: langlang 时间: 2012-5-30 16:54

细胞刚复苏状态是不大好，慢慢观察几天，离心500转/min,5min就可以了，觉得只要细胞离心沉淀下来就达到离心目的了，你说细胞状态不好，也可能是当初冻存就没冻存好。

作者: 泡泡 时间: 2012-5-30 16:54

最主要的原因就是冻存的细胞不合格：甘油做培养基效果要差些，用90%血清+10甘油（含0.15DMSO)比90%培养基的要好，复苏细胞根据细胞种类不同，一般5小时左右换培养基，比过夜或10小时以上细胞存活率要高；再有就是冻存细胞时细胞并非处于对数期，或其它原因大致的状态不佳。如果复苏状态不好，也可以让细胞多挺几天，别动它，也有助于恢复。

上面其他人说的其它原因也可能有，但根据你的提问来看可能不是主要原因。

作者: 泡泡 时间: 2012-5-30 16:55

笔误：0.1%DMSO

作者: 小野花 时间: 2012-5-30 16:56

我有一次复苏细胞后也是不贴壁，那次我是用90%血清+10%DMSO配制的冻存液，而且当时也有很多问题，比如复苏的水温、放入温箱后瓶盖拧得过紧等等。后来我再冻存时用的是20%血清+10%DMSO+70%DMEM的冻存液，复苏时也更加小心，结果就比较好。所以我想建议你：仔细回想一下冻存液的成分是不是不合适？冻存过程是否合理？复苏时一定要快速解冻，水温稍高一点都没有关系，为了让细胞尽快贴壁可以适当增加血清浓度，放入孵箱时注意瓶口的松紧度，我一直觉得拧稍微松点有助于细胞贴壁和生长。祝你好运！

作者: remenb 时间: 2012-5-30 16:56

细胞离心一般最好控制在500g以下，对剪切力敏感的细胞100g，在离心过程中有血清的存在也会保护细胞免受剪切伤害。

细胞状态不好也不要紧，勤观察，多换液（减少细胞有害物积累），一般3－4代总能恢复过来

作者: xue258 时间: 2012-5-30 16:57

怀疑冻存细胞有问题；另外可以试试复苏时，将融化细胞加入培养瓶后，立即加培养基，第二天看贴壁情况换液，如果还是不能贴壁，建议重新找细胞

作者: caihong 时间: 2012-5-30 16:57

我们实验室用的是20%血清+8-10%DMSO+70%DMEM的冻存液，效果不错，当然冻存时速度要慢。复苏时溶解速度一定要快，水温在38-40度，稍高一点点也可以，从冻存管中吸取细胞时动作要轻柔，因为刚刚复苏的细胞比较娇嫩，细胞放入孵箱时注意瓶口的松紧度。细胞复苏长的不好要考虑多方面的原因，不一定是离心的原因，楼主可以参考大家的建议，看看是不是其他原因造成的。

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