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标题: [求助]DC培养新问题：培养基选择，血清添加... [打印本页]

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:35 标题: [求助]DC培养新问题：培养基选择，血清添加...

大家好，我正在养人外周血单核细胞来源的DC，之前作了点预实验，不是很理想，有些问题贴子里没找到，或说法不一，想请教正在养DC的朋友们的经验之谈

1用什么培养基？1640,IMEM，DMEM这几个你们用了哪个效果好，需不需要专门买进口的培养DC的培养基，还是自己实验室配的普通培养基就行。

2培养的时候需要加血清吗？FCS还是人AB的，好像这方面说法不一，请大家说说自己的经验吧

3粉末状的IL-4，GM-csf用什么融解分装最不影响活性？
无血清培养基还是PBS还是别的？我想分装后冻存一部分。

4细胞因子用量
我们这边有人都用20ng/ml养的效果还好，我很惊讶，好像说的都是100－200ng/ml,你们都用多少量呢,效果怎么样？

谢谢各位!

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:35

谢谢
1，你们接种单个核的时候是以什么密度接种，
2，培养器材一般用6孔板还是培养瓶，
3，细胞因子是先加培养基中还是换液时单独用微量枪加，
4 诱导培养DC过程中有什么需要特别注意的地方？
谢谢！

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:36

还有一点，你们用这种方法培养的得率多高？作成熟和不成熟得表型如何？
谢谢！

作者: 101010 时间: 2012-6-8 13:36

1.收集单个核细胞.调节细胞浓度为106/mL,
2.然后在6孔板上贴壁,每孔加2mL,孔板对细胞吸附性好些
33h后吸去悬浮细胞,并用37℃预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，
4.用枪使用不同的枪头分别加入细胞因子
5.主要是熟练操作，无菌观念和规范的操作，一个小的细节能影响全局
DC获得率（％）约为9%
DC纯度（％）约为80%
成熟所需时间7-9天
成熟表形CD83 90%,CD40 40%, HLADR90%,CD80 85%,CD86 85%.

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:37

非常感谢楼上，让我对培养又清晰了很多。
还有几个问题不明白
1用枪补加细胞因子的话不是每次加后都要混匀一下培养基吗，这样不是更影响下面生长的细胞？好像细胞动它越少，它会长的越好。
2你们是几天半换量，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL 吗？每次吸出一毫升培养基又不影响下面逐渐漂浮起来的细胞会不会觉得有难度？
3第几天开始加TNF-α ，促成熟只加这一种细胞因子就够了吗，还是要再加其他一些因子比如IL-6,LPS？

谢谢！

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:37

另外刚看了你回别人的如何配细胞因子的帖子，又想到了一个问题
4，用一般离心EP管的小离心机。装有粉末细胞因子的试剂管离心多少转几分钟?
谢谢！

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:37

高速短暂离心

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:38

我也是做DC和imDC培养的，看了你们的帖子，受益非浅！能否给给你们的电话或邮箱，以便我能和你们交流

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:38

请问GM CSF 50 IL-4 用的是ng还是ug，怎么有的文献是ng有的是ug,而且剂量都不一样。请多指教

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:38

单位统一：ng/ul
ug/l

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:39

还有几个问题不明白
1用枪补加细胞因子的话不是每次加后都要混匀一下培养基吗，这样不是更影响下面生长的细胞？好像细胞动它越少，它会长的越好。
2你们是几天半换量，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL 吗？每次吸出一毫升培养基又不影响下面逐渐漂浮起来的细胞会不会觉得有难度？
3第几天开始加TNF-α ，加几天能成熟，促成熟只加这一种细胞因子就够了吗，还是要再加其他一些因子比如IL-6,LPS？

谢谢！

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:39

1.培养液的更换有半量和全量，细胞因子加到新的培养液中，然后再平均加入孔板或培养瓶中。更换培养液很重要，更有利细胞生长。
2.DC有不同的来源所以一些细节不一样，一般1、3、5、7隔天换，每次都要补充GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, 在收获细胞前一天添加GM CSF 50 ng/ mL, IL-4 10 ng/mL, TNF-α 20 ng/mL ，
3.如果悬浮的活细胞比较多的话，可以考虑收集上清，然后离心，保留这些细胞
4.至于il-6和LPS，各个实验室都有自己的习惯，所以还要看具体的细胞类型

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:40

你好楼上，请问培养成熟和未成熟的树突细胞细胞因子的浓度各是多少，谢谢！！

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:40

我用的是IL-10培养不成熟的树突细胞

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:40

还有细胞因子有的用的是UL/ML，有的ng/ml怎么换算？谢谢

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:41

junhun：再向你请教！如何从大鼠骨髓中分离出DC的前体细胞。能告诉我具体的步骤吗？因为不同文献的方法各不相同，不知道以哪个的为准！

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:41 标题: 回复 #17 zranqi_1 的帖子

您好，您的意思是只要在收集细胞的前一天开始加一次TNF-α 20 ng/mL 第二天就能收集成熟的DCs吗，我最后的目的是想取iDC和mDC，让它们分别与NK共培养，看其对NK的影响。

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:42

您好，再次向您请教。

您的意思是只要在收集细胞的前一天只加一次TNF-α 20 ng/mL 第二天就能收集成熟的DCs，而不用连续加几天吗？我最后的目的是想取iDC和mDC，让它们分别与NK共培养，看其对NK的影响。

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我现在用的是人外周血单核细胞来源得。

谢谢！

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:42

1. iMDC 的诱导方法很多，常用il-10浓度0.2 mg/L
2.GM-csf刺激单核细胞生长，集落增多，il-4促进B细胞的裂解，TNF-α 促进DC的成熟

作者: hulu呼噜 时间: 2012-6-8 13:42

请问有谁做过将分出的单个核细胞诱导为不成熟的CTL 啊?

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:43

junhun：il-4促进B细胞的裂解，那么T细胞怎么剔除？请指教。谢谢！

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:43

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2012-6-8 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
junhun：il-4促进B细胞的裂解，那么T细胞怎么剔除？请指教。谢谢！

培养早期T细胞不贴壁，半量换液时吸走或倒掉。

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:44 标题: 回复 #23 junhun 的帖子

谢谢您的指教，还有个问题，树突细胞什么状态是贴壁，什么时候是悬浮！是成熟还是不成熟时，因为有的文献说半悬浮，半悬浮是什么状态？

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:44

junhun：这是我的操作步骤，请您指教，不明白的问题我都标注出来了！希望您能帮我解答一下，万分感激！！
树突细胞和未成熟数突细胞培养操作步骤
(1) 试剂：细胞培养基RPMI-1640,优等胎牛血清， PBS,细胞因子：rGM-CSF、rIL-4、rIL-10。
(2) 设备：1%明胶包板的6孔板相差显微镜荧光显微镜，FCM
1．取健康wistar大鼠骨髓: 断颈处死小鼠,置75%乙醇浸泡5min,无菌取出股骨,置75%乙醇浸泡3-5min,PBS冲洗，无菌操作下剪开股骨两端,注射针头插入骨髓腔, PBS液冲洗骨髓至苍白。（冲洗多少ml?）收集（多少ml 冲洗液？）骨髓细胞，PBS重悬骨髓细胞，1000rpm/min离心5-10分钟，倾去上清再离心，（这一步是为了去除T细胞吗？）共3遍（有文献是两遍，请问应该几遍？）收集沉淀的骨髓细胞。(分离时用淋巴细胞分离液吗？)
2.含10%cs的完全RPMI1640重悬细胞并调整细胞数至1×106ml,用含GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×106/ml,置于1%明胶包板的6孔板中培养,
3．培养至第5天,收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体,（怎么收集？这是DC吗？）一组继续在原培养基中培养作为对照(IL-4组);另一组在原培养基中加入浓度10ug/L（浓度应该是多少） IL-10(IL-10组);培养至第10-13天,收集细胞(imDC),用于后继实验。隔日半换液（请教半换量时GM-CSF、IL-4、IL-10的剂量，怎么换？吸取上清再加吗？对于悬浮细胞怎么换？要注意什么？）
4．并观察细胞生长状况和形态,每次旧液经离心后收集细胞继续培养,上清留用(做什么用？).
DC的形态学观察用滴管收集培养获得的悬浮生长的细胞于离心管中,调节细胞密度至5×105/ml常规制作扫描电镜标本,观察并摄片。
4.用台盼蓝拒染法测定细胞活力
DC的鉴定：
1.DC形态学的检测：分别用倒置相差显微镜和电镜观察细胞形态(标本怎么采取固定)
2.免疫荧光法观察细胞形态
3.FCM检测imDC和DC的表面标志
4.MLR

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:44 标题: 回复 #25 zranqi_1 的帖子

首先说明一点，养细胞是很难的，用100%的努力，也许只能得到1%的结果。建议你先把一些该注意的东西联系好，最好有一个人能带你做，预实验一定要严格的做。很多东西不是1+1+1的结果，
(1) 试剂：细胞培养基RPMI-1640,优等胎牛血清， PBS,细胞因子：rGM-CSF、rIL-4、tnf、rIL-10。
(2) 设备：1%明胶包板的6孔板相差显微镜荧光显微镜，FCM
1．取健康wistar大鼠骨髓: 断颈处死小鼠,置75%乙醇浸泡5min,无菌取出股骨,置75%乙醇浸泡3-5min,PBS冲洗，无菌操作下剪开股骨两端,注射针头插入骨髓腔, PBS液冲洗骨髓至苍白。（冲洗多少ml?）收集（多少ml 冲洗液？）骨髓细胞，PBS重悬骨髓细胞，1000rpm/min离心5-10分钟，倾去上清再离心，（这一步是为了收集）共3遍，收集沉淀的骨髓细胞。(分离时用淋巴细胞分离液吗？两种方法，都可以，用的话分离的更纯)
2.含10%Fcs的完全RPMI1640重悬细胞并调整细胞数至1-2×106ml,用含GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×106/ml,置于1%明胶包板的6孔板中培养, 隔2日半量换液，吸去部分上清再加入GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基。
3．培养至第5天,收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体,（无菌NS冲洗，收集DC前体细胞，）一组继续在GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基，培养作为对照(tnf组);另一组在原培养基中加入浓度10ug/L（常用il-10浓度0.2 ug/mL）IL-10(IL-10组);培养至第10-13天,收集细胞(imDC),用于后继实验。 4．并观察细胞生长状况和形态,每次旧液经离心后收集细胞继续培养,上清留用(和1640混匀后加回孔板内).
DC的形态学观察用滴管收集培养获得的悬浮生长的细胞于离心管中,调节细胞密度至5×105/ml常规制作扫描电镜标本,观察并摄片。
4.用台盼蓝拒染法测定细胞活力
DC的鉴定：
1.DC形态学的检测：分别用倒置相差显微镜和电镜观察细胞形态(在那做电镜，问那的老师)
2.免疫荧光法观察细胞形态
3.FCM检测imDC和DC的表面标志
4.MLR

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:45

1.一开始细胞数会很多，你要不厌其烦的数细胞，PBS液冲洗骨髓至苍白。（冲洗多少ml?）收集（多少ml 冲洗液？），5ml的注射器，一只大鼠收集到一般的离心管，别过50ml，一定要数细胞 , 初始细胞n×10/最后密度是1-2×106，结果就是你要加的完全1640体积。

2.我养细胞时，过了7天细胞数就明显减少，所以我是控制在7-10天内，把，MTT，MLR，pcr等实验做完，预实验中把你的实验条件下细胞的存活时间摸清，所以13天再做FCM、MLR效果不好说了。
3.找一篇好的参考文献，和一个好老师，你就会好受很多。
4.早期应该叫单核细胞，或DC前体细胞，一般24h处于贴壁状态，2-5d半悬浮（成集落生长的细胞多，集落底部贴着培养板，轻轻晃动，可见集落的摇摆，但不容易离开板，）成熟后Dcs悬浮状态。

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:45

junhun您好。
我想请问一下在开始分离单个核细胞是是否需要：加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5 min，弃上清，再离心。还是直接离心就可以了？
您说的在收集DC的前一天加TNF-a，能得到DC吗？
另外您觉得我的实验在哪天收集DC 和imDC比较好？

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:45

jackyxing未成熟的DC是悬浮生长还是附壁生长？

作者: bohe221 时间: 2012-6-8 13:46

未成熟DC是悬浮的，成熟的DC是半悬浮的。贴壁生长的是巨噬细胞和成纤维细胞。

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:46

我修改了我的预实验如下，您能帮我改改吗？因为下周我将开始预实验，按我的以下的实验操作7-9天能得到我要的细胞吗？谢谢！
1．取健康wistar大鼠骨髓: 断颈处死小鼠,置75%乙醇浸泡5min,无菌取出股骨,置75%乙醇浸泡3-5min,PBS冲洗，无菌操作下剪开股骨两端,5ml注射针头插入骨髓腔, PBS液冲洗骨髓至苍白。收集骨髓细胞，PBS重悬骨髓细胞（约50ml），1000-1500rpm/min离心5-10分钟，弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，倾去上清再离心，共3遍，收集沉淀的骨髓细胞。
2.含10%cs的完全RPMI1640重悬细胞并调整细胞数至1×106ml, 置于1%明胶包板的6孔板中37 ℃、5%CO2培养箱2h,弃上清,用RPMI1640轻轻洗去非贴壁细胞。贴壁细胞每孔加入含GM-CSF(50ng/ml)IL-4(10ng/ml)的RPMI1640培养基调整细胞浓2ml,7 ℃、5%CO2培养. 隔日半换液。
3．培养至第5天,一组继续在原培养基中培养作为对照(IL-4组) 加入TNF-20ng/ml,培养7-9DC细胞;另一组在原培养基中加入浓度10ug/L（浓度应该是多少） IL-10(IL-10组);培养至第7-9天,分别收集细胞(imDC和DC),用于后继实验。隔日半换液。
4．并观察细胞生长状况和形态,
其中还有什么细节请您多多指教！

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:47 标题: 回复 #31 zranqi_1 的帖子

已经很完备了，你可以当我的老师了，注意无菌操作和规范的实验管理，都是你的强项了。
1.杀几只大鼠，多准备些灭菌的PBS，移液管，离心管，酒精泡骨头的时间不能太长，酒精泡之前，别把骨端剪断，
2.5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，充分混匀2-3min，再静置。
3.关于TNf你可以不加，我又看了一些文献，很多人都不用，小鼠用的更多一些；或者收集前一天加入（个人认为TNF作用很大，长时间对细胞没好处）
4.il-10的剂量，10ug/L
5.你要根据你的实际情况决定实验的步骤和进度，一些事情只是原则。

作者: loli 时间: 2012-6-8 13:47

楼上有错误的回答！
未成熟DC是半悬浮的，成熟DC是悬浮的
本人研究DC两年以来还没有见过现象是相反的

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:47

请问junhun
我能用医用灭菌注射用水来融解IL-4,GM-csf，TNF吗？
不知道医用灭菌注射用水能否当3蒸水使用。
谢谢！

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:48

雪山飞鹿：你用的是大鼠的IL-4,GM-csf？

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:48

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2012-6-8 13:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
雪山飞鹿：你用的是大鼠的IL-4,GM-csf？

人的，我作的是人外周血诱导DCs，能用灭菌用水融解因子吗

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:49

能用3蒸水最好，不能用就一定要用灭菌的蒸馏水

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:49

junhun：溶解细胞因子用后怎么保存？谢谢

作者: junhun 时间: 2012-6-8 13:50

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2012-6-8 13:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
junhun：溶解细胞因子用后怎么保存？谢谢

分装后，管口快速过一下火，用封口膜在管口缠一圈，
-20度保存

作者: zranqi_1 时间: 2012-6-8 13:50

如果用Tris-NH4Cl裂解红细胞，浓度、PH各应该是多少！yf1204你的DC养的怎么样了！你按以上GM-CSF、IL-4的浓度培养细胞长的怎么样！你在第几天收集imDC和DC。

作者: 薄荷侠 时间: 2012-6-8 13:50

不知道有没有国产的il-4
GM—CSF TNF－a 国产的效果怎样？
dc 细胞和单核细胞培养冻存怎样？
新手提问

作者: woshituzhu 时间: 2012-6-8 13:50

我也正要诱导培养DC细胞，正在收集资料，由于以前没有养细胞的经验，所以对着资料看感觉到比较茫然，看了以上各位的讨论之后，我受益匪浅，真正体会到了什么才是经验之谈，在此深表感谢，以后实验遇到问题，还会继续向各位请教。

作者: woshituzhu 时间: 2012-6-8 13:51

ACKYXING 你能给我一个你的油箱或电话号码，我用很多问题想想你请教。我急需着方面的资料，但我是高临床的，从来没养过细胞。所以希望你不吝赐教，万分感激！

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临床上将诱导培养的DC细胞回注入人体，如果是培养这种DC，是绝对不可以用牛血清培养基的，最好就用无血清培养基。

作者: woshituzhu 时间: 2012-6-8 13:51

楼上有错误的回答！
未成熟DC是半悬浮的，成熟DC是悬浮的
本人研究DC两年以来还没有见过现象是相反的

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我查阅一些文献，上面说，成熟的DC有两种表型：一种贴壁，不规则形状，伸展粗大树根状突起；另一种非贴壁，呈圆形，胞浆透明，外表有细小毛刺状突起。不知道是否正确。

作者: xue258 时间: 2012-6-8 13:52

我也有同楼上的问题，不知这两种表型有何联系和区别？请教高人

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:52

大家好，我是提出问题的搂住，我目前培养的DC基本成功，形态上可以确定,纯度也很高，但是不能确定是培养出来的是成熟还是不成熟得。

我用的是peprotech公司的因子,先将GM-CSF,IL-4配成浓度均为40ng/mlRPMI1640+10%FBS,抽自己的外周血单个核取帖壁细胞培养，隔天半换量，结果：
1，细胞在培养第三天就部分半悬浮，成簇，高倍镜能见清晰触角长须
2，第六天几乎所有细胞悬浮起来，细胞大部分成簇生长，也有小部分零散生长，几乎不见淋巴细胞和帖壁的成纤维或巨噬细胞，高倍镜能见悬浮细胞伸展出长触须，形态似园似椭圆或不规则。
3，流式测CD1a为85％

请问：
1，DC栽培养过程中会一直成簇生长吗，为什么我的从第2天开始成簇，之后一直成簇
2，悬浮起来的细胞一定是成熟的DC吗，我的细胞为什么悬浮的那么早，差不多第三天开始就部分悬浮了，第6天几乎全部悬浮，而我并没有加促成熟因子（如TNF,IFN等），难道是牛血清的促成熟的原因
3，CD1a是成熟DC还是非成熟DC还是所有DC的表达标志物,成熟和不成熟的CD1a表达有差异吗，
4，我按非成熟培养出来的DC根据悬浮成簇生长，高表达CD1a是不是能怀疑培养出来的DC是成熟DC而非成熟呢

谢谢各位！

作者: is2011 时间: 2012-6-8 13:52

你培养的DC细胞出现的以上现象都是正常的，一般DC培养48h，细胞形状不规则，悬浮细胞增多，呈簇状生长，随着培养时间的延长，悬浮细胞逐渐增多，细胞体积增大，便面毛刺突起明显。
可判定DC细胞的指标有：表面树突状结构；高表达HLA-Ⅱ类分子、共刺激分子及辅助分子；人类DC显著表达CD1a分子；强的T抗原呈递能力，通常用MLR进行评判。

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-6-8 13:53

那么成熟和非成熟的DC主要通过哪些指标来鉴别呢，除了CD83,CD25以及功能上差异，CD1a和悬浮程度能有差异吗

作者: is2011 时间: 2012-6-8 13:53

上述的指标就是鉴定成熟的DC细胞啊，至于CD83,CD25以及功能上差异，我也不是很清楚，还请园内的高手请教。

作者: orangecake 时间: 2012-6-8 13:53

请教各位前辈

1.用Ficllo将单个核细胞分离出来，细胞培养箱孵育2小时后，直接吸弃上清液是不是留下就比较纯了？有文献说到手法筛选法，不知道怎样操作。

2.是不是用IL-10诱导imDCs之前一定要用IL-4呢？能不能从一开始就用GM-CSF + IL-10?

3.我的后续试验还要分出其中一个亚型，那是不是要把细胞洗脱下来？用什么方法比较好？胰酶会不会对细胞功能有影响呢？

有些问题很菜，在园子里没有找到答案，见笑了。

作者: chuntian1983 时间: 2012-6-8 13:54

细胞因子的溶解最好还是用培养基＋血清比较好，因为，血清对细胞因子后保护作用，溶解后，一定要分成小包装冻存，以避免反复冻融。

作者: chuntian1983 时间: 2012-6-8 13:54

你的前两个问题：
1.用Ficllo将单个核细胞分离出来，细胞培养箱孵育2小时后，直接吸弃上清液是不是留下就比较纯了？有文献说到手法筛选法，不知道怎样操作。
答：最好不要“细胞培养箱孵育2小时后，直接吸弃上清液”，可在培养的前2天内，轻轻晃培养板，轻轻吸弃上清夜（含大量淋巴细胞），培养2 小时应该是早了一点，此时大部分细胞完成沉淀和贴壁。

2.是不是用IL-10诱导imDCs之前一定要用IL-4呢？能不能从一开始就用GM-CSF + IL-10?
答：DC的培养培养可以不加IL-4。

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