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标题: [求助]激光共聚焦检测线粒体膜电位 [打印本页]

作者: mickeylin 时间: 2012-6-20 13:41 标题: [求助]激光共聚焦检测线粒体膜电位

激光共聚焦检测线粒体膜电位，线粒体膜电位降低，荧光强度是强还是弱呢？我跟我们科的一个博士对此持相反观点！她认为荧光强度强表明线粒体膜电位低，而我认为荧光强度弱线粒体膜电位降低！请大侠指点！等着救命呢！多谢了！

作者: vivian4123 时间: 2012-6-20 13:41

我用流式检测过，线粒体膜电位降低，荧光强度是弱

作者: dragonkilly 时间: 2012-6-20 13:41

激光共聚焦应该跟那个是一个原理的，我用Rh123染的，你呢？

作者: any333 时间: 2012-6-20 13:42

关注此帖，我更邪门，做的荧光到细胞死了都没有什么变化。奇怪了！

作者: yhz1973 时间: 2012-6-20 13:42

线粒体膜电位升高，rhodamine123为一阳性离子可进入线粒体，通常说的荧光除灭。荧光降低。

作者: any333 时间: 2012-6-20 13:42

线粒体膜电位升高，rhodamine123为一阳性离子可进入线粒体，通常说的荧光除灭。荧光降低。

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请问您说的“线粒体膜电位升高，rhodamine123为一阳性离子可进入线粒体，通常说的荧光除灭。荧光降低。”有什么文献报道支持吗？怎么我查到的都是膜电位降低，罗丹明123荧光强度降低呢？望赐教，谢谢！

作者: wu11998866 时间: 2012-6-20 13:43

我查过以前的帖子,也看了一些相关的文献:我支持LZ的看法,线粒体膜电位降低，荧光强度是减弱.整理一下,和大家共同讨论:
所谓荧光染色,就是染色试剂与目标物质结合而发出荧光进行检测!
线粒体为双膜结构,外膜通透性大于内膜的通透性,内膜中存在的一些载体蛋白与通道可以运输某些物质,质子泵存在于内膜,它将基质内质子泵入外室,从而形成横跨线粒体内膜的线粒体跨膜电位, 跨膜电位内负外正,跨膜电位的存在使一些正电荷荧光燃料rhodamine 123、DiOC6(3)、J C-1 、CMX-ROS 可结合到线粒体基质.
Rh 123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针，容易被有活性的线粒体摄取，没有细胞毒性。Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集而发出绿色荧光.
当细胞凋亡时，线粒体跨膜电位下降(已经证实的,线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转)、线粒体膜的转运能力下降，电负性降低，细胞线粒体积聚Rh123的能力也下降，荧光强度降低.
还有前辈做过凋亡分析,也转述过来:在流式细胞仪上用碘化丙啶（即PI，红色荧光染料）和Rh 123染色来检测。以Rh123荧光强度为横坐标（绿色荧光），以PI荧光强度为纵坐标（红色荧光）作直方图，可见：绿色荧光：正常细胞>坏死>凋亡细胞；红色荧光：坏死细胞>正常细胞＝凋亡细胞。（因为只要细胞膜完整，就可拒染PI，凋亡细胞早期胞膜是完整的，因此像正常细胞一样亦拒染PI。）
因此,我认为应该是和LZ一样的结论.

作者: ffooll 时间: 2012-6-20 13:44

不能说是降低或是升高吧，具体要看你用的什么方法，象JC-I染色，细胞凋亡时线粒体膜电位降低，但是荧光强度改变好像不能简单用强弱来比较吧？

抄一段：JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

给个我们实验室自己做的图，用姜黄素（Cur）处理后细胞凋亡，呈绿色。

图片附件: 54997185.jpg (2012-6-20 13:44, 39.97 KB) / 该附件被下载次数 87
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12737

作者: kulee 时间: 2012-6-20 13:44

呵呵，其实大家有一个问题一直没有搞明白……什么情况下荧光会降低？

以Rh123为例：

做流式的时候，你用 “过量” 的Rh123孵育细胞，直至细胞内线粒体的Rh123吸收达到最大。这个时候显然线粒体膜电位越高，能够吸收的Rh123越多，，也就是进入细胞的Rh123总量越多，流式检测到的Rh123信号越强。这个过程大家应该很容易理解。

在另外一种情况下，Rh123的总量是 “恒定” 的，比如说测定线粒体的膜电位。将一定浓度的Rh123和的线粒体共孵育一段时间后，在荧光分光光度计下可以得到一个稳定的读数（比如说100），这个时候线粒体内外的Rh123达到平衡（比如说内：外＝80:20）。如果我给予线粒体的底物（如NADH）激活线粒体呼吸链，这个时候线粒体膜电位将会升高。结果更多的Rh213进入线粒体内部（比如说内：外＝90:10）。

那么问题来了。从化学的角度来说，如果某个荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的话（这种情况很常见），其发射光有一部分（与激发光重合的部分）会被自己重新吸收，而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。这就是所谓的“荧光淬灭"。换而言之，当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比，而是有点“跟不上”了。

这样我们就好理解了，当线粒体内外的Rh123达到90:10的时候，虽然总量不变，但是进入线粒体内部的Rh123发光的效率会下降，此时的荧光强度将会低于100（比如说98？呵呵）。而无论是共聚焦还是流式，虽然也有荧光淬灭的情况出现，但由于线粒体或者细胞当中总的Rh123的量还是增加的，所以测得的荧光都是增加的。

附上“LED专用红色荧光粉的激发光谱和发射光谱对比”，希望有助于大家理解。

图片附件: 61556859.jpg (2012-6-20 13:44, 35.78 KB) / 该附件被下载次数 27
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12738

作者: vcve 时间: 2012-6-20 13:45

目前的线粒体膜电位染料都是阳离子染料，正常时结合于线粒体膜内侧形成聚合体发红光，膜电位降低时更多游离到胞浆内以单体形式存在发绿光，所以红光减弱而绿光增强，关键看你用什么染料。JC-1的红光减弱比绿光增强的变化明显，所以主要看红光减弱。而mitocapture主要看绿光增强。所以请根据特定染料的文献和使用手册的说明来确定观察的指标。

作者: duoduo 时间: 2012-6-20 13:45

呵呵，其实大家有一个问题一直没有搞明白……什么情况下荧光会降低？

以Rh123为例：

做流式的时候，你用 “过量” 的Rh123孵育细胞，直至细胞内线粒体的Rh123吸收达到最大。这个时候显然线粒体膜电位越高，能够吸收的Rh123越多，，也就是进入细胞的Rh123总量越多，流式检测到的Rh123信号越强。这个过程大家应该很容易理解。

在另外一种情况下，Rh123的总量是 “恒定” 的，比如说测定线粒体的膜电位。将一定浓度的Rh123和的线粒体共孵育一段时间后，在荧光分光光度计下可以得到一个稳定的读数（比如说100），这个时候线粒体内外的Rh123达到平衡（比如说内：外＝80:20）。如果我给予线粒体的底物（如NADH）激活线粒体呼吸链，这个时候线粒体膜电位将会升高。结果更多的Rh213进入线粒体内部（比如说内：外＝90:10）。

那么问题来了。从化学的角度来说，如果某个荧光物质的激发光谱和发射光谱有一部分是重合的话（这种情况很常见），其发射光有一部分（与激发光重合的部分）会被自己重新吸收，而且这种吸收的效益随着该荧光物质的浓度增加而增强。这就是所谓的“荧光淬灭"。换而言之，当荧光物质浓度很高的时候其荧光强度和浓度的增加不成正比，而是有点“跟不上”了。

这样我们就好理解了，当线粒体内外的Rh123达到90:10的时候，虽然总量不变，但是进入线粒体内部的Rh123发光的效率会下降，此时的荧光强度将会低于100（比如说98？呵呵）。而无论是共聚焦还是流式，虽然也有荧光淬灭的情况出现，但由于线粒体或者细胞当中总的Rh123的量还是增加的，所以测得的荧光都是增加的。

附上“LED专用红色荧光粉的激发光谱和发射光谱对比”，希望有助于大家理解。

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请问为什么我看到的RH123都在线粒体上呢？难道是我染的Rh123浓度不够吗？而且随着细胞的凋亡，我并没有看到Rh123的亮度的下降或者荧光弥散到细胞质中，请问这又是什么原因呢？望知道的战友赐教，谢谢！

作者: zzzz 时间: 2012-6-20 13:46

嗯，我一向所接受的理论就是我上面所说的。不过gzgygy网友“聚合体/单体”转换的理论似乎也有一定道理。这种由于分子聚合导致共轭键增加进而使发射光红移的现象其实也是“荧光淬灭”的一种解释。

不过现在我还没有找到权威的说法，请大家暂且当作“百家争鸣”好了。

我所说的80：20之类的比例其实只是为了便于大家理解，真实的分配比例我不清楚，不过应该远远大于这个值（999：1？呵呵！）

作者: dog002 时间: 2012-6-20 13:46

QUOTE:

原帖由 zzzz 于 2012-6-20 13:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

嗯，我一向所接受的理论就是我上面所说的。不过gzgygy网友“聚合体/单体”转换的理论似乎也有一定道理。这种由于分子聚合导致共轭键增加进而使发射光红移的现象其实也是“荧光淬灭”的一种解释。

不过现在我还没有找 ...

我想在这里大家应该明确一个问题，就是Rh123和JC-1的发光机制是不一样，上面战友说的JC-1的发光机理是正确的，但是关于Rh123的却没有什么人可以说清楚，我也一直在关注这个问题，并且从我的实验结果可以看到Rh123确实是定位于线粒体，细胞质里面是没有的，这个现象还是可以理解的因为毕竟Rh123是阳离子探针，但是奇怪的是，当膜电位下降的时候，Rh123会怎么样呢？原则上他应该离开线粒体，也就是说线粒体的发光下降，细胞质里的增多，可是为什么我做了几次实验，都没有看到过呢？我是用共聚焦显微镜看的。还请知道的战友指教！

作者: gemei0115 时间: 2012-6-20 13:47

嗯，我一向所接受的理论就是我上面所说的。不过gzgygy网友“聚合体/单体”转换的理论似乎也有一定道理。这种由于分子聚合导致共轭键增加进而使发射光红移的现象其实也是“荧光淬灭”的一种解释。

不过现在我还没有找到权威的说法，请大家暂且当作“百家争鸣”好了。

我所说的80：20之类的比例其实只是为了便于大家理解，真实的分配比例我不清楚，不过应该远远大于这个值（999：1？呵呵！）

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这至少是大部分线粒体膜电位活性染料的共同特征，是定论来的，多查查文献就清楚了。

JC1和mitocapture我都用过，说明书介绍得也很详细，很清楚，没有什么产生歧义的地方。

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