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标题: [求助]间接免疫荧光与直接免疫荧光染色？ [打印本页]

作者: glass 时间: 2012-6-21 12:58 标题: [求助]间接免疫荧光与直接免疫荧光染色？

各位，我想检测细胞内一蛋白的表达情况，想用直接免疫荧光或间接免疫荧光法检测，不知哪位做过这方面的实验。我做的是细胞，请问这两种方法的优缺点、及选择原则？

作者: bananapeople 时间: 2012-6-21 12:59

如果你做的是细胞骨架，那么就是用直接免疫荧光。如果是一般的蛋白表达，这个要看有没有试剂是直接标记的，如果没有，还是只能考虑间接荧光。直接荧光相对间接荧光可以避免多一些的非特异姓染色，当然步骤也少了些。我做过细胞骨架的直接染色，效果很好。

作者: gmjghh 时间: 2012-6-21 12:59

免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。
①直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光显微镜下观察检查，作出判断。
评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其存在不足就是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
②间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。
评价：本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。
如果你有针对待查抗原一抗（荧光素标记），而且你的待检抗原表达也比较丰富的话，做直接法也未尝不可。不过如果你不具备上述两个条件的话，还是推荐你做间接法。

作者: hold住 时间: 2012-6-21 12:59

还是用间接法吧.或许您根本就买不到直接标记的一抗,就是有也要很长的周期.你还不知道效果怎样,狂贵!不能用于其他实验.间接法是科研常用的方法.是比较实惠的,方便的.

作者: glass 时间: 2012-6-21 13:00

谢谢各热心群友，受益匪浅！
我老板要我从ELISA、免疫组化、及免疫荧光三种方法中选择一种最合适的，所要检测蛋白主要在胞浆表达，是在培养细胞中的。现又不知作何选择，希望高手指点！

作者: 兔唇 时间: 2012-6-21 13:00

用免疫荧光，做得好出图片也很漂亮的。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-6-21 13:01

我建议可以不用荧光就不要荧光，可以考虑做免疫组化。表达方面跟免疫组化差不多，虽然过程比免疫组化简单，但是拍片后做荧光强度的计算就麻烦很多，理论上参数不变可以做荧光强度的统计，但是实际上是很难做到的。此外荧光的片不能保留下来，只能保留相片。一般拍完荧光的片基本就做废了！
当然如果你不需要做统计，只是标记有或无，可以考虑用荧光，的确做出来的图片很好看。

作者: wmp1234 时间: 2012-6-21 13:01

为什么不用WESTERN方法检测呢？

作者: 49888 时间: 2012-6-21 13:01

不用WESTERN方法检测是因为免疫荧光还可以观察该蛋白在细胞的分布以及定位吧！

作者: am10 时间: 2012-6-21 13:02

也考虑过WESTERN，因目标基因最终要在干细胞中表达，干细胞的数量是有限的，担心WESTERN难以出结果。现在基本选定用荧光方法了，谢谢各位支持！

作者: caihong 时间: 2012-6-21 13:02

直接法贵，间接法便宜

作者: BOSS2011 时间: 2012-6-21 13:03

老兄，我做的是鼠乳腺细胞的骨架蛋白CK18和CK14的免疫荧光，可是怎么也做不出来，请你指教一下抗体的定购和试验流程。先谢谢了

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