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标题: [求助]G418筛选预实验 [打印本页]
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:11     标题: [求助]G418筛选预实验



刚刚接触细胞培养,要做稳定转染.看了些资料和帖子,有点晕!想跟大家请教一下.G418筛选预实验是用未转染的细胞做吗?选10-14天内细胞死亡的最小浓度.然后将更高一级别的浓度应用于转染的细胞.是这样吗?希望尽快得到您的指教!万分感谢!
作者: yes4    时间: 2012-6-21 13:12


G418筛选预实验是用未转染的细胞做,选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞.
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:12



QUOTE:
原帖由 yes4 于 2012-6-21 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

G418筛选预实验是用未转染的细胞做,选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞.

看来我理解的还是正确的!
作者: duoduo    时间: 2012-6-21 13:12


取细胞按一定密度接种于24孔板，待细胞生长状态恢复，且细胞密度小于满培养皿单层细胞数的50%时，弃去原培养液，加入含不同浓度G418（200-800μg/ml）的完全培养液，每个浓度设3个平行孔，三天一换液，继续培养2周，观察细胞死亡情况，以高于杀死全部细胞的G418最小浓度的一个梯度为筛选浓度，以筛选浓度的一半为克隆细胞维持培养的浓度。
作者: duoduo    时间: 2012-6-21 13:13

"G418筛选预实验是用未转染的细胞做吗?"

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看来小兄弟你对G418筛选体系还没有理解，G418是一种细胞毒性药物(氨基糖苷类抗生素)，依不同浓度，对细胞有一定的抑制或杀伤作用，而拟转染的质粒上带有G418的药代酶，能降解G418，从而使细胞获得对G418的耐药性。也就是说转染后的细胞可以耐受G418，而未转染成功的细胞不能耐受G418，因而被杀灭或抑制。通过G418筛选体系，使得未转染成功的细胞比例不断减少，转染成功的细胞比例不断增高。
如果G418浓度太高则会杀伤所有的细胞，如果G418浓度太低则没有什么毒性，两种情况都不能起到筛选作用。
G418筛选预实验则是先用未转染的细胞做，选14天内细胞死亡的最小浓度应用于转染的细胞；因为不同的细胞对G418的耐受性也不一样。这样的目的是找一个实验细胞能耐受G418的工作浓度，从而为筛选转染的细胞打下基础，因为这种浓度只能抑制未转染的细胞，而不抑制转染成功的细胞的！从而起到筛选作用。

建议你再多查找一下国内外相关文献，实验动手之前一定要明白其原理，要不然会很盲目！充分的准备可以避免走很多不必要的弯路！
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:13


我还想问一下,第二次筛选要怎么做?
作者: qumm1985    时间: 2012-6-21 13:14


第二次筛选就是将转染好的细胞接种培养后，向培养液中加入G418以杀伤或抑制其中的未转染成功的细胞，因为不管转染效率多么高，都不可能是100%，所以要通过G418筛选体系（或者其他筛选体系）来筛掉那些没有成功转染的细胞，此时加入G418的浓度可以略高于你第一次预实验时摸索出来的“最小有效浓度”，实验中可以再根据细胞生长情况进行浓度的调整！
作者: ero11    时间: 2012-6-21 13:14


G418筛选实验比较麻烦,多花点时间吧
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:15


感谢您的耐心指教!不过我问的第二次筛选是经过第一次筛选以后,已经筛选出一部分转染细胞了,但是因为有些细胞还是会丢失目的基因所以要得到稳定表达的细胞还要进行2-3次筛选!这时候还是用原来预实验的浓度吗?还是要再提高一个浓度?
作者: join    时间: 2012-6-21 13:15


这是你要在荧光显微镜下观察一下，判断一下细胞转染的效率，也就是转染成功的细胞的比例，再根据情况选用或高或低的浓度！转染成功的细胞的比例越高，则加入G418的浓度就可以越低。
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:16


我的质粒上没有荧光标记,要等到筛选完了以后打动物的,那要怎么办呢?
作者: dongdongqiang    时间: 2012-6-21 13:16


可以用免疫细胞化学检测！
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:16


做G418筛选预实验时每个浓度是不是要多弄几个孔?还是一个孔就行了?急盼高手指点!多谢!多谢!
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:17

筛选的培养液是不是要用没有双抗的?还有做稳定转染时必须要用DMEM的培养基吗?
作者: fsdd817    时间: 2012-6-21 13:17


用什么培养基视你培养的细胞特性而定吧 不见得非用DMEM
一般设三个复孔就足以 各浓度3复孔，设正常对照3复孔。
以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度
作者: fsdd817    时间: 2012-6-21 13:18


由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选
作者: gmjghh    时间: 2012-6-21 13:19


我也需要做筛选,在贵宝地受益非浅,有些疑问,借贵宝地一用!
我待筛选的细胞是悬浮细胞,如果每三天换一次含G418的培养基,每次都要离心,持续2周,而且是用24板养,细胞不是很容易被污染吗?
希望高手指点一下!非常感谢!
作者: 911    时间: 2012-6-21 13:19


我也想请教下作筛选预实验时，比如24孔板每孔应该铺板多少细胞，而且G418何时加入呢，因为看了些文献，G418并不是杀细胞剂，只是抑制蛋白质合成，阻止细胞分裂，所以比较困惑这个细胞密度和加药时机的问题
作者: 3648755    时间: 2012-6-21 13:20

我以前在看的是每孔1000个细胞,因为要给细胞足够的生长空间,但是什么时候加药就不太清楚了,希望高手指点啊!
作者: zhezhe    时间: 2012-6-21 13:20


每种细胞的生长状态和速度不同，在一些细节处理上可能也不同.我的是这样做的：

1、G418筛选实验：
转染293细胞，生长较快，所以在96孔板中加入100ul细胞（2000／ml)，第二天就加入G418,从0,100,200。。。1000ug/ml，复3孔。每天观察。
前几天，低浓度的孔中细胞生长，中浓度的细胞生长缓慢，高尝浓度的不长，稀稀拉拉。约一周左右，中浓度的孔中出现死细胞，低浓度的死细胞较少，未加G418的孔长得很密。 14天时，观察细胞全部死亡的最低浓度孔，在500ug/ml，做稳定转染时选用的600ug/ml。

2、稳定转染
24孔板，细胞密度也较小，转染后第二天1：10稀释传代，设立空白细胞对照组，第三天加G418（600ug/ml)。耐心等待2周，前一周细胞死亡较少，后一周死细胞较多，可3天换液，待对照组里的细胞全部死亡，就可以开始挑单克隆了。
作者: yhz1973    时间: 2012-6-21 13:20

取细胞按一定密度接种于24孔板，待细胞生长状态恢复，且细胞密度小于满培养皿单层细胞数的50%时，弃去原培养液，加入含不同浓度G418（200-800μg/ml）的完全培养液，每个浓度设3个平行孔，三天一换液，继续培养2周，观察细胞死亡情况，以高于杀死全部细胞的G418最小浓度的一个梯度为筛选浓度，以筛选浓度的一半为克隆细胞维持培养的浓度。

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