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标题: [求助]G418筛选细胞后的抗性克隆如何大量扩增 [打印本页]

作者: xingyi08 时间: 2012-6-28 11:12 标题: [求助]G418筛选细胞后的抗性克隆如何大量扩增

各位师兄师姐好,我构建了真核表达载体用脂质体转染宫颈癌细胞后,是瞬时转染的,需要用G418筛选稳定细胞株,有了抗性克隆后如何让它大量扩增呢?我筛的细胞有了克隆后死活不长了真急死人了,希望各位大侠多多指教,谢谢

作者: nn255 时间: 2012-6-28 11:12

获得抗性克隆后应该适当繁殖扩增冻存再进行单克隆化的操作。具体操作如果此时抗性克隆生长在96孔板中，待克隆长至一定大后，可先转入24孔板一个孔内，然后依次6孔板，细胞瓶逐级放大，效果会比较好。还有因为较小的抗性克隆比较脆弱，所以消化传代放大的时候操作一定要轻柔，刚转过来可以先不加抗性，待细胞贴壁后24小时再补加上抗性。另外，可以留一些细胞生长过的培养基再培养，因为毕竟是它熟悉的环境，有细胞因子什么的，只要保证营养充足，细胞容易适应。

先想起这么多。多多交流！

作者: nn255 时间: 2012-6-28 11:14

在24孔板筛的转至6孔板荧光消失是正常现象啊，因为你此时的抗性克隆肯定是多克隆，生长时野生型的有优势，或者说已转入的质粒由于整合在细胞染色体上的位置不合适也会外排的。

至于换液的问题，在筛选初期细胞大量死亡的时候肯定要及时换液，因为死细胞的内溶物对活细胞是有影响的。这时换掉的培养基是不能用的。但后期，没有细胞大量死亡时培养细胞时间也不长，或者说细胞长的很慢对培养基的营养消耗较少，这时扩大培养就可以适当加入旧培养基，也就能达到上述所说的目的了。

多多交流！

作者: xingyi08 时间: 2012-6-28 11:14

谢谢楼上的解答,那荧光消失是否就意味着我筛的细胞已经突变了,已经不是我想要的细胞了,那我是不是还的重新筛选呢?

作者: S6044 时间: 2012-6-28 11:16

本人最近也在做这方面的工作，刚好沟通一下，请问你用的是哪种转染试剂？感觉效果怎么样？有没有出现转染之后第二天就有大量细胞死亡呢？我现在刚挑完筛选克隆，很头疼的是克隆在一边长一边死。

作者: windy+++ 时间: 2012-6-28 11:16

我用的是LipofectamineTM 2000,INVITROGEN公司的,感觉效果还行,只有一次在孔版转时第二天死了很多,别的次都挺好的,你的克隆是挑出来的还是传代的?

作者: windy+++ 时间: 2012-6-28 11:18

你的克隆是如何挑的呢?

作者: 66小飞侠 时间: 2012-6-28 11:18

You shouldn't scale up cells immediately once upon the positive cell clones emerge in medium with drugs if you are planning to establish stable cell line. You need to isolate your cell clones then screen to acquire clones expressing target protein.

作者: vera+ 时间: 2012-6-28 11:19

各位群友们,好!我最近也作细胞转染,用的是G418筛选
但是我在确定G418最低筛选浓度时遇到了一点问题,请各位战友指点
我用的是未转染的肿瘤细胞,24孔板,1000Cell／ml每孔，用药浓度分别是100μg/ml，200μg/ml,300μg/ml,400μg/ml,500μg/ml,............1100μg/ml.但是我发现在加药第四天后我的细胞除了100μg/ml那组还有少量细胞,其他孔已经全死了
而未加药的那组细胞生长良好
所以我想请教各位战友,是不是我理解错误,确定筛选浓度到底是用未转染的细胞还是用已经转染好的含有抗性的细胞
如果我没有理解错,我的遇到这种情况应该怎么办

作者: windy+++ 时间: 2012-6-28 11:19

我是用未转染细胞确定的筛选浓度,我也用过你说的稀释法筛细胞结果细胞也是死的不行,后来我在24孔板张到80 percent 汇合时筛的,多交流

作者: xingyi08 时间: 2012-6-28 11:19

请问如何isolate your cell clones 呢?

作者: ha111 时间: 2012-6-28 11:21

You can use pipette to pick up clones then transfer to TC plate or isolate them to one cell/well in 96-well plate by limited dilution. You can easily find the detailed protocals in many materials.

作者: join 时间: 2012-6-28 11:22

我用的也是你说的那个转染试剂，资料上说那是lipofectin的升级产品，不过我做的时候两种试剂都做了，结果发现2000的效果不如lipofectin。但总体上来说效果都不是很好，我转过两种细胞系，一种直接没有克隆存活。另一种G418筛选后（中间出了点问题所以时间长了些，约20天）2000每空只有几个克隆，lipofectin多一些能有十几个克隆甚至更多。我现在已经挑完克隆：具体方法就是用蘸有胰蛋白酶的无菌小滤纸把小克隆转移到新的培养板上。不知道是封闭的基因的问题还是其他问题，我的克隆一直活性不好，分裂很慢。
还有一个问题需要交流一下：你有没有觉得质粒的纯度和转染效果关系很大呢？我感觉是关系很大。我转过两种质粒，一种260/280刚好1.80，另一种好像1.87，结果前一种的克隆明显多于后者。
多多交流！

作者: cj_mondy 时间: 2012-6-28 11:45

各位战友,我想请教个问题,如果基因对细胞有促进凋亡的作用,转染后细胞不全死光了!而且原本转染后,细胞的代谢负担就很大,分裂几很慢!这样怎么能培养出阳性克隆呢

作者: xingyi08 时间: 2012-6-28 11:46

我用的质粒是从公司给提的,目前还没遇到你说的情况,我自己认为应该是和质粒的纯度有关了,杂质RNA会影响转染效果的

作者: xingyi08 时间: 2012-6-28 11:46

楼上，转染效率又不是100 PERCENT的,应该有细胞存活的

作者: ROSE李 时间: 2012-6-28 11:47

再跟各位战友交流一下，你们筛选完成后，成活的克隆在G418维持剂量的作用下是否仍有死亡发生呢？我发现我的实验组和阴性对照组都有筛选过的克隆后来又发生死亡的现象存在？这是什么原因呢？会不会真有质粒丢失的情况存在呢？多多交流。

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