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标题: [讨论帖]PC12细胞培养、指标检测及相应图片总结专题 [打印本页]

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:44 标题: [讨论帖]PC12细胞培养、指标检测及相应图片总结专题

有关PC12细胞的相关研究

PC12介绍： PC12细胞株源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，是经辐射大鼠肾上腺髓质瘤而移植出的一种肿瘤细胞，经过连续单层培养获得。其胞体中含有大量嗜铬颗粒，富含多巴胺受体及合成，分解所需的各种酶类（包括TH，DG及MAO等）。PC12细胞上除有TrkB受体和P75LNTR外，还能表达两类钙通道：L型和N型，同时具有两类敏感型钙池：caffeine敏感型和IP敏感型。在无血清或低血清条件下培养PC12细胞，可导致其大量死亡，主要表现为凋亡。在有适当浓度神经生长因子（NGF）存在的条件下，其胞体可以生长出突起，类似神经元的轴突，分化成交感神经元样细胞，在形态，生理，及生化功能等方面更接近于神经元，被广泛应用于神经元死亡方式及毒性损害的研究。

PC12细胞的培养一般PC12细胞接种在含5％胎牛血清，5～10％马血清，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的DMEM培养基中（pH7.2），37℃，5%CO2温育。细胞接种后每2～3d换液1次，90％融合时转种到6孔培养板中，接种密度为5×105/ml，温育48h后作为实验细胞。

以下是本人实验过程中留取的PC12经NGF诱导前后的图片，欢迎赐教讨论，谢谢！

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:45

MTT原理：
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

MTT步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:45

一点说明：
1、目前实验尚在进行中，相关检测过程和图片会陆续上传给战友。
2、所有图片，均为本人原创，绝无半点转贴。
3、发帖目的明确：本着“人人为我，我为人人”的宗旨，希望对各位战友有一点点的帮助，渴望战友多多给与建议和指教，希望版主加点小分，呵呵。
4、原先加密贴已取消加密，希望更多的战友得到帮助。
5、欢迎各位战友就PC12细胞的培养、干预及指标检测等各方面在此板块进行讨论，有各位版主高手相助，任何困难疑惑，我们必将迎刃而解！
6、最后祝正在和将要实验的战友，一帆风顺！

作者: pencil菲 时间: 2012-6-28 14:46

谢谢楼主的奉献,我正学着养这个细胞,不过情况很糟糕,以后会经常麻烦你了.先谢谢你!

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:49

不用客气，我也是在边摸索，便进步的。

在这个板块，有关PC12的问题，有各位版主的支持，肯定会顺利的解决你所提出的所有问题。祝：实验顺利。

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:50

PC12干预后LDH检测试管颜色变化并附南京建成LDH试剂盒说明书。

图片附件: 92708812.snap.jpg (2012-6-28 14:50, 49.55 KB) / 该附件被下载次数 47
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12905

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:51

南京建成LDH试剂盒说明书（2）

图片附件: 23614805.snap.jpg (2012-6-28 14:51, 43.25 KB) / 该附件被下载次数 37
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12906

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:51

南京建成LDH试剂盒说明书（3）

图片附件: 47094213.snap.jpg (2012-6-28 14:51, 45.55 KB) / 该附件被下载次数 43
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12907

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:52

有关上传LDH试剂盒说明书的一点说明：

1、本人预作LDH检测前，查遍网络、期刊，未找到详细说明，许多书籍所写原理方法等不够详细，也不尽相同，使本人实验前非常困惑，未避免各位战友再遇类似情形，故上传此说明书。

2、因为手头只有南京建成LDH检测试剂盒一份，没有电子版，且无时间打印整理给大家，只好暂且排成照片，供大家参考。

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:52

加入NaOH前后变化，左侧为加NaOH前，右侧为后。原理详见说明。

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:53

加入NaOH后室温静置3分钟，两溶液对比：左为测定空白管，右为测定管。原理详见说明。（因背光原因，可能图象不够清晰，见谅。）
440nm，蒸馏水调零，1cm光径，测各管吸光度

图片附件: 26793307.snap.jpg (2012-6-28 14:53, 45.07 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12908

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:54

继续上传本人曾经做过的有关PC12细胞检测的精彩图片（所有图片均属原创）！
1、PC12细胞骨架

作者: 研究僧112 时间: 2012-6-28 14:58

图片是用激光共聚焦采集的，在那看到的片子非常清晰，BMP格式，可到了我的电脑上效果就差了。

另外，为了上传，所有图片都经裁减转换格式jpg并减少像素才能符合300K的要求，所以效果更差些。请各位战友将电脑屏幕的对比度和亮度调到最大，效果会好些。

作者: chenshaomei 时间: 2012-6-28 17:07

怎么看不到细胞图片呢？楼主多上点照片啊。我要用这个细胞做神经特异性启动子的功能验证，但是这个细胞有分化和未分化两种，我不清楚到底该用哪一种，查到的资料上也没有提到，只说了用PC12细胞。还望赐教！

PS：若能加您Q更方便的讨论问题就更好了(*^__^*) 嘻嘻……
我Q584070990~~~~~~

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