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标题: [求助]如何配制0.2％的II型胶原酶 [打印本页]

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:25 标题: [求助]如何配制0.2％的II型胶原酶

小弟最近要培养胎鼠成骨细胞，联系了几家试剂公司后发现没有卖0.2％II型胶原酶的，都说要自己配，今天货刚到，是100mg装，300单位/mg可是我又不知道该怎么配，请大家帮帮忙。急啊！

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:25

0.2％=0.2g/100ml, 你的是100mg=0.1g，所以溶到50mlPBS或Dhanks或培养液中都行．
换算成单位的话，是100*300/50ml=600单位/ml. 这个浓度还不错，消化力相当强.

作者: bananapeople 时间: 2012-6-30 10:26

记得用多少配多少，现用现配

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:26

一瓶就只有100mg，配时当然都倒进去了，难道只能用几次吗？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:27

一瓶就只有100mg，配时当然都倒进去了，难道只能用几次吗？

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一共就50ml，也用不了几次就没了.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:27

那配好后要是一直没用，可以放多久？放在2－8度的冰箱吗？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:27

QUOTE:

原帖由 9900 于 2012-6-30 10:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那配好后要是一直没用，可以放多久？放在2－8度的冰箱吗？

2－8度的冰箱的话最好别超过1m.
不行就分装成5ml一支，冻到－２０度或-80度.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:29

能不能整瓶都冻到－20度？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:30

能不能整瓶都冻到－20度？

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分装的好处是，每次用多少，融多少.
酶类反复冻融会破坏活性.
如果你能保证整瓶一口气用完，整瓶冻也行.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:30

用D-pbs液配可以吗?
D-pbs和pbs在培养细胞上有什么区别，应该怎么用？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:32

用D-pbs液配可以吗?
D-pbs和pbs在培养细胞上有什么区别，应该怎么用？

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D-PBS更好，D的意思是不含钙镁离子. 最适合用来配消化液.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:32

D-PBS更好，D的意思是不含钙镁离子. 最适合用来配消化液.

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那在培养细胞过程中全部用D-PBS取代PBS行嘛？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:33

那在培养细胞过程中全部用D-PBS取代PBS行嘛？

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没问题．我一直用D-PBS，１０年啦.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:33

QUOTE:

原帖由 sunnyB 于 2012-6-30 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那在培养细胞过程中全部用D-PBS取代PBS行嘛？

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没问题．我一直用D-PBS，１０年啦.

噢，明白了。
sunnyB战友，你培养过成骨细胞嘛？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:35

５、6年前养过. 你要做什么实验哪，说说听听，现在用这个方法做成骨细胞的人很少啊. 你的实验有特殊要求吗?

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:35

QUOTE:

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５、6年前养过. 你要做什么实验哪，说说听听，现在用这个方法做成骨细胞的人很少啊. 你的实验有特殊要求吗?

是药物实验，异烟肼和利福平对成骨细胞的影响，我想先用胎鼠的头盖骨做。你指的这个方法是什么

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:36

要进行碱性磷酸酶的钙钴法染色，钙化结节计数（茜素红染色），MTT实验，考马斯亮兰法测定碱性磷酸酶含量。

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:36

是药物实验，异烟肼和利福平对成骨细胞的影响，我想先用胎鼠的头盖骨做。你指的这个方法是什么

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用胎鼠的头盖骨做的话比较麻烦，成纤维混杂很多，不如用骨髓基质细胞加诱导液．或者直接用MC3T3细胞系.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:37

我看很多人都是这么做的，如果直接用MC3T3做的话毕业论文内容可能不够，如果用骨髓基质细胞加诱导液的话不是还得培养骨髓基质细胞嘛，那不是更麻烦？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:39

QUOTE:

原帖由 9900 于 2012-6-30 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我看很多人都是这么做的，如果直接用MC3T3做的话毕业论文内容可能不够，如果用骨髓基质细胞加诱导液的话不是还得培养骨髓基质细胞嘛，那不是更麻烦？ ...

说的也是．反正试剂都准备好了．做做看吧.
不过骨髓基质细胞很好养的.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:40

QUOTE:

原帖由 sunnyB 于 2012-6-30 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

说的也是．反正试剂都准备好了．做做看吧.
不过骨髓基质细胞很好养的.

骨髓基质细胞好诱导嘛？要多久？纯度怎么样？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:40

骨髓基质细胞好诱导嘛？要多久？纯度怎么样？

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诱导不难，纯度不好说．不过要用好多试剂，也不太好买. 先那胎鼠试试吧.

作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:41

诱导不难，纯度不好说．不过要用好多试剂，也不太好买. 先那胎鼠试试吧.

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我还想问下，要是做细胞的药物实验，看看在什么浓度范围内药物对成骨细胞没有产生明显的抑制作用，要做哪些方面的数据比较？比如细胞数、ALP含量等。

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:41

1 你前面提到的那些都可以做做．流式测测细胞周期也不错．mtt要做也可以，不过我觉得mtt在说明细胞活力方面缺乏说服力，不如细胞生长曲线+细胞周期，经费足的话，买个BrdU试剂盒测细胞活力更有说服力，照片也漂亮（见图）.
2 当然这些是远远不够的. 还应该作些成骨细胞分泌产物的免疫组化，ＰＣＲ，western之类的较好．比如BMP，ＴＧＦ，胶原蛋白等表达的变化.
3 条件允许还可以做个电镜，看看细胞内部的变化.

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作者: 9900 时间: 2012-6-30 10:42

我准备做一下几方面的比较:
1.细胞形态的观察，用相差显微镜
2.细胞增殖的测定，用MTT
3.ALP活性测定，用考马斯亮兰法
4.矿化功能测定，用茜素红染色。
你看够嘛？

作者: sunnyB 时间: 2012-6-30 10:43

我准备做一下几方面的比较:
1.细胞形态的观察，用相差显微镜
2.细胞增殖的测定，用MTT
3.ALP活性测定，用考马斯亮兰法
4.矿化功能测定，用茜素红染色。
你看够嘛？

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少了点．如果仅仅是作为活力检测勉强够.

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