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标题: [求助]淋巴细胞分离 [打印本页]

作者: 9900 时间: 2012-7-3 10:40 标题: [求助]淋巴细胞分离

请问：
我正在分离淋巴细胞，用的是PBS稀释血液，加淋巴细胞分离液后也可见分层，吸出淋巴细胞层离心沉淀时为什么总是沉淀不下来，3000转10分钟。而且沉淀了许多血小板或是红细胞，这是什么原因呢？请教各位老师。淋分液是新的。

作者: caihong 时间: 2012-7-3 10:42

你说"离心沉淀时为什么总是沉淀不下来...",为何却又"沉淀了许多血小板或是红细胞..."?你指的是什么沉淀不下来？有没镜下观察是否有淋巴细胞？细胞是否完整？根据你不是很清晰的描述，建议从以下方面找找原因：（1）分离操作是否严格遵循所使用的分离液说明书所推荐的步骤（使用前先是否要先将分离液室温放置一段时间？血液如何稀释？淋巴细胞分离液的比例及离心力和离心时间等）。（2）吸取淋巴细胞分离层时是否过多的吸取了淋巴细胞分离液？漂洗时所加的洗涤液量是否又过少？如此在较低的离心条件下会影响到淋巴细胞的沉积，这样在每次洗涤后弃去分离液的过程中也同时丢失了淋巴细胞。（3）血液量是否过少？血液离体时间是否过长？是否已有溶血等，使得血液中的淋巴细胞比例下降，导致分离效果不佳。（4）淋巴细胞分离液质量是否有问题。可换瓶试试。
一般如果使用新鲜血液标本，严格按照分离液说明书推荐步骤来操作，分离淋巴细胞不是件很难的事。祝好运！

作者: redbutterfly 时间: 2012-7-3 10:42

您提问的问题我一一做答：
我说的沉淀是，离心管底有好多可能是血小板或红细胞但是淋巴细胞很少，因为上清液是混浊的，上清液可见淋巴细胞，细胞是完整的。
操作是基本按照说明书操作的，分离液室温放置一段时间，血液是用PBS稀释的，淋巴细胞分离液和稀释血液的比例是１：１，离心是２０００转１５分钟。
您说的第二个问题，我在操作上有问题，我是直接吸取淋巴细胞离心的，并没有放到洗涤液中，而是沈淀后再洗涤。
血液量是不多，而且放在４度冷藏过。
淋巴细胞分离液质量问题不清楚，因为以前买过同样的，效果很好。
看来我在操作上还存在许多问题，还请您继续多多指教！同时对您的关注表示感谢！
我是初做实验，都是问的师姐，还请老师们多指导

作者: sunnyB 时间: 2012-7-3 10:43

这个问题很有趣, 估计见过的人不多。我有幸是其中之一。
细胞离心之后不能沉淀，是因为之前的细胞悬液中有破碎细胞释放的DNA形成网索把细胞包绕所至。这说明你之前在４度放的血液有问题。
建议重新取血做一次试试。

作者: 园丁## 时间: 2012-7-3 10:43

请问：
我正在分离淋巴细胞，用的是PBS稀释血液，加淋巴细胞分离液后也可见分层，吸出淋巴细胞层离心沉淀时为什么总是沉淀不下来，3000转10分钟。而且沉淀了许多血小板或是红细胞，这是什么原因呢？请教各位老师。淋分液是新的。

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吸出来的细胞离心前是否混匀了？

作者: baidukk 时间: 2012-7-3 10:44

首先是lz的问题：
吸出淋巴细胞层离心沉淀时为什么总是沉淀不下来，3000转10分钟。而且沉淀了许多血小板或是红细胞，
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随后是lz的回答：
您说的第二个问题，我在操作上有问题，我是直接吸取淋巴细胞离心的，并没有放到洗涤液中，而是沈淀后再洗涤。
血液量是不多，而且放在４度冷藏过。
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看看操作手册：

Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
撰写　金伯泉

作者: baidukk 时间: 2012-7-3 10:44

4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
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从上面的情况分析，lz 在吸取界面层的单个核细胞（应该是已淋巴细胞为主），放入另外一个试管中后，就直接离心了，而没有加入5倍以上体积的Hank's液或者RPMI1640，混匀后离心。如果没有加入液体稀释吸取的单个核细胞悬液的话，这个单个核细胞悬液还是与淋巴细胞分离液混在一起的，也就是处在高密度的液体中，通常的离心看来并不能将细胞沉淀。因此必须稀释并且混匀后再离心。

经常遇到新手再分离淋巴细胞时候，吸取界面层的单个核细胞层的时候，往往吸取的比较多，连界面层下的淋巴细胞分离液也吸取不少，在这种情况下，由于试管通常是一样的，比如10ml试管，加入的稀释和洗涤用的培养液少一些，然后会发现离心后，沉淀的细胞较少，而离心后的上清中仍是浑浊的，说明没有将细胞彻底沉淀。

还有一个原因也很重要，就是血液放置在4度的问题，可能对细胞收回有一些影响吧。血液抗凝采集后还是应该放置于室温为好。时间一般在4～6小时为好，超过8小时，就不太好了。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-7-3 10:45

估计是你吸出来后，没有加PBS，所以溶液的密度还是比较大，离不下来，不妨多加点pbs，再离一下，应该没问题。1200rpm, 5分钟就够了

作者: baidukk 时间: 2012-7-3 10:45

看了以上老师的指点，我学到了很多，表示感谢！我下次做实验时一定注意这些问题，因为病人的血不好获得，所以下次做完淋巴细胞分离后，再和各位老师交流。
再次表示感谢！

作者: 9900 时间: 2012-7-3 10:46

我的实验又有了变动，淋巴细胞分离后要提RNA。
请问:分离淋巴细胞时是否要严格无菌操作，还有提取RNA时除了用trizol还可以用什么试剂盒？

作者: jrwyyplt 时间: 2012-7-3 10:46

请问: 我分离出的小鼠脾淋巴细胞如何鉴定?
谢谢!

作者: zhenxin 时间: 2012-7-3 10:47

我也是分离淋巴细胞后要查细胞内的RNA，但是是检测细胞内的一种病毒，因为嫌前期多次稀释、洗涤太繁琐，时间太长，怕破坏了RNA病毒，所以就没有用PBS稀释，吸取中间层的淋巴细胞后也没有再洗涤，直接12000转离心后把管底的细胞冻存了，现在看离心的效果还可以，可以看到管底有白色的细胞沉淀，但不知道这样会不会影响后期的病毒检测，因为我也发现有时候会混有红细胞之类的杂质。请高手给与指导，谢谢了。

作者: moonlight1912 时间: 2012-8-30 13:06

你是分离的人的还是大鼠血液里的淋巴细胞啊？是用的试剂盒还是自己配制的分离液啊？

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