分析测试百科

标题: [分享帖]总结的MTT方法原理 [打印本页]

作者: wmp1234 时间: 2012-7-20 12:40 标题: [分享帖]总结的MTT方法原理

一、  原理
黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

二、实验步骤（实用于贴壁细胞）
1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。
4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7）  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
8）  计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.

作者: xueyouzhang 时间: 2012-7-20 12:40

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2012-7-20 12:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一、原理
黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波 ...

有依据吗？或者来源？

作者: 了了 时间: 2012-7-20 12:40

我用MTT作药物的增值情况，看过楼主的也想写一些。
1.文献很多用470nm作为测定波长，也有用双波长来测定。我用双波长测吸光值。
2.加入待筛选样品后的培养时间最好也自己考察，每种样品的作用情况都不一样，我的样品就是在加药48小时时最佳。
3.关于调零孔：二甲基亚砜遇光不稳定，变黄。楼上说低速振荡10 min是否在蔽光状态下操作？本人试过加完培养基、MTT，吸尽溶液后，再加二甲基亚砜，分别于2-3min,和15min时于双波长下测吸光值，发现值分别大约为0.05，0.3，差别大，而样品孔变化有细微差别不大。不过我用的是国产的，国外产品没测过。我想应尽快测。能自己考察一下测定时间最好。
另外，二甲基亚砜会腐蚀微量取样器，用时小心别再沾枪身上，我已经被二甲基亚砜弄坏一把微量取样器了。

作者: zsxan1990 时间: 2012-7-20 12:41

“对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）”中“相同浓度的药物溶解介质”是什么东东啊？能帮忙解释一下吗？

作者: 了了 时间: 2012-7-20 12:41

指溶解药物的溶剂，比如样品使用乙醇溶解，即指乙醇。

作者: zsxan1990 时间: 2012-7-20 12:41

如果用二甲基亚砜溶解药物的话，还能加20ul么？二甲基亚砜不是对细胞也有毒性么，看文献说不能超过0.5％的，那要加多少合适呢？

作者: 49888 时间: 2012-7-20 12:42

我最近也在做MTT,每次做3个复孔,因为做时间依赖,每次用一块96孔板,是不是太浪费了,有没有好的办法?

作者: tieshazhang 时间: 2012-7-20 12:42

MTT感觉不如cck－8方便

作者: guagua 时间: 2012-7-20 12:42

MMT的效果确实不错，重庆医科大学已经做了很多。
如果对MTT有疑问，可以参考最近出版的《现代肿瘤学基础》。这本书对MTT用于检测细胞生长和肿瘤药物筛选有着详尽的表述。

作者: skytree 时间: 2012-7-20 12:43

如果用二甲基亚砜溶解药物的话，还能加20ul么？二甲基亚砜不是对细胞也有毒性么，看文献说不能超过0.5％的，那要加多少合适呢？

————————————————————————————————————————————

测的时候就=你不要这个细胞了，如果你板上还有其他细胞要继续培养，建议你吸出来测OD值

作者: skytree 时间: 2012-7-20 12:43

我用MTT作药物的增值情况，看过楼主的也想写一些。
1.文献很多用470nm作为测定波长，也有用双波长来测定。我用双波长测吸光值。
2.加入待筛选样品后的培养时间最好也自己考察，每种样品的作用情况都不一样，我的样品就是在加药48小时时最佳。
3.关于调零孔：二甲基亚砜遇光不稳定，变黄。楼上说低速振荡10 min是否在蔽光状态下操作？本人试过加完培养基、MTT，吸尽溶液后，再加二甲基亚砜，分别于2-3min,和15min时于双波长下测吸光值，发现值分别大约为0.05，0.3，差别大，而样品孔变化有细微差别不大。不过我用的是国产的，国外产品没测过。我想应尽快测。能自己考察一下测定时间最好。
另外，二甲基亚砜会腐蚀微量取样器，用时小心别再沾枪身上，我已经被二甲基亚砜弄坏一把微量取样器了。

——————————————

应该是570nm吧？

作者: october7 时间: 2012-7-20 12:43

据说可以用可以拆卸的９６孔板．这样就不需要有大量的９６孔板了吧．
我正在买

作者: vivian4123 时间: 2012-7-20 12:44

哪里可以买到cck-8啊？价格如何？谢谢！

作者: 阿司匹林 时间: 2012-7-20 12:44

我们实验室测定的波长是570nm，请问不同的波长是不是影响很大？选择波长的依据是什么？
另外，我做的是悬浮细胞HL60和K562,在加MTT和SDS-HCl 是需要将上清液吸出来吗？
我上面的师姐在加MTT是都不是在无菌条件下加的，请问这是否有影响?
由于我从细胞培养到加药，加MTT,加SDS都未曾将孔里面的东西吸出过，这样会不会做出的结果没有差异？
实验郁闷中，请各位高手指点，谢谢

作者: newway 时间: 2012-7-20 12:45

用MTT检测法测定CMC

1． Fen细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。用含0.05％胰蛋白酶，0.02％ EDTA的PBS消化细胞5分钟，洗涤后，用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。

2．取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时，让细胞帖壁。每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10：1到50：1，继续培养4小时，让效应细胞发挥杀伤效应。实验中，设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有效应细胞的阴性对照，每种处理设3各复孔。

3．用含2％小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤各孔 3次，洗去不粘附的细胞。每孔加 0.1ml含2％小牛血清的RPMI-1640培养液和10μl 5mg/ml的MTT染液，继续培养3小时。

4．用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30分钟，溶解形成的结晶。在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值（OD）。

杀伤活性（％）＝（OD实验孔－OD阴性对照） /OD无杀伤对照× 100

作者: gemei0115 时间: 2012-7-20 12:46

哪里可以买到cck-8啊？价格如何？谢谢！

——————————————

http://www.dojindo.cn

作者: eric930 时间: 2012-7-20 12:46

请问悬浮细胞的MTT怎么做，实验步骤一样吗？还是怎么样？我也准备要做了！

作者: zranqi_1 时间: 2012-7-20 12:46

请问悬浮细胞和贴壁细胞共培养后,做悬浮细胞的MTT怎样做啊?哪位高人帮帮忙,多谢!!!!

作者: fei1226com 时间: 2012-7-20 12:47

悬浮细胞在加MTT或SDS-HCL时不需将上清吸出，依据中国药理学通报2003May《半边旗有效成分5F注射液体内外抗肿瘤药理作用研究》。加入MTT后需要再培养一定时间，应无菌加入。

作者: zranqi_1 时间: 2012-7-20 12:47

我的MTT一块96孔板可以做3个时间段，分别是48小时，72小时，96小时，而且就再酶标仪上震荡10秒钟就测，效果不错

作者: zranqi_1 时间: 2012-7-20 12:49

另外96孔板可以重复利用，可以用11次，先用高压水龙头冲，然后超声波洗，洗完后烘干，再去酒精浸泡10小时，就可以了！千万别划破啊！

作者: yysr238 时间: 2012-7-20 12:49

我听说做悬浮细胞的时候要用到９６孔板离心机，如果直接吸的话会把细胞吸出来的，上清不吸出的话，旧的培养基会不会影响到细胞的生长？

作者: milkdog 时间: 2012-7-20 12:50

用MTT检测法测定CMC

1． Fen细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。用含0.05％胰蛋白酶，0.02％ EDTA的PBS消化细胞5分钟，洗涤后，用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。

2．取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时，让细胞帖壁。每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10：1到50：1，继续培养4小时，让效应细胞发挥杀伤效应。实验中，设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有效应细胞的阴性对照，每种处理设3各复孔。

3．用含2％小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤各孔 3次，洗去不粘附的细胞。每孔加 0.1ml含2％小牛血清的RPMI-1640培养液和10μl 5mg/ml的MTT染液，继续培养3小时。

4．用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30分钟，溶解形成的结晶。在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值（OD）。

杀伤活性（％）＝（OD实验孔－OD阴性对照） /OD无杀伤对照× 100

——————————————————————————————————————

在加DMSO前可以加PBS洗吗？我做过几次，这样就会把晶体洗掉一部分啊？

作者: bananapeople 时间: 2012-7-20 12:50

在加MTT前是直接在原来的培养液里加，还是需要把培养液吸出来在加用培养液稀释的的MTT呀？还有这里的培养液要求是有血清的还是没有血清的啊？请求赐教啊！谢谢拉！

作者: ROSE李 时间: 2012-7-20 12:51

我做的是悬浮细胞的MTT结果较理想。
MTT是用PBS配的，用时直接加20ul入孔中。反应4小时后，一孔一孔吸到ep管中离心。离心后去上清，再加入dmso吹打后加入原孔中。这样甲臜也基本溶解了。5分钟可上机检测。
我曾经用过直接整个板子一起离心（专门的孔板离心机），虽然很省事，可是结果不太好。只好一孔一孔离心。
96孔板的重复使用

作者: zhenxin 时间: 2012-7-20 12:51

MTT太不稳定了，我都快被烦死了。
直接拿96孔板作，有时候结果很好，有时候结果也是莫名其妙。我的重复孔都设到16个了。同一批MTT溶液，结果好的一些也不是最开始用的时候，肯定和MTT溶液没关系。细胞也是用的同一细胞系，浓度都是差不多。试剂也都是分装的，每次用一个分装。
我曾经拿6孔板实验过，培养好的细胞中1ml加MTT溶液100ul，4小时后很明显在阴性对照组，试验组，阳性对照中的深色颗粒有很大区别，有很明显的区别，应阴性对照组最多，最密；实验组明显中间，比较稀疏；阳性对照组很少，最稀疏。接着用DMSO溶解，颜色深浅也是有区别的，但是试验组的颜色带红。
然后收集每组的上清分配到96孔板中，再测量。
结果颜色浓度在中间的实验组数值却是最大。我用450和550 来测结果都差不多，没多大区别。
有时候做得时候加了MTT过了4小时每孔皆墨，什么对照都没区别。

有哪位高手能解释下原因吗？

作者: 社会主义好 时间: 2012-7-20 12:51

我的一点体会：
1、接种细胞一定要均一，可以把细胞混悬液倒在96孔板盖上，用排枪加。
2、加任何液体都要轻（最好贴壁加），不要把细胞冲起来。
3、最后上酶标仪测时要快（同一块板，前后测两次数值都不同）。

作者: hyuu 时间: 2012-7-20 12:52

我也试过把细胞分成阴性对照阳性对照实验组几部分，先分别放在试管里稀释好，分别加上试剂，再搅拌均匀，然后再分到96孔板里。效果仍然是时好时坏。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)