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标题: [求助]NB4细胞先成团,再大量死亡. [打印本页]

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:09 标题: [求助]NB4细胞先成团,再大量死亡.

复苏第二天即出现细胞成团,每团大约10~20个细胞.吹打后可分散.
隔天换液,后大约两小时很快又成团.背景上又少量黑色小点,无增多趋势.
复苏后第四天出现细胞碎片增多,细胞出现死亡.并逐渐增多.但仍可见分裂象细胞.
请问各位战友是什么原因造成?是否是污染的原因?

作者: wu11998866 时间: 2012-7-20 13:09

我没养过NB4细胞，但是养HL60。
复苏后有细胞死亡是正常的，只要有活细胞，就要坚持下去。不过到了第四天还有这么多细胞死亡，是不太正常了。你回忆一下冻存复苏过程有什么问题没有？还有培养基?建议你把细胞分两瓶，一瓶用自己的培养基，一瓶用别人的，比较一下。细胞分裂的时候也是成团的，死亡也是抱团的，你的细胞到底是什么情况？
我原来复苏过很多次HL60细胞，情况跟你说的一样，可以看到分裂象细胞，但是每天都有细胞死亡，一个星期左右就死光光了。往培养基里补充谷氨酰氨，加大血清浓度，加入2－巯基乙醇都不行。后来一换了别人的培养基，细胞马上就长起来了。后来自己重新配了培养基，现在长的很好。

作者: wu11998866 时间: 2012-7-20 13:10

你复苏第二天细胞就成团，我估计是抱团死亡的细胞，不是增殖的细胞。增值不至于这么快。还有些细胞虽然不成团，但是体积缩小，是趋向死亡的标志。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:10

谢谢楼上老师的指点。
我用的是师兄留下来的冻存细胞，问了师兄应该没有什么问题。
复苏过程应该没有大问题，唯一的一点就是我看见有帖子说不应该把动存管的口子浸在水里，是不是我复苏过程中把整个动存管浸在水里导致污染呢？
然后培养基，我们这个是第二次复苏了，第一次情况一样，也是一个星期就死得差不多了。这次我们换了新的培养基，也是用的invitrogen的含有谷氨酰氨的1640培养，加10％小牛血清。会不会和配培养基时血清里面还有残留的冰有关系呢？

作者: zhezhe 时间: 2012-7-20 13:10

应在头天下午复苏，第二天上午换液，还要注意的是，复苏时应将冻存管放在干净的PE手套中，再放在40度水浴中快速融化

作者: wu11998866 时间: 2012-7-20 13:11

谢谢楼上老师的指点。
我用的是师兄留下来的冻存细胞，问了师兄应该没有什么问题。
复苏过程应该没有大问题，唯一的一点就是我看见有帖子说不应该把动存管的口子浸在水里，是不是我复苏过程中把整个动存管浸在水里导致污染呢？
然后培养基，我们这个是第二次复苏了，第一次情况一样，也是一个星期就死得差不多了。这次我们换了新的培养基，也是用的invitrogen的含有谷氨酰氨的1640培养，加10％小牛血清。会不会和配培养基时血清里面还有残留的冰有关系呢？

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如果是污染，镜下会看的到的。我觉得即使把冻存管直接扔水里，也不会这么容易污染。否则在液氮罐里早就进了液氮了。我也曾经把冻存管直接扔水里，没什么问题。不过操作小心点，是个好习惯。
细胞是用什么冻存的？DMSO还是甘油？冻存的步骤怎么样？多长时间没有复苏了？
我曾经看到过一篇文章，说复苏的细胞对冷冻的培养基很敏感。你的培养基是先配的，还是配了直接就用了？如果是后者，残留的冰当然会对细胞有伤害了。
另外除了解冻要快，解冻后加入培养基也要快，时间越短越好，我一般是把离心管装好了培养基，把一切都准备好了，再出去开液氮罐取细胞的。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:11

我又分析了一下,我们复苏的时候是老师指导的,先将冻存管3000转离心4分钟,然后再在冻存管中加入1640培养基0.7毫升,转移至EP管3000转离心3分钟,3次.
是不是复苏的时候过程太多了,对细胞损伤太大啊??

作者: ffooll 时间: 2012-7-20 13:12

复苏细胞时要适当降低离心速度，我想你的离心速度太高离心次数太多了，娇嫩的细胞经不起你这么折腾。我即使平常做传代试都未用过这么高的转速，一般我传代转速为1000转5分钟，复苏时甚至更少，多用800转离心5min，弃上清时稍稍留些液体不一定非要吸的很干净（我这样做是为了减少细胞的损失）。呵呵，有时我甚至都不离心直接轻轻吹散后直接转入培养瓶。
我的复苏步骤：迅速取出冻存管，在37度水浴振荡快速融化，加10倍体积新鲜培养液，然后800转离心5min，弃上清时稍稍留些液体，加少许培养液，轻轻吹散细胞，然后转瓶，补充培养液。补充的培养液可将血清加至20%，不过这也不是完全必要，只是为了最大程度的保证你复苏的细胞更好的恢复。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:12

10毫升体系800转离心5min会不会损失太多细胞啊??

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:12

昨天又复苏了.用的将冻存液直接加入8毫升培养基,3000转3分钟离心.再用0.7毫升培养液洗一次,就放入8毫升体系中培养.希望可以成功.

作者: wu11998866 时间: 2012-7-20 13:13

3000转？好高啊。
我只用1000转5分钟，甚至800转。
“再用0.7毫升培养液洗一次”是什么意思？不明白。。。。。。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:13

...........
3000转很高蛮??“再用0.7毫升培养液洗一次”就是说离心后弃上清.加入0.7毫升培养液,再次离心后加入“再用0.7毫升培养液洗一次”培养瓶中.之前的师兄建议这样的,他以前也养的NB4.
今天看细胞,又有很多死亡的碎片了....
哎,真是不容易啊.实验室已经快没有冻存的细胞株了.再出问题的话就郁闷了.

作者: wu11998866 时间: 2012-7-20 13:13

3000转太高了。刚复苏的细胞很脆弱的。甚至有些书上说离心对复苏的细胞比DMSO对复苏的细胞伤害还要大。建议复苏第2天再离心去掉DMSO。
因为我养的HL60对DMSO敏感，所以每次都是立即离心，1000转/分，5分钟。24小时后再换一次液去掉死亡的细胞。不要担心1000转浪费细胞，你3000转确实太高了。只要有活的细胞，肿瘤性质的，条件适合，总会长起来的。
你冻存的细胞是同一批的吗？是不是冻存的时候状态本来就不好了？试一下用别人的培养基，加大血清浓度。20％看看。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:14

好的，谢谢wu老师。
再总结一下。
肿瘤都养成这种确实有点郁闷。呵呵，不过也学到很多东西就是了。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:14

今天有师姐说，离心的话一般EP管用3000转，而10毫升的离心管的话只能用1000转。自己分析的话是不是因为离心时候的半径不同，所以离心力才有不同，以至于转数差别这么大呢？以前都想是10毫升的液体多些，应该用转数大的。做之前确实不知道原来有这么多细节的问题需要注意。从小小的一个细胞复苏都学到了不少东西。
今天看细胞，又很凄凉了，都快成复苏专业户了。

作者: vera+ 时间: 2012-7-20 13:15

楼主:
我最殘的经历是复苏了六次,一次也没成功.总结一下经验供楼主参考.
1化冻要非常快!一般用四十度化冻.冻存管浸到水里也不要紧,仔细操作不会染菌..
2是转速要低,不可以超过一千,因为细胞太脆弱.化冻后可以直接离心,然后去除上清,换用新鲜的培养液,悬浮细胞直接转入细胞瓶中就可以了.没有必要再离心了
3是去除DMSO要及时,常温下对细胞的毒性还是挺大的.
还有就是我发现对于脆弱的细胞最好不要全换液,那本身对细胞就是一个刺激.
祝楼主下次复苏成功!

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:15

报告一下,3个星期之前复苏的细胞在全力抢救之后好象有一点转机了,活力能够达到90%.但是还是很多成团的细胞.希望能够过这一关.

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:15

向组织汇报一下，之前的一瓶细胞在我们以极大的耐心和爱心的栽培下，终于柳暗花明了，开始长的比死的多了。新换的瓶子里面几乎只有很少的死细胞了。
但是有个问题，细胞仍然成团很厉害，而且是很大大团，肉眼都能看见培养液里的浑渚。随着细胞状态的好转是不是成团也会会慢慢好转呢？
哎，上帝保佑，一定要好好的。

作者: xue258 时间: 2012-7-20 13:16

今天看细胞，昨天换液后吹散的又开始成团了。大片大片的，估计有几百个。有没有有经验的老师呢？估计是怎么回事呢？

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