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标题: [求助]请问你们培养DC是不是都先贴壁取单核细胞的. [打印本页]

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:45 标题: [求助]请问你们培养DC是不是都先贴壁取单核细胞的.

请问你们培养DC是不是都先贴壁取单核细胞的,然后再加细胞因子的.

作者: baidukk 时间: 2012-7-25 12:45

外周血诱导培养DC，可以通过免疫磁珠来分选单核细胞，然后加细胞因子诱导培养，或者用贴壁培养PBMC的方法获得贴壁的单核细胞，然后加细胞因子诱导培养。常用的细胞因子是GM-CSF/IL-4,TNF-a。是目前培养外周血单核细胞来源的DC的最常用的方法。

作者: moonlight45 时间: 2012-7-25 12:46

DC分为两种来源的，髓源性和骨髓源性的培养方法是不同的。你是养什么的？

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:46

我养的是外周血的,我想问,我贴壁得到单核后,要不要重悬记数单核细胞加细胞因子,还是直接去掉淋巴后就加进去的.我每次贴壁的单核细胞拿来记数,总是很少,不知道有没什么诀窍

作者: baidukk 时间: 2012-7-25 12:46

贴壁了的单核细胞是没法计数的了。只能大概数一下。而且贴壁的细胞不会很少，要注意使用合适的培养板。

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:47

请问要什么样的培养板比较好啊，我们用的是96孔的培养板，是不是太小了。

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:47

还有想问下，量是细胞因子的量怎么计算呢？

作者: baidukk 时间: 2012-7-25 12:47

96孔板太小了，不利用细胞贴壁！一般用6孔板，而且是适合贴壁细胞培养的那种，因为刚开始需要贴壁培养获得单核细胞。细胞因子的量GM-CSF 100ng/ml, IL-4 500U/ml。这个是根据Romani 1994年在Journal of medicine experiment 上面发表的文章报道的来做的。而细胞因子的浓度，特别是需要用到U为单位的时候，注意仔细看清楚试剂说明，里面有具体的细胞因子的效价！根据效价来确定需要用多少U每ML。

作者: owanaka 时间: 2012-7-25 12:48

呵呵，上面说的也太简单了，现在的文献培养DC的条件太多了，各不相同，不要说1994年的文献，我这2005年文献我也有啊，
养小鼠的DC，我光试培养条件就试了4个月，这里面包括看懂流式图，理解描述DC的一些词汇，还要几个月搞清楚T细胞增殖试验，总之这个试验没有基础做下来要至少一年。
养好小鼠的DC后再养大鼠的，以为手到擒来，谁知道又摸索了四个月，才少有感觉，呵呵呵，不容易啊！
最后，就是做这种试验不能考虑钱，

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:48

能推荐一下好的培养板吗?
那我定的试剂2个微克是不是只能做没多少啊,只能配个20毫升,用起来真的好快呢.中间是不是还要换一次液,换液的时候有讲究吗?

作者: zsxan1990 时间: 2012-7-25 12:48

浓度大概是20ng/ml,你的可以陪100ml，其他的要自己摸索，可意会不可言传

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:48

请问最后DC会悬浮吗?细胞大小比淋巴大多少的样子啊!!我以前试了一次,好象少的可怜.还是淋巴多了

作者: zwsyrt 时间: 2012-7-25 12:49

DC是否悬浮不重要，要看其表面标记和功能。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-7-25 12:49

我们用corning的6孔板,贴壁效果不错;
换液时,不要晃动培养板,沿着板壁从液面往下轻轻吸取,可以1/3换液;
未成熟DC为悬浮细胞,贴壁的大多为巨噬细胞;成熟DC为半贴壁,可以吹打下来.
细胞大多少倍好象不好描述,感觉得有2~3倍吧.

作者: daod 时间: 2012-7-25 12:49

那15ML的血一般可以提多少的DC的样子啊，污染对细胞的成长影响大不大

作者: baidukk 时间: 2012-7-25 12:50

同意！
另外，关于成熟DC的表面标志，目前还有很多说法。特异性非常高的表面标志似乎还没有确定。
Romani 在1994年JEM上发表的文章里面有提到关于DC诱导培养的数量问题，具体数值记得不太清楚。您可以查阅一下。我自己用60ml血诱导培养才10E+06个DC左右。。。

作者: duoduo 时间: 2012-7-25 12:50

污染什么都完蛋拉

作者: baidukk 时间: 2012-7-25 12:50

浓度大概是20ng/ml,你的可以陪100ml，其他的要自己摸索，可意会不可言传

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实验是讲究证据的，是可以摸索的，不是一种“意会而不可言传”的事物。

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