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标题: [求助]我养的树突状细胞出现大量条状虫子，细胞在12小时... [打印本页]

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:47 标题: [求助]我养的树突状细胞出现大量条状虫子，细胞在12小时...

如图，我周二从脐血分离出单个核细胞然后培养分化成树突状细胞，晚上10点才分离完毕，第二天一早从孵箱拿出在倒置显微镜下一看，贴壁细胞数目减少，变圆、肿胀，而吸取出的上清液中的悬浮细胞则大都碎裂！！再仔细微调焦看时，发现了这么在不断蜿蜒***的虫子！！虫子有大有小，昨晚分离时在显微镜下看时是没有的。上午虫子游动很快，镜下可看到其在围攻侵蚀细胞，实验室老师看了说这可能是某种原虫，黑焦虫没这么大。待到下午时，细胞已经分解的差不多，基本看不到成形细胞，如图，但虫子活动度也明显减弱，只翻滚蠕动。
求救啊，回想上两次细胞死亡，可能也是这种虫子作怪，但当时看细胞分解了就倒掉了，没仔细观察。
另，我用培养板培养，实验室其它两位同学养的成纤维细胞和肾小管上皮细胞也出现这种虫子！也是用培养板。用培养瓶养的暂未出现。
有和我出现类似情况的战友吗？有哪位老师知道这种虫子来源及预防措施？请指教啊，近两周的心血全白费了！虫子很毒，12小时就基本可把细胞全杀死了！！
照片为倒置显微镜下400倍，没有细胞作对照，其长度平均为单核细胞直径的2－3倍，虫子直径很小，大约只有细胞直径的十分之一，故观察为线状！

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作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:48

紧急求助啊，原代培养一次细胞费很多心血，回想起来这是我第三次失败了，现在我不敢继续干了……

作者: guagua 时间: 2012-7-27 16:49

我以前也出现过这种情况，高倍镜下可以看见有杆状的黑色的物体在游动，这种东西生长的比较快。来源也不是很清楚。如果楼主的培养瓶中这种虫子还不很多的话，建议勤换液，每天一到两次，并且在一瓶培基中加大双抗的剂量，我以前是150ml左右培养基中加入双抗各0.5毫升，一直换液培养至虫子消失。但做实验之前建议换用正常的培养基，并且让细胞在正常培养基中传2-3代后再开始实验，因为双抗对细胞核的合成还是有一定影响。请大家指正。

作者: toy 时间: 2012-7-27 16:50

我也是做原代的，也出现过这种情况，实验室老师说这是杆菌污染，我把所有污染的都扔掉了，后来拿培养基做实验培养，发现培养5天时出现好多同样的东西，遂扔掉污染培养基，换用新的干净的培养基再做原代培养后，这种情况消失。所以我想这个应该是细菌污染。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:50

我以前也出现过这种情况，高倍镜下可以看见有杆状的黑色的物体在游动，这种东西生长的比较快。来源也不是很清楚。如果楼主的培养瓶中这种虫子还不很多的话，建议勤换液，每天一到两次，并且在一瓶培基中加大双抗的剂量，我以前是150ml左右培养基中加入双抗各0.5毫升，一直换液培养至虫子消失。但做实验之前建议换用正常的培养基，并且让细胞在正常培养基中传2-3代后再开始实验，因为双抗对细胞核的合成还是有一定影响。请大家指正。

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谢谢！培养树突状细胞文献上都写的用培养板，故我未尝试过用培养瓶。实验室里用瓶培养的还未出现类似情况。培养板开盖后暴露面很大，如果勤换液会不会造成更大污染的机会？——实验室条件较差。
另我培养细胞的周期为9－111天，5天后细胞就开始悬浮，换液我也担心失掉部分细胞。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:51

我也是做原代的，也出现过这种情况，实验室老师说这是杆菌污染，我把所有污染的都扔掉了，后来拿培养基做实验培养，发现培养5天时出现好多同样的东西，遂扔掉污染培养基，换用新的干净的培养基再做原代培养后，这种情况消失。所以我想这个应该是细菌污染。

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谢谢！上次正好把那瓶培养基用光了，换瓶新的。如果是培养基污染，那另两位出现同样情况的同学也是这样吗？我在重庆，是不是最近天气适合这种虫子/杆菌生长，导致实验室空气里存在这种东西？思索中……观望中……

作者: dog002 时间: 2012-7-27 16:51

我也刚开始养DC，也出现了“虫子”样的东西。当时吓了一跳，连细胞因子也没敢加。不过杆状的不多，多数是黑色的小圆点样的，活动很迅速的。听实验室的老师和师姐们说，只要细胞长好了，这种小虫子就会少。好像还说，很多临床的标本都会有这种情况。我也不知道为什么，还不知道用什么办法对付这些家伙！对了，补充一下，我也是从脐血来的标本！

作者: u234 时间: 2012-7-27 16:51

用滤器滤一下试试！

作者: zhenxin 时间: 2012-7-27 16:52

跟我的细胞污染有点类似，但我的小虫子好好像只有成虫才有这么长的，活动很快，有些板孔的污染物也是生长很快的，但大部分没有这么快。

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作者: jujuba 时间: 2012-7-27 16:52

是杆菌吧，我的细胞也出现过，后来加了大量双抗，情况有短暂好转，但最后还是没救过来。

作者: mamamiya 时间: 2012-7-27 16:57

细菌污染,肯定的,没商量,这样养可定不能行,特别是做临床,给肿瘤病人回输的DC,这种情况是绝对禁止发生的!!!
解决之道:
采血时严格消毒和无菌操作.严格细胞培养操作,一般可以避免这种情况了.如果感觉在操作中有什么不对的地方,加双抗,同时加入庆大霉素,那么一般是不会出事的了. 至于霉菌,DC一般具有相当的抗真菌活性,如果培养的DC有了真菌污染,则说明细胞培养的无菌操作要从头学起了.

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 16:57

杆菌污染，不信可以做革兰氏染色试试，我的也被污染过，你可以把培养液直接图片，染色看看，如果没有，就要注意勤灭菌和无菌操作，我的上次是没有救回来，损失惨重。

作者: fei1226com 时间: 2012-7-27 16:57

我昨天的单核细胞也污染了,是点状的,比细胞体积小,活动很快,细胞目前状态还可以,请问有什么好方法可以补救吗??

作者: 二丫头466 时间: 2012-7-27 16:58

我从脐血培养的DC，但从没出现过这种情况，我一直用6孔板培养。我建议用进口的培养板，国产的较进口的本身就溶解一部分细胞。我养的8天就收细胞了，中间只换两次液，第一次吸出一半，第二次不再吸出而是加入原培基的一半。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:58

跟我的细胞污染有点类似，但我的小虫子好好像只有成虫才有这么长的，活动很快，有些板孔的污染物也是生长很快的，但大部分没有这么快。

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战友你好，我看了你的图片，感觉我们的污染是一样的，你说的没错，只有成虫才这么大。我照得这张照片，是下午了，上午发现的虫子，随即将培养板拿出孵箱，下午照相时大部分虫子已经丧失活动能力，似乎死掉。
幼虫比较小，活动是翻滚和短距离游动，再大一点的游动很快，最大的活动慢一些，图片上大部分是最大的。

你现在细胞还有这种情况吗？我经过十天的探索，还是没有找到污染源，加强了无菌操作，情况有点好转，但仍有板孔污染，一孔污染，余功尽弃矣……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:58

取材时消毒不严格，大肠杆菌污染了。

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斑竹你好，首先谢谢关注。我的疑问是：
1、大肠杆菌会很快的游动吗？会大小不一吗？照片是250倍光镜下照得，杆菌体积有这么大吗？镜下可以看到这些微生物在围攻分解细胞，可以在数十分钟内看到细胞被肢解的过程！
2、实验室老师看了说是某种原虫，我后来发现一个现象，即细胞分解殆尽，虫子死亡，时间也就一两天。
3、做了两个试验：拿到紫外灯下照射40分钟，不能杀尽，尚有活动的；朝培养基中加入大量酒精，虫子马上死亡，镜下可以证实。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:59

细菌污染,肯定的,没商量,这样养可定不能行,特别是做临床,给肿瘤病人回输的DC,这种情况是绝对禁止发生的!!!
解决之道:
采血时严格消毒和无菌操作.严格细胞培养操作,一般可以避免这种情况了.如果感觉在操作中有什么不对的地方,加双抗,同时加入庆大霉素,那么一般是不会出事的了. 至于霉菌,DC一般具有相当的抗真菌活性,如果培养的DC有了真菌污染,则说明细胞培养的无菌操作要从头学起了.

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多谢关注！请看下我上面回帖的内容，您还觉得是细菌吗？
需要说明一点的是，我养DC已经成功过5次了，就是最近20天，接二连三出现同样的这种污染。实验室老师说以前他在小鼠腹腔中看到过这种虫子。
……我们楼上就是养动物的，我实验室里就有两个养老鼠的，经常拿着小鼠组织快进来……
从发贴至今，我又培养了三次，昨天分离培养的还好，但是四天前的，今早看又出现那些虫子了！！我恨不得用手把它们捏死！虽然镜下看，这些密密麻麻，蜿蜒游动的虫子是很恐怖的！

作者: abc816 时间: 2012-7-27 16:59

杆菌污染，不信可以做革兰氏染色试试，我的也被污染过，你可以把培养液直接图片，染色看看，如果没有，就要注意勤灭菌和无菌操作，我的上次是没有救回来，损失惨重。

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现在无菌操作方面我是比以前十二倍的小心了，唉，奈何不尽人意。
或许***作流程太长吧，一次就要连着六七个小时……培养一次，要从早晨忙到晚上，顺便说，我们实验室洗瓶子、泡酸、消毒之类全是个人动手，这些我也做得很仔细了！累啊……出结果吧，神啊……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:00

我从脐血培养的DC，但从没出现过这种情况，我一直用6孔板培养。我建议用进口的培养板，国产的较进口的本身就溶解一部分细胞。我养的8天就收细胞了，中间只换两次液，第一次吸出一半，第二次不再吸出而是加入原培基的一半。

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战友你好，你从脐血的哪种细胞培养分化DC呢？我是梯度离心、贴壁分离单核细胞，然后培养分化，若和我一样，可否留下电话，想请教！！

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 17:00

这样吧，你把邮箱地址给我。我把自己的培养步骤给你一份。我的邮箱是mjfck@163/126.com

作者: rxcc33 时间: 2012-7-27 17:00

我有个师姐,分大鼠Kupffer 细胞原代的,
昨天细胞中也出现了这样的虫子,以前也有过两三次,
这不象杆菌,肯定不是细菌污染.
我们讨论了,觉得是大鼠里带出来的,血里的,腹腔的都有可能.
她以前用的是哪个公司订的老鼠,后来换成了中科院的,也还有.
建议换批老鼠看看.

作者: yychen 时间: 2012-7-27 17:01

我认为这不是细菌或支原体等常规微生物感染。在我碰到的这种情况里在同一批培养液里都出现了这种东西，即使只用培养液单独放于培养瓶里也有这种东西。因此可能是从血清里出的问题，我后来用另外一瓶血清配培养液里是加血清后再过滤的，就没有再出现这种东西了。所以你可以测一下培养液是否有问题再说吧。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:01

这样吧，你把邮箱地址给我。我把自己的培养步骤给你一份。我的邮箱是mjfck@163/126.com

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感谢！！国内文献对于脐血中分离单个核细胞然后培养分化DC，其细胞因子的量说法不一，很想知道您的操作方法和结果！

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:02

我有个师姐,分大鼠Kupffer 细胞原代的,
昨天细胞中也出现了这样的虫子,以前也有过两三次,
这不象杆菌,肯定不是细菌污染.
我们讨论了,觉得是大鼠里带出来的,血里的,腹腔的都有可能.
她以前用的是哪个公司订的老鼠,后来换成了中科院的,也还有.
建议换批老鼠看看.

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……养老鼠的不是我啊，是我实验室里的其他两位同学……我做的是从健康产妇的脐血中分离单个核细胞…… 原来问了那位同学说这周做完，今天又说老板让他们再做100只老鼠……
不过感谢指教，好像更提供了一条虫子源于老鼠的证据。但我前天分离培养的一次，昨天带着绝望的心情在镜下观察，竟然安然无恙，庆幸。今天上午再看，看了三孔了，都好，很多细胞已经开始悬浮，形状也开始变化，带着欢喜的心情看第四孔时，我当时惊叫了一声，当那些虫子再次出现在我镜下视野中的时候！那些养老鼠的同学并未进入细胞培养间（虽然我们的培养间谈不上什么隔离措施）。仅仅是昨天把培养板拿出来看了一下，为何就污染了呢？……迷茫……但我凭经验推断，虫子也并非前日分离过程中污染，因为虫子一旦出现，则24小时内细胞必几乎全部裂解，48小时那则虫子也基本死亡。而此次虫子的情况，我看像是24小时内的，因为，视野中还有少许残存的细胞。难道是孵箱中污染？其它两位同学出现过一次同样的虫子，但此后未再出现。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:02

我认为这不是细菌或支原体等常规微生物感染。在我碰到的这种情况里在同一批培养液里都出现了这种东西，即使只用培养液单独放于培养瓶里也有这种东西。因此可能是从血清里出的问题，我后来用另外一瓶血清配培养液里是加血清后再过滤的，就没有再出现这种东西了。所以你可以测一下培养液是否有问题再说吧。

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奥，……但我最近三次努力后，是其中一孔或两孔出现这种虫子的，并非全部，用的是同样的血清培养基……从你发的照片中我看你的虫子和我这里的是非常相似的。你的是不是黑焦虫呢？黑焦虫是通过血清污染的。但我感觉不是，请教过几位老师和师兄，说黑焦虫比这小的多。
但我感觉这确实不是细菌或支原体等常规微生物污染，从培养细胞至今，好像只出现过一次细菌污染，以至于当时还想是不是太顺了，没想到现在却出现了这种东西……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:02

我做的DC培养，时间、金钱都已花费不少，但现在却被这虫子挡道。考虑换实验室……但今天联系一位老师说不可能，自己教研室的学生都为实验打挤。
……总之，感觉经费、时间、条件都限制着自己，做点东西，真难。感谢诸位战友的关注。20多天了，六次努力，都没消除。重庆今天天气闷而热，……思索中……

作者: ha111 时间: 2012-7-27 17:03

楼主，很同情你的现状。但是希望你不要因此而过于沮丧。相信自己：既然重庆闷热的夏季已经来临，相信秋天也不会远呢？
看了你分析的帖子，觉得很奇怪的现象。我觉得也不是太像杆菌的污染。按你说的情况，相信可能污染的情况你已经考虑很多了。那会不会是培养板的污染？或者，你可以把这些虫子吸出来，放到另一个碟子里，然后单独观察它们的生命力，或者你可以试着用它们来感染一些你养的其它细胞，看能不能被攻击。如果不能，可能说明这种虫子有专门的宿主细胞选择性。这样子的话，很可能就是来源于你分离的细胞本身自带的，只是分离时可能以某种休眠状态存在，只有4～5天左右它们才复苏过来。当然这些也只是猜想，我也没遇到过你这种奇特的现象。如果有什么新的发现和进展，望贴上来分享。

祝你好运！

作者: nn255 时间: 2012-7-27 17:03

我培养的DC第一天高倍镜（400倍）下观察偶然也发现大量类似楼主图片的杆状，似乎可以活动的东西。这一批所有的孔都有，但培养液今天第二天观察仍清，无浑浊现象，细胞仍生长。今日给予涂片染色没有发现杆状细菌的物质，今天也同时做了细菌培养。更令人不解的是，我贴壁3小时将非贴壁的细胞给了同门培养，他的培养板中却没有发现。如果是污染，我先培养的都污染了，他的不更加污染吗？他的培养液是10%小牛血清，而我的是15%小牛血清；他的血清是从-20度到4度，然后室温，而我的是直接到室温。请问各位前辈，图中细胞周围小杆状物质是细菌吗？还是血清中的物质？

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作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:04

很同情你的现状。但是希望你不要因此而过于沮丧。相信自己：既然重庆闷热的夏季已经来临，相信秋天也不会远呢？
看了你分析的帖子，觉得很奇怪的现象。我觉得也不是太像杆菌的污染。按你说的情况，相信可能污染的情况你已经考虑很多了。那会不会是培养板的污染？或者，你可以把这些虫子吸出来，放到另一个碟子里，然后单独观察它们的生命力，或者你可以试着用它们来感染一些你养的其它细胞，看能不能被攻击。如果不能，可能说明这种虫子有专门的宿主细胞选择性。这样子的话，很可能就是来源于你分离的细胞本身自带的，只是分离时可能以某种休眠状态存在，只有4～5天左右它们才复苏过来。当然这些也只是猜想，我也没遇到过你这种奇特的现象。如果有什么新的发现和进展，望贴上来分享。

祝你好运！

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你好，很感谢你的鼓励！现在真是快到了崩溃的边缘。但我会继续努力。我想最快的解决方法是换实验室，但学校扩招的厉害，学生多，找个地方做实验很难。真想放弃！
对于这种虫子的生命力，其实很弱。我第一次发现污染是在上午，镜下观察虫子活动非常活跃，随即拿出孵箱，置于室温下，下午再看，大部分虫子已经不大动了，也就是图片中所示。所以我认为室温下虫子不容易繁殖成活。
后来出现培养板中某一孔污染，我在超净台中将污染的洗净，怕虫子蔓延到其它孔，但次日发现其它孔也污染了！！恰巧此时看到实验室另一养细胞的同学拿着一孔污染的六孔板（培养基变黄而浑浊，经验判断是细菌污染），我就说是否要将污染的一孔吸净？他说不能动，一动反而让其它孔污染，以前他有过这样的经验，而这与我这次结果相同。【这一点希望大家讨论】于是再后来的污染，我就没有处理，只放着，但就是这样继续在孵箱中，也发现虫子成活期也很短——当细胞被分解殆尽，虫子大都长到如图所示时，此时虫子密度也极大，其活动度显著降低，再过一天，观察，虫子也死了，此时培养基才变黄、浑浊。我怀疑是分解的细胞给虫子提供营养。因为繁殖很快，营养不够，最后集体死亡。——这让我怀疑是不是细胞自带的。但与我用过同一份脐血的其它实验室的同学，分离获得的淋巴细胞，则为出现这种情况。我判断污染源肯定在实验室。但是在孵箱，还是超净台，还是我存放物品的房间，让我困惑不已。顺便说的是，无菌操作现在做的真是12分小心了，最近只是虫子污染，细菌没有发现过——虫子污染，只要虫子没死，肉眼下看培养基和透亮澄清，甚至颜色也不大变。细菌污染好像培养基颜色一开始要变黄吧？而虫子污染是直到虫子也死光时才开始变黄、浑浊。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:05

我培养的DC第一天高倍镜（400倍）下观察偶然也发现大量类似楼主图片的杆状，似乎可以活动的东西。这一批所有的孔都有，但培养液今天第二天观察仍清，无浑浊现象，细胞仍生长。今日给予涂片染色没有发现杆状细菌的物质，今天也同时做了细菌培养。更令人不解的是，我贴壁3小时将非贴壁的细胞给了同门培养，他的培养板中却没有发现。如果是污染，我先培养的都污染了，他的不更加污染吗？他的培养液是10%小牛血清，而我的是15%小牛血清；他的血清是从-20度到4度，然后室温，而我的是直接到室温。请问各位前辈，图中细胞周围小杆状物质是细菌吗？还是血清中的物质？

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战友你好，我所观察到的虫子不是“似乎可以动”，而是飞快的蜿蜒游动，很敏捷。从你说的运动情况，以及图片中我看到的杆状物的大小，我看你图片中的东东不是那种虫子。如果细胞能健康成长，又何须理会呢？看你的好像是别人说的黑焦虫。对于你的问题，我的建议是：你当时吸出培养基上清，加入新的培养基，镜下观察贴壁细胞了吗？当时是否看到有这种杆状物？你在吸出非贴壁细胞前后，加的培养基是同一瓶培养基吗？

作者: ha111 时间: 2012-7-27 17:05

感谢楼主战友！我当时PBMC贴壁，吸出培养基上清，加入新的培养基后，仅低倍镜下观察了细胞的大致密度，没有用400倍的高倍镜观察，不知道当时有没有这种杆状物，上图是我培养1天后用高倍镜观察到的。我在吸出非贴壁细胞，中间冲洗时用了1周前留下的少量培养基，但吸出非贴壁细胞前后均加的培养基是同一瓶新配的培养基。
我培养DC过程中也有太多的失败，与楼主有同样的心理感受，时间经费等限制，以及失败后十分苦闷的体验。希望是黎明前的黑暗吧！

作者: kuaizige 时间: 2012-7-27 17:05

你好！看到你帖子中洋溢得锲而不舍的精神，很是欣赏。继续加油哟！
至于那些虫子，我现在也没能有什么好的建议提供，不好意思，帮不上忙。
你说的6孔板污染的现象，我觉得一孔污染了，肯定是要处理的，不能因为处理它会影响其它空而不管它的，这样只会令污染扩展更快。因为6孔板里面的空气是相连通的，一旦一孔出现异样，其它的孔势必遭到牵连，只是程度不同了，所以这时候的抢救非常必要。对于常见的这些污染，可以加入.05ml的安尔碘到污染的孔中，同时用碘酒棉球擦拭板的盖子，再用75％的酒精棉球擦拭，然后盖好放平板几个小时，注意操作中一定要轻柔，千万不要摇动！！待污染源全杀灭了后，小心翼翼地吸出污染那一孔的东西，这也一定要小心，不能有溅出的液体，再用碘酒棉签小心擦拭，接着用75％的酒精棉球擦拭再擦试一次，同时也要用同样的方法处理盖子的里面，此时还可以在其它孔里加大抗生素的用量。这样再把平板放回去。
总之我认为：处理后当然也同样存在这种污染的可能性，但相比之下，我觉得处理比不处理好。等着它污染倒不如主动去争取避免。

我上周做软琼脂试验，有一块6孔板的一个孔出现了真菌污染，当时就按这个方法处理了。3天后又有2孔出现了同样的真菌污染，但是我也没放弃，继续按这个方法小心翼翼地处理了。因为我养细胞不用抗生素，有考虑到是真菌污染，就没加抗生素了，接下来剩余的几孔平安无事，直到一个礼拜后有一空才出现一样的污染。但这样我争取了时间，已经成功地拍完照片了。

我建议：像你的细胞这样重要，又是要长期培养。可不可以不用这些连孔的板，用那种单个的小的培养皿，一个大小相当于一个六孔板的直径的那种。

祝好运！

作者: 66+77 时间: 2012-7-27 17:06

不是黑焦虫，我也遇到过，送到医院检验科涂片检查过，是杆菌。

污染太严重了，扔了吧

作者: toy 时间: 2012-7-27 17:06

楼主你好，我这个月分离的细胞几乎每次都出现了这种情况，有时轻（培养2－4天出现虫子）有时重（隔天不到24h即出现这种情况）。我自问液体的配制过滤都已经十分小心，所有分离细胞要用的管道系统都用双氧水清洗消毒，可是依然出现这种情况！！这个学期在这之前我分离的细胞每次几乎都没有污染，活力也很好，而现在即使无菌操作12分小心甚至都到了草木皆兵的地步，这种虫子却接二连三的出现！！我失败的次数不比楼主少，所以楼主与我可说是同病相怜。分离细胞从清洗瓶子、消毒、配液体、过滤最后到分离操作要付出多少劳动多少心力，可是到最后所有的劳动都白费了！！
虽然痛苦，不过楼主一定要撑下去，我们细胞室的条件也非常差，没有隔离，进出人员繁杂，甚至有一个超净台的滤网都已经没用了！！
我已经把我所有的液体都放进培养箱孵育，看看结果如何。再者，另外找不同来源的大鼠，操作的时候加倍小心，避免弄破肠道，加大双抗剂量，重新过滤血清、更换超净台等等。看了上面战友们的分析和建议，也让我启发不少。
另外，我有一个问题请教，我在小牛血清中发现有一些黑色的小点点在动，慢慢蠕动，有的是原地有的则缓慢的短距离蠕动，不知道是否是污染源。奇怪的是，我将不同厂家的血清放入培养箱，都看到了我说的这种东西，但是放了很久以后（6－8天）这种小东西并没有增多，也没有增大，外形没变，血清和培养液依然澄清。
我现在担心的就是方向错了，如果是血清里面进去的，那么任我换多少老鼠都是无济于事的，如果是老鼠的问题，那么是否血清里面的这个东西可以不予理会，请各位战友帮忙参谋参谋！
还有，所谓的黑焦虫是什么东西？

作者: redbutterfly 时间: 2012-7-27 17:07

我已经将想到的避免污染和改进措施列出来，准备这个周六再重新找不同来源大鼠再分离一次，结果如何到时候汇报，如果有所好转我们再交流！

作者: guagua 时间: 2012-7-27 17:07

谈谈实验室的整体无菌质量控制问题:
我是做胚胎的出身,和养细胞差不多,可能要求更高些,谈谈我对于污染问题的看法:
1:由于我们国内作实验很多东西都重复使用,因此重复性使用器械的消毒工作一定要确实;
2:培养液的消毒也很重要,由于一般情况下,培养液一般放于冰箱,因此即使有污染,肉眼也看不出来,一旦开始使用,才知道污染了;因此培养液和冰箱的洁净度要注意;
3:操作过程应当注意无菌,当然对于医学的同仁都是常识了:
4:最难控制的就是实验室环境了,一些国外回来的洋博士总是说国外如何不污染,他们是对的,但是国内外不同吗,作为我们实验,应当注意到环境污染的可能性,并加以克服;
控制污染最好的办法就是:
1:带灭过菌的橡胶手套;
2:使用一次性的器械(如果经费允许,有时细算一下,实验失败一次花的钱,可以购买很多一次性器械,同时节约了时间);
3:尽量保证细胞培养所需要的实验室环境;
4:严格的个人操作过程

作者: guagua 时间: 2012-7-27 17:08

最后应当提请大家注意:
污染的培养皿或培养瓶,不可一扔了之,确认用可信的方法杀灭污染菌后方可弃取,让细菌污染在你这里停之,不可以让他们继续危害师兄弟们

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:09

感谢楼主战友！我当时PBMC贴壁，吸出培养基上清，加入新的培养基后，仅低倍镜下观察了细胞的大致密度，没有用400倍的高倍镜观察，不知道当时有没有这种杆状物，上图是我培养1天后用高倍镜观察到的。我在吸出非贴壁细胞，中间冲洗时用了1周前留下的少量培养基，但吸出非贴壁细胞前后均加的培养基是同一瓶新配的培养基。
我培养DC过程中也有太多的失败，与楼主有同样的心理感受，时间经费等限制，以及失败后十分苦闷的体验。希望是黎明前的黑暗吧！

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你好，我仔细考虑了下你的问题，想到如下几点
1：冲洗贴壁细胞，师兄曾建议我用无血清1640，这样可以节省。我考虑了下最终没有用。整个过程我都是用同一瓶培养基。这样可以把污染几率降到最低。最后成功才重要，节省那一点培养基与增加污染的风险比，不划算。培养基放得越久，污染概率越大。有老师说她培养基尽量小瓶分装，一周左右用完最好。
2、看情况好像你的细胞仍长的很好。若如此，照片中的杆状物，我推测两种可能：1)你冲洗时用的培养基中的沉着物。2）血小板！低倍镜下观察，与单核细胞相比，象米粒大小。高倍镜下，似乎有点长条形。你取些那些剩余的培养基镜下观察有无这些东西。

你从成人外周血中分离是吧？若分离10－15ml血，动作会快些，我一次分离至少要30ml脐血，整个过程时间要6.5－7个小时。时间越久，污染几率越大吧。我尽量的把动作做的干净利落且到位些。今天发现没有新的污染，给细胞添加了细胞因子，明下午再去看看，希望平安。……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:09

你好！看到你帖子中洋溢得锲而不舍的精神，很是欣赏。继续加油哟！
至于那些虫子，我现在也没能有什么好的建议提供，不好意思，帮不上忙。
你说的6孔板污染的现象，我觉得一孔污染了，肯定是要处理的，不能因为处理它会影响其它空而不管它的，这样只会令污染扩展更快。因为6孔板里面的空气是相连通的，一旦一孔出现异样，其它的孔势必遭到牵连，只是程度不同了，所以这时候的抢救非常必要。对于常见的这些污染，可以加入.05ml的安尔碘到污染的孔中，同时用碘酒棉球擦拭板的盖子，再用75％的酒精棉球擦拭，然后盖好放平板几个小时，注意操作中一定要轻柔，千万不要摇动！！待污染源全杀灭了后，小心翼翼地吸出污染那一孔的东西，这也一定要小心，不能有溅出的液体，再用碘酒棉签小心擦拭，接着用75％的酒精棉球擦拭再擦试一次，同时也要用同样的方法处理盖子的里面，此时还可以在其它孔里加大抗生素的用量。这样再把平板放回去。
总之我认为：处理后当然也同样存在这种污染的可能性，但相比之下，我觉得处理比不处理好。等着它污染倒不如主动去争取避免。

我上周做软琼脂试验，有一块6孔板的一个孔出现了真菌污染，当时就按这个方法处理了。3天后又有2孔出现了同样的真菌污染，但是我也没放弃，继续按这个方法小心翼翼地处理了。因为我养细胞不用抗生素，有考虑到是真菌污染，就没加抗生素了，接下来剩余的几孔平安无事，直到一个礼拜后有一空才出现一样的污染。但这样我争取了时间，已经成功地拍完照片了。

我建议：像你的细胞这样重要，又是要长期培养。可不可以不用这些连孔的板，用那种单个的小的培养皿，一个大小相当于一个六孔板的直径的那种。

祝好运！

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再次感谢你的关注！你思考问题很细致。
1、对于处理污染的细胞，你作的真好。我第一次是急匆匆的吸净了，然后把吸头在酒精灯上烤热，再去吸下余渍。完全没有用酒精处理。后来第二天就又出现污染了。再后来我发现酒精能杀灭虫子时，就先加了很多到污染液中，片刻后再吸出。但没有用酒精擦培养板盖。第二天无恙。第四天好像又出现虫子了，我就加了酒精后，倒掉了。你的做法很周全，学习中。细菌我不知道能在培养基中活多久，如果持续存活，那确实要果断及时处理，防止蔓延。但这个虫子顶多48小时，就自行死掉——我认为是自杀式繁殖导致的——因为最后里面有无数的虫体。所以我且让它自生自灭。最近这次污染我是这样处理的，结果待观察。实验室老师说这虫子这么大，好像在空气中飘不起来。你说的用小培养皿代替六孔培养板，这倒是我以前没考虑过的，呵呵，我明天看看，看哪一个密封性更好。
2、对于培养基中放抗生素，不知是否是受实验室老师个人做法的影响，好像我们那个实验室的同学都不加抗生素，说对防止细菌感染作用微乎其微……我没加过，基本也没出现细菌污染。（我还无法接受这是杆菌污染的说法，原来楼上说这是杆菌的战友都没再回复，但我会仔细去验证下）

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:10

不是黑焦虫，我也遇到过，送到医院检验科涂片检查过，是杆菌。

污染太严重了，扔了吧

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谢谢关注！疑问如下：
1、杆菌会很快的游动吗？会大小不一吗？照片是250倍光镜下照得，杆菌体积有这么大吗？镜下可以看到这些微生物在围攻分解细胞，可以在数十分钟内看到细胞被肢解的过程。
2、实验室老师看了说是某种原虫，我后来发现一个现象，即细胞分解殆尽，虫子死亡，时间也就一两天。杆菌生存期这么短吗？
3、做了两个试验：拿到紫外灯下照射40分钟，不能杀尽，尚有活动的；朝培养基中加入大量酒精，虫子马上死亡，镜下可以证实。杆菌在紫外灯下照射40分钟，还会有存活的吗？
4、最后，对于杆菌的具体检验方法，现在茫然无知，还请指点一二。

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:10

楼主你好，我这个月分离的细胞几乎每次都出现了这种情况，有时轻（培养2－4天出现虫子）有时重（隔天不到24h即出现这种情况）。我自问液体的配制过滤都已经十分小心，所有分离细胞要用的管道系统都用双氧水清洗消毒，可是依然出现这种情况！！这个学期在这之前我分离的细胞每次几乎都没有污染，活力也很好，而现在即使无菌操作12分小心甚至都到了草木皆兵的地步，这种虫子却接二连三的出现！！我失败的次数不比楼主少，所以楼主与我可说是同病相怜。分离细胞从清洗瓶子、消毒、配液体、过滤最后到分离操作要付出多少劳动多少心力，可是到最后所有的劳动都白费了！！
虽然痛苦，不过楼主一定要撑下去，我们细胞室的条件也非常差，没有隔离，进出人员繁杂，甚至有一个超净台的滤网都已经没用了！！
我已经把我所有的液体都放进培养箱孵育，看看结果如何。再者，另外找不同来源的大鼠，操作的时候加倍小心，避免弄破肠道，加大双抗剂量，重新过滤血清、更换超净台等等。看了上面战友们的分析和建议，也让我启发不少。
另外，我有一个问题请教，我在小牛血清中发现有一些黑色的小点点在动，慢慢蠕动，有的是原地有的则缓慢的短距离蠕动，不知道是否是污染源。奇怪的是，我将不同厂家的血清放入培养箱，都看到了我说的这种东西，但是放了很久以后（6－8天）这种小东西并没有增多，也没有增大，外形没变，血清和培养液依然澄清。
我现在担心的就是方向错了，如果是血清里面进去的，那么任我换多少老鼠都是无济于事的，如果是老鼠的问题，那么是否血清里面的这个东西可以不予理会，请各位战友帮忙参谋参谋！
还有，所谓的黑焦虫是什么东西？

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你好！真不敢相信我们的情况如此相似。你说的这些，很多是说出了我没说的话。如果文字叙述没有误差，那我们实验室条件、污染的情况，都相似。
1、你出现污染是全板污染还是个别孔污染？这点你没写明。我起初是全部出现虫子，在12－24小时内！后来”变本加厉“式的小心操作之后，开始出现个别孔污染，并开始出现第三、四天才出现的污染。如果你不是整个污染，又用的都是同一瓶培养基、PBS、淋巴细胞分离液，那我认为可以排除上述液体的污染，因为若是这些液体污染，应该不会出现有的好，有的坏的情况吧？不过近20多天我的DC还没有生存到7天，都或早或晚的污染，最近这次已经四天，还在观察中。
2、你在本站搜索黑焦虫，会有很多帖子，可供学习。我觉得这些虫子不是黑焦虫。
3、至于是老鼠还是血清……直觉上，我倾向于老鼠…… 思索…… 血清中看到小黑点是放入孵箱之前还是之后？单纯将血清或培养基放入孵箱，小黑点不增多，是否可说明其没有繁殖力？你出现的虫子是否数目增加很快？

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:11

我已经将想到的避免污染和改进措施列出来，准备这个周六再重新找不同来源大鼠再分离一次，结果如何到时候汇报，如果有所好转我们再交流！！

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你做的很好，比我条理一些，可否将改进措施列出来交流讨论？
我觉得对于目前我的情况，最快最彻底的方法是换个好点点的实验室…… 还有这个虫子为何以前不出现……我认为也与天气气候有关。你在哪儿？我在重庆医科大学……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:11

谈谈实验室的整体无菌质量控制问题:
我是做胚胎的出身,和养细胞差不多,可能要求更高些,谈谈我对于污染问题的看法:
1:由于我们国内作实验很多东西都重复使用,因此重复性使用器械的消毒工作一定要确实;
2:培养液的消毒也很重要,由于一般情况下,培养液一般放于冰箱,因此即使有污染,肉眼也看不出来,一旦开始使用,才知道污染了;因此培养液和冰箱的洁净度要注意;
3:操作过程应当注意无菌,当然对于医学的同仁都是常识了:
4:最难控制的就是实验室环境了,一些国外回来的洋博士总是说国外如何不污染,他们是对的,但是国内外不同吗,作为我们实验,应当注意到环境污染的可能性,并加以克服;
控制污染最好的办法就是:
1:带灭过菌的橡胶手套;
2:使用一次性的器械(如果经费允许,有时细算一下,实验失败一次花的钱,可以购买很多一次性器械,同时节约了时间);
3:尽量保证细胞培养所需要的实验室环境;
4:严格的个人操作过程

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感谢战友的经验和指导！记下，学习中…… 实验室条件及管理，对于实验成败真的关键。设备大家公用，老师不管理，就容易乱。

作者: ha111 时间: 2012-7-27 17:12

你这种认真思索，锲而不舍的精神，相信你肯定会成功的！
你的建议很好，我决定以后冲洗时应用同一瓶的培养基，以将污染机会降为最低。
今天第4天，我的细胞仍在生长，培养液仍清。高倍镜下观察到的杆状物稍减少。我取那些剩余的培养基镜下观察也有类似可以摆动的物质，但无明显杆状物。培养皿培养1天半，也没有发现菌落。实验室的一位老师认为血小板也不太象。我现在初步认为我图片中的杆状物细菌污染的可能性小，若是杆菌，400倍镜下应该没有那么大；涂片和培养也没有发现细菌；而且，细胞生长无明显影响。那么是不是血清中的物质呢？我本版战友的求助中得知，血清由-20度应先降到4度融化，然后再到室温，最好血清能过滤一下。我准备下次应用这种方法。

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 17:12

楼主，今天刚刚分离完毕，从早上8点开始，一直到下午4点结束。
我先回答上次我遗留的问题。
这个月到上一次分离细胞，一共分离了4－5次，其中仅在中间一次在另一超净台操作的细胞没有污染，其他几次均有这种杆状小虫子的污染，游动得非常快，似乎在细胞中钻进钻出，细胞慢慢变圆，出现许多透光性差的颗粒，最后崩解死亡。
我最初发现的时候是因为有一次细胞分离的活力不是很理想，且接种密度太稀，培养2－3天后没有起色，就一直扔在培养箱里没有换液。待到第6－7天准备将细胞扔掉时，镜下观察发现了这种小虫子，当时还不是很多，需要非常仔细看才能在低倍镜下看到，换到高倍镜就能看到游动了。
最严重的是最近两次的污染，不到24小时，满视野密布小虫子，且外观培养液已经浑浊。不管是严重的还是轻微的，最终的结果都是所有的细胞均倍污染，因为我接种细胞都是用相同的培养液悬浮，用同一根吸管接种，所以如果一孔已经出现污染，必然每孔都会有，除非这个污染是在之后的培养过程中换液操作带进去。我的情况就是每个孔出现的污染时间可能不同，程度可能不同，但是结局都相同。

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 17:14

我分离的是大鼠肝脏的巨噬细胞。
今天这次实验我之前做了很多准备，下面我把我的一些措施列出来，也许对楼主有所参考：
1 重新配制或过滤（220nm）所有液体，包括用来临时调PH值的HCL也是用高压灭菌水与浓盐酸重新配制的。同时将有所怀疑的小牛血清双层220nm滤膜无菌过滤，并借用同学的未出现问题的血清做今日细胞培养的对照。
2 重新高温高压消毒所有器械，包括液体瓶、手术器械，将手术器械同肝脏消化后用来撕碎肝脏的镊子分开放置消毒。
3 在实验头天晚上打开细胞室紫外灯至次日进入细胞室。
4 在手术过程中，避免人员进出频繁、说话、关闭空调，在操作过程中增加酒精消毒双手的次数，戴口罩。
5 更换超净台
6 更换不同批次不同来源大鼠
7 用双氧水、酒精联合消毒所有管道，用足量灭菌水冲洗。
8 用双氧水、酒精消毒手术操作台
9 手术过程中小心操作，避免弄破组织（包括腹腔内的肠道、肠系膜、其他内脏等等）
10 频繁更换刻度吸管、50ml离心管等
本来还想养一部分细胞在培养瓶里做对照的，但后来细胞不多，怕分组不够，没舍得。

总之我做了我想到的能够做的所有事情。有一些可能看起来无关紧要，比如调PH值的HCL，在强酸中细菌、微生物本身就很难生长，还有用双层220nm滤膜过滤血清，我买的一家血清说明中是用100nm2次过滤，但是我还是在镜下看到那些值得怀疑的“小东西”。如果是我的操作带进去的，那我希望进过过滤可以消除。过滤后镜下观察，“小东西”仍然有，不过很少，偶尔可见。于是今天我用同学的血清培养一半细胞，我自己的血清培养另一半，对照看看。同学的血清我昨晚也放入培养箱孵育了，今天未发现之前在我自己血清中看到的“小东西”。
细节决定成败。
在这些措施中，我自认为最关键的是更换动物和超净台。因为在这个月连续几次实验中唯一一次没有污染的就是更换了原先的超净台在今天操作的这个超净台中操作的。
细胞室的环境已经很差了，如果超净台还不干净的话那真是没办法再做了。
结果如何要到明天看了再说。不知道我这些措施是不是能够避免污染，或者仅仅就是更换动物或者超净台就能解决问题。污染源在哪里很难确定，现在只要我的细胞不再污染就谢天谢地了。
这些仅供楼主参考，作实验真不容易啊，唉！
我想好了，如果这次还是老样子，我准备暂停细胞培养，把后面的实验（动物实验）先提上来做掉，等换季了、现在市面上这批可能带有寄生虫的动物消耗完了或者细胞培养室的条件好点了再继续。
祝你我都好运！

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 17:14

也许楼主的心情现在非常焦急，就同刚开始我连续几次发现自己的细胞污染了一样。心中非常焦急，时间不多了，实验却还有很多没有完成，细胞养不成后面的实验就没办法做下去。所以那段时间心情非常差很郁闷，又因为连续的分离了几次细胞人又很累，真是要崩溃。
不过现在我反而可以平心静气了，有时候是需要静下来仔细回顾、检讨的，不怕一切回到原点从新手做起。相信现在这个气候，污染的机会也会比平时增加。所以在做实验的同时调整好自己的心态，尽量安排好实验是很重要的，否则，我们的心理压力实在是太大了！！

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:14

感谢你的热情回答。我是6.18养最后一批细胞的，昨天是第七天，加了TNF-a，两个六孔板，每板都已经污染了一半，剩下的即使能继续活下去我不知能否做流式……这是近一个月来最好的记录了，能活到七天。我估计很悬……今天我没去看，在为下一步的胃癌组织免疫组化实验奔跑。其实这一步应该在细胞培养之前就做的，我是3月中旬就去联系的病理教研室，但，一直给拖到现在才给切片！！至于细胞培养，我打算放放，全力做免疫组化，做完后再去尝试……我没大有信心继续尝试了，代价有点高……时间、经费……每次分离出来加细胞因子都价格不菲…… 期待你能成功！！

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 17:15

楼主，周六分离的细胞在培养了48h时未看到虫子。
但是细胞活力非常差，几乎没有什么细胞伸展，多数细胞透光性差并且出现空泡和颗粒，我预感虫子又要出现了。
果然的，今天看（第三天）几乎每孔都已经可以看到虫子，有长的丝状的，不怎么游动，也有短小的杆状的，在细胞间忙碌的游来游去，钻进钻出，心里除了打击还是打击，我决定暂停细胞培养。
试了这么多措施，也换了好几批动物，最终的结果还是这样，看来是有些因素我们无法改变和控制的了，唯有先放一段时间再说。我现在也在联系后面动物实验所需要的试剂，查资料，设计实验方案，总之，过了这个梅雨过了这个炎夏再说了！！
祝我们都好运，兄弟！！

作者: loli 时间: 2012-7-27 17:16

我同学最近原代培养的神经细胞总是污染，今天又发现培养的细胞里长出里了杆状的虫子，不过好像不是黑色的。教研室的主任让他把所用的培养基和液体全部重新过滤一遍，还说如果是最近一段时间老污染可考虑暂停实验，过一段时间在做，他师兄去年也是这样，停了一段时间后在做就再也没有污染过了

作者: loli 时间: 2012-7-27 17:16

另外请问你的培养板是从哪里买的，我同学买的是不到五块钱的板子今天主任看了说这种是经过二次处理后的板子，不能用，他师兄买的是国外产的20块千的板子，污染的机会就小多了

作者: loli 时间: 2012-7-27 17:16

建议你同时用培养瓶和培养板作做，以便寻找污染源，我同学的培养板培养的细胞全部都污染了，而用培养瓶养的没污染

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:18

楼主，周六分离的细胞在培养了48h时未看到虫子。
但是细胞活力非常差，几乎没有什么细胞伸展，多数细胞透光性差并且出现空泡和颗粒，我预感虫子又要出现了。
果然的，今天看（第三天）几乎每孔都已经可以看到虫子，有长的丝状的，不怎么游动，也有短小的杆状的，在细胞间忙碌的游来游去，钻进钻出，心里除了打击还是打击，我决定暂停细胞培养。
试了这么多措施，也换了好几批动物，最终的结果还是这样，看来是有些因素我们无法改变和控制的了，唯有先放一段时间再说。我现在也在联系后面动物实验所需要的试剂，查资料，设计实验方案，总之，过了这个梅雨过了这个炎夏再说了！！
祝我们都好运，兄弟！！

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嗯，感觉这东西好像非典病毒似的，来得铺天盖地，消失的时候也快的很。我不是说最后培养的那次还剩了一半细胞存活吗？昨天是第十天了，可以拿去做流式了，作流式前的操作是不需要无菌的，我直接在桌面上将培养基从培养板中吸出，装进EP管，拿到楼下琢磨了一下，担心细胞数量不够，加上因污染造成的添加细胞因子不均衡的问题，心想这次算了，不作了。就又拿回去，扔掉可惜，就想做个污染实验试试吧。又将培养基从EP管里吸到培养板中（我用的吸管也是上次添加细胞因子用过的，没消毒）。觉得还不够，就将培养板盖子拿开，将培养基在桌面上晾了几分钟，心想如果房间里有虫子这下该污染了吧。完了就在房间里放着，也没放到孵箱中。
……今天中午拿了培养板到显微镜下看，心想应该可能有大量虫子，但你才怎么着？细胞竟然长的好好的，连细菌污染都没有！考…… 我不甘心，将培养板放进孵箱，看看明天是否会出现污染。真够晕的，今天这个结果。
但我近期还想以免疫组化为主……有余力时，就再原代培养一次试试……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:21

楼主，周六分离的细胞在培养了48h时未看到虫子。
但是细胞活力非常差，几乎没有什么细胞伸展，多数细胞透光性差并且出现空泡和颗粒，我预感虫子又要出现了。
果然的，今天看（第三天）几乎每孔都已经可以看到虫子，有长的丝状的，不怎么游动，也有短小的杆状的，在细胞间忙碌的游来游去，钻进钻出，心里除了打击还是打击，我决定暂停细胞培养。
试了这么多措施，也换了好几批动物，最终的结果还是这样，看来是有些因素我们无法改变和控制的了，唯有先放一段时间再说。我现在也在联系后面动物实验所需要的试剂，查资料，设计实验方案，总之，过了这个梅雨过了这个炎夏再说了！！
祝我们都好运，兄弟！！

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你说的“细胞活力非常差，几乎没有什么细胞伸展，多数细胞透光性差并且出现空泡和颗粒”，根据我的经验，其实此时你若微调焦细观察，可能会发现有零星的幼虫的！你预感的没错。你说的其余的情形我们是一样的！真是不可思议。另，你在哪儿做实验？我在重医附一院。正如你所说，似乎“有些因素我们无法改变和控制的了”…… ……

作者: abc816 时间: 2012-7-27 17:22

我同学最近原代培养的神经细胞总是污染，今天又发现培养的细胞里长出里了杆状的虫子，不过好像不是黑色的。教研室的主任让他把所用的培养基和液体全部重新过滤一遍，还说如果是最近一段时间老污染可考虑暂停实验，过一段时间在做，他师兄去年也是这样，停了一段时间后在做就再也没有污染过了

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虫子的确不是黑色啊，准确的数是和细胞一个颜色，有点透明。
我用的是进口培养板。
我们实验室也是培养瓶出现污染的很少，培养板污染的多。
我这个细胞用瓶养，不方便。

作者: caihong 时间: 2012-7-27 17:23

过这种情况，当时我的污染更严重，有两种细菌，一种是培养孔中朦朦的一片，另一种是那种活动的杆状东西。而且，杆状常常聚集在细胞周围，生长比朦朦的那种有优势，一旦出现就不能救回。当时我是一周灭菌2～3次，后来每天灭菌，换了培养基就好了。
当时曾经把污染细胞上清收集后离心，图片，革兰氏染色，在油镜下看到红色杆状物，有分节，很多，呵呵，那种朦朦的是蓝色的球菌，数量不多，也很清楚。
把培养基放在孵箱37度3天，未见浑浊，直接取培养基10ml，离心后弃上清涂片，也看到了这两种东西，所不同的是杆状物较少，球菌更多。
楼主不妨试试，反正不麻烦，与其使劲分析，不如让事实说话。
PS：那种杆状物在油镜下仍然很小，要仔细找。
这是培养基中的：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13190

作者: caihong 时间: 2012-7-27 17:24

这是培养上清中：

图片附件: 11507051.snap.jpg (2012-7-27 17:24, 9.6 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13191

作者: ladyhuahua 时间: 2012-7-27 17:25

我培养的是昆虫细胞，现在也发现了这种污染，我们老师说是放线菌，繁殖很快。我觉得可能是实验操作中的问题，因为一批处理的细胞只有部分污染，而我换了培养基和血清，还是有，但是同样的条件下别人处理就没用，所以大概是处理不当的原因。

作者: junjie05 时间: 2012-7-27 17:25

放线菌？我想可以考虑这种污染。
放线菌是不是可以产生一种叫做放线菌酮的物质，这对细胞杀伤力很大。

作者: qhyu 时间: 2012-7-27 17:25

总算看到这一贴了，我最近才要到的两种细胞也被这种线状“虫子”污染了，还没来得及扩增冻存，哭泣中。细胞到现在还没要到，半个月实验停滞中。……无语。这种线状“虫子”究竟是啥啊？因为用同一瓶培养基和血清养的另外一种细胞一点事没有。而且我发现培养基会混浊，但细胞还有存活的，只是状态较差，我用PBS反复冲洗，培养基中加抗生素，勤换液都没有挽救回来，呜～～（另外，我也在重庆）

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