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标题: [求助]融合细胞全部死了！ [打印本页]

作者: toy 时间: 2012-7-30 13:25 标题: [求助]融合细胞全部死了！

我做单抗将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合在HAT培养基下培养，三天后细胞全死了，是什么原因，哪为大虾指点一下，谢谢！

作者: ha111 时间: 2012-7-30 13:25

只有融合细胞才能活下来...

作者: toy 时间: 2012-7-30 13:26

我知道只有融合细胞能活下来，但是我的细胞全死了，融合细胞也没了。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-7-30 13:26

很简单，融合没有成功，你的描述实在是太简单了，不知道你的问题出在哪里

作者: yychen 时间: 2012-7-30 13:27

肯定是没融合上。

作者: toy 时间: 2012-7-30 13:27

谢谢，我的融合实验过程是老板在做，我没插手。具体过程为：以10∶1的比例将脾细胞与SP-2/0骨髓瘤细胞混合于50mL刻度离心管，用20-30mL RPMI1640基础培养基洗涤2次，用手掌轻击管底，使沉淀细胞松散均匀，将此融合管移入37℃水浴中预热并轻轻旋转，在60s内将1mL预热至37℃的50%PEG滴加到融合管中的沉淀细胞上，在5min内将25mL预热至37℃的基础培养基滴加到融合管中，第1min加1mL，第2min加1mL，第3min加1mL，第4min加1mL，第5min加完剩下的培养基，边加边轻轻转动离心管，37℃静置10min，1000 rpm离心5min，弃上清，加入50mLHAT 培养基，每孔0.1mL接种于已经培养有饲养细胞的96孔培养板，置37℃、5%的CO2培养箱中培养

作者: toy 时间: 2012-7-30 13:27

各位大虾请问怎么能用实验的方法证明细胞未融合上了呢，另外有没有可能是HAT浓度使用不当引起细胞死亡呢?这又如何证明？

作者: ffooll 时间: 2012-7-30 13:27

你可以换一个公司或批号的HAT，试一下sigma的，按说明书配。另外，我们做融合的时候，1分钟内加完PEG会再作用1分钟，然后加入预热的培养基终止反应。你的试验会不会是PEG作用时间不够没有细胞融合啊。

作者: wu11998866 时间: 2012-7-30 13:28

一分钟内加完PEG后再在水浴中静致90秒钟的

作者: toy 时间: 2012-7-30 13:28

我们使用的HAT是sigma公司的，PEG也是一分钟内加完的，因为我已做了两次融合实验，第一次PEG加完后做作用了一分钟，第二次没有，最后加预热的培养基

作者: ritou1985 时间: 2012-7-30 13:28

告诉我你的HAT的浓度？

作者: wood533 时间: 2012-7-30 13:29

sigma的HAT应该没问题，如果想看浓度对不对，可以把它用于你们以前做的杂交瘤细胞，那些细胞应该是有HAT抗性的。
你第一次做融合的结果如何呢？

作者: toy 时间: 2012-7-30 13:29

第一次融合五六天后细胞也是死完了
HAT浓度1：100

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-7-30 13:29

也要考虑一下你的血清是否是优等的

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