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标题: [求助]Ｈｅｌａ细胞＊＊＊病了？ [打印本页]

作者: 101010 时间: 2012-7-31 11:22 标题: [求助]Ｈｅｌａ细胞＊＊＊病了？

昨天，见两瓶Hela细胞长到了70-80%融合，进行了细胞一传二处理，后４小时、８小时、２４小时内观察见四瓶细胞全和刚传时一样，无任何一个细胞贴壁，培养液呈紫红色，无浑浊，可见少量的细胞团块。培养用液及培养器具都是一星期前进行消毒除菌处理了的。请教各位，高手发生这一现象的原因！！是污染吗？污染源从何而来啊？可否挽救阿？？

作者: xingyi08 时间: 2012-7-31 11:22

最有可能就是培养基失效了，营养成分不足，影响了细胞的贴壁。可以收集离心之后，换新鲜培养基试试。
你描述没有出现浑浊，污染的可能性不是很大。培养器具消毒之后最好在一个星期内使用。
祝楼主好运！！

作者: 101010 时间: 2012-7-31 11:23

是新鲜的培养基，血清是去年12月的，和培养基一起进行了０．２２微米膜的过滤处理；在两天前用的是同一瓶培养液细胞还长得很好啊！

作者: misswu61 时间: 2012-7-31 11:23

你把血清过滤了？？？
血清里的细胞生长因子过滤后损失会比较大。
一般是不会推荐过滤血清的，实际操作起来也会比较困难。
建议新配一些培养基，过滤后再加血清。

另外，细胞24小时内没有贴壁也是有可能的，可以多放一天看看。Hela细胞还是比较容易养的，可能需要一点耐心吧

作者: vvmmoy 时间: 2012-7-31 11:23

同意楼上的观点，血清过滤的确不太好，一些细胞因子和胶原都被滤掉了或吸附了，况且操作起来还要费好大力气。

另外培养基呈紫红色，考虑偏碱，该适当调节CO2浓度。

作者: ququer787 时间: 2012-7-31 11:24

我觉得细胞刚传代后反复摇动会影响贴壁的。
另外你的培养基呈紫红色，说明培养基偏碱，你可以用PH试纸测PH值，太酸或太碱的环境都会影响Hela细胞生长和贴壁。

另，你消化时间是否过长或EDTA没去除干净而损伤了细胞膜？Hela细胞是很好养的呀！

作者: 49888 时间: 2012-7-31 11:24

谢谢以上各位同仁的回答！！
1.昨晚把血清量加大了，但是还未见好转。现在是传代后46小时了。
2..操作过程中不存在消化时间过长问题，我的操作是先用胰酶（无EDTA）润洗一遍，后再加胰酶覆盖瓶底，于最多2分钟内终止消化。
3.培养液PH值在7.2~7.4左右，用前已经用PH试纸检测了。因为是无CO2罐培养，加培养液后一小时内，就会观察到培养液变成紫红色，但是我并不能解释原因。
4.真的是血清过滤的问题吗？有没有那位同仁也出现过类似的情况阿？已经传代这么长时间了，就算细胞未死，活力也不行了吧，没挽救的必要了吧？

作者: mimili_901 时间: 2012-7-31 11:24

武汉的各位仁兄仁姐，能不能馈赠一瓶Hela细胞给小妹啊？实验急啊！又没有冻存细胞！！感激不尽。

作者: 薄荷侠 时间: 2012-7-31 11:25

谢谢以上各位同仁的回答！！
1.昨晚把血清量加大了，但是还未见好转。现在是传代后46小时了。
2..操作过程中不存在消化时间过长问题，我的操作是先用胰酶（无EDTA）润洗一遍，后再加胰酶覆盖瓶底，于最多2分钟内终止消化。
3.培养液PH值在7.2~7.4左右，用前已经用PH试纸检测了。因为是无CO2罐培养，加培养液后一小时内，就会观察到培养液变成紫红色，但是我并不能解释原因。
4.真的是血清过滤的问题吗？有没有那位同仁也出现过类似的情况阿？已经传代这么长时间了，就算细胞未死，活力也不行了吧，没挽救的必要了吧？

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无CO2罐培养？！

作者: mimili_901 时间: 2012-7-31 11:25

是啊，有不少地方都是这样养的阿。Hela细胞本身对酸碱的缓冲能力很强。

作者: join 时间: 2012-7-31 11:27

我也是用没有充CO2的培养箱培养的~但是由于细胞的生长代谢,营养液会慢慢变黄,也不会变紫的呀~~不会越来越偏碱的~我还是觉得你传代时操作出问题了~让你的cell死翘翘了,营养液才偏碱的

作者: mimili_901 时间: 2012-7-31 12:23

你是养的Hela 细胞吗？你说的传代操作问题，我认真回想了，不觉得哪里有隐患阿。还请指名。

作者: xevin 时间: 2012-7-31 12:24

我不是养的Hela哈~~但是由于细胞代谢营养液变黄,特别是在没有CO2的情况下明显,这是肯定的哈~~每种细胞都一样~~~
至于操作问题,我还是觉得可能是消化过了,吹打太久了之类的~~
不过,个人认为在培养细胞的过程中,经常都会出现这种莫名其妙的问题哈~~~不用太在意~~重头再来拉~~~

作者: mimili_901 时间: 2012-7-31 12:24

呵呵，也是阿，总是有莫名其妙的问题出现，虽然自己觉得很小心了。

作者: xevin 时间: 2012-7-31 12:24

是呀，我也是一直都很小心~操作也没问题的~但是一直都有奇怪的问题出现~~很烦人的~~有时候弄的自信心完全被毁灭~~不过第二天还是要重头再来~~~呵呵~很考验心理素质呀`~

作者: tangxin_80 时间: 2012-7-31 12:25

谢谢以上各位同仁的回答！！
1.昨晚把血清量加大了，但是还未见好转。现在是传代后46小时了。
2..操作过程中不存在消化时间过长问题，我的操作是先用胰酶（无EDTA）润洗一遍，后再加胰酶覆盖瓶底，于最多2分钟内终止消化。
3.培养液PH值在7.2~7.4左右，用前已经用PH试纸检测了。因为是无CO2罐培养，加培养液后一小时内，就会观察到培养液变成紫红色，但是我并不能解释原因。
4.真的是血清过滤的问题吗？有没有那位同仁也出现过类似的情况阿？已经传代这么长时间了，就算细胞未死，活力也不行了吧，没挽救的必要了吧？

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1 我用的血清的量一般在5－10％
2 消化建议不要用胰酶润洗改用pbs，另外加胰酶的量不用太大，只要能够覆盖瓶底就行，消化时间不必太长，只要在镜下看到细胞飘起来就中止消化（你的消化时间不算长）吹打时尽量避免大量气泡产生。
3 胰酶、pbs、培养基从冰箱拿出来后，在37度水浴箱里温浴一下，以免低温对细胞造成不必要的伤害，当然时间不宜太长以免对血清品质造成影响。
4 血清正如楼上那位大侠所说不要过滤，以免一些营养因子丢失。血清最好在－20度储藏，如果放在4度储藏的超过一个月的不要使用。买回来的血清不能直接到37度水浴箱溶解，而要放在4度一天后，至室温溶解分装使用，这样逐步溶解时为了避免温度变化太大造成血清蛋白凝结沉淀。
5 所有东西在消毒一周内使用，使用物品如装培养基的瓶子等在放进操作台之前，都用75％酒精搽一下。
另外我有个疑问没有co2的培养箱能养吗？请大侠们指教。谢谢！

作者: xevin 时间: 2012-7-31 12:25

能养哈~我们这的实验室都用的是没有充CO2的CO2培养箱培养的哈~~效果肯定没有充了CO2的好，但是也一样能用哈~~只是换液要换的勤些吧~~

作者: okhaha 时间: 2012-7-31 12:26

能养哈~我们这的实验室都用的是没有充CO2的CO2培养箱培养的哈~~效果肯定没有充了CO2的好，但是也一样能用哈~~只是换液要换的勤些吧~~

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“用没有充CO2的CO2培养箱培养”，必须注意：
1、培养液必须加HEPES。
2、最好是密闭培养，防止二氧化碳逸出。

作者: mimili_901 时间: 2012-7-31 12:26

请问，有的培养基中应含有HEPES吧，比如RPMI-1640？密闭培养的话，把培养瓶盖扭紧就可以了吧？

作者: xevin 时间: 2012-7-31 12:26

好象培养基中没有添加HEPES的吧~~是要自己买HEPES来配,然后添加到营养液中的哈~~但是这个不能乱用的,要试着来~~有些细胞是不适应在有HEPES的营养液中生长的哦~~

作者: huifeng0516 时间: 2012-7-31 12:27

请问，有的培养基中应含有HEPES吧，比如RPMI-1640？密闭培养的话，把培养瓶盖扭紧就可以了吧？

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标准配方的培养液是不含HEPES的，如果有添加会标明的。
把培养瓶盖扭紧就是密闭培养了。

作者: 101010 时间: 2012-7-31 12:27

谢谢以上各位的回呵，看来我是盲目套用别人的经验了。那么PH值的不良改变，也是这次细胞死亡的重要原因了。

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