分析测试百科

标题: [求助]帮忙分析流式测凋亡的图片 [打印本页]

作者: birdfish 时间: 2012-7-31 12:28 标题: [求助]帮忙分析流式测凋亡的图片

请高手帮忙分析一下流式测凋亡的图片，多谢。我这两张图第一张是是正常细胞，第二张是凋亡，为什么S期的峰差别这么大那？这两张图有没有比较意义？

图片附件: 82017065.jpg (2012-7-31 12:28, 36.98 KB) / 该附件被下载次数 32
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13234

作者: birdfish 时间: 2012-7-31 12:30

第二张图

图片附件: 24543376.jpg (2012-7-31 12:30, 35.26 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13235

作者: guagua 时间: 2012-7-31 12:30

我也是新手，不是很懂，最近使用流式细胞仪做过几次试验。第一张图比较正常，出现较明显的G1期，S期，G2/M期，结果比较漂亮，正常细胞周期图；第二张图确实出现了凋亡峰，就是G1期峰前面的那个小的“凸峰”。这两张图还是有点意义的。至少说明细胞现在已经出现凋亡，结果分析中凋亡比例应该也是比较高的。
后备S期G2/M期峰差的问题，可能是样品中混有其他细胞或微生物。
新手言误请高手更正！

作者: vvmmoy 时间: 2012-7-31 12:30

1 首先要弄清楚正常细胞是用了做什么的，一般是用来调整电压，标定正常二倍体的位置，好来确定后面做的是否是异倍体，而不是把正常细胞和你做的细胞的周期来做比较

2 第二张图S期高说明细胞增殖旺盛，与正常细胞的S期差别肯定大

3 真正的凋亡是G0G1前面的亚二倍体峰，而不是图中M1门中所示的21.5%

作者: birdfish 时间: 2012-7-31 12:31

非常感谢您的解答，请教，按道理讲凋亡增多，S期应该低吧，为什么反而高了那？做凋亡的那个老师说最前面的那个峰是凋亡，G0G1前面的亚二倍体峰不知是怎么回事。请问亚二倍体是怎么回事？多谢指教

作者: birdfish 时间: 2012-7-31 12:46

请教各位下面这张图有没有凋亡细胞

图片附件: 25128612.snap.jpg (2012-7-31 12:46, 36.71 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13236

作者: birdfish 时间: 2012-7-31 12:47

下面是对照

图片附件: 36237664.jpg (2012-7-31 12:47, 79.08 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13237

作者: ha111 时间: 2012-7-31 12:47

你的图片还看不清楚，我猜想你是用Hoechst染色的吧，但是你得细胞变形不明显，你的显微镜的倍数不够高，我猜想应该40倍左右吧，但是这个倍数也能看到，如果你这时候看不清楚，如果你又没有更高的倍数的显微镜，建议你60-72小时继续观察，给你看一张我60小时的照片。我用的是40倍镜。

作者: bohe221 时间: 2012-7-31 12:47

先说AP的那两张：
处理后明显出现AP，但是应该是subG1，而不包括荧光强度很小的那群，因为细胞特点不一样，也不好就百分百排除，但是凋亡既然是精巧调控的PCD，其过程也是有规律的，所以发生凋亡的细胞的DNA loss程度也应该有生物聚集特性，而荧光强度低的那群很有可能是debris containing few DNA fragments，所以跟subG1区别很明显。如果是大流式，建议sorting出来sub-sub和subG1这两群，再拿回光镜下看应该区别很明显的。
至于细胞周期，都诱导凋亡了，cycle能不紊乱吗！所有期的细胞DNA都被切割，所以G2期荧光强度减弱至原来S期的强度，S期的减弱至G1甚至subG1，G1减弱至subG1。而不是S期增值旺盛，再说都凋亡了，还增值啥呀！多思考，想清楚，否则就出现明显的判断失误了。

作者: bohe221 时间: 2012-7-31 12:48

再说后面的两张33258：
前面一张出现大量核物质浓聚固缩的深染核形态的细胞，应该还有部分“分叶核”，但是凋亡小体罕见；后面一张基本上是核物质均匀分布的浅染核形态细胞，差别还是明显的，建议使用400×扫全dish或well，定性后换600×拍照，清楚很多，有利于判断和说明。

作者: 一叶 时间: 2012-7-31 12:49

先说AP的那两张：
处理后明显出现AP，但是应该是subG1，而不包括荧光强度很小的那群，因为细胞特点不一样，也不好就百分百排除，但是凋亡既然是精巧调控的PCD，其过程也是有规律的，所以发生凋亡的细胞的DNA loss程度也应该有生物聚集特性，而荧光强度低的那群很有可能是debris containing few DNA fragments，所以跟subG1区别很明显。如果是大流式，建议sorting出来sub-sub和subG1这两群，再拿回光镜下看应该区别很明显的。
至于细胞周期，都诱导凋亡了，cycle能不紊乱吗！所有期的细胞DNA都被切割，所以G2期荧光强度减弱至原来S期的强度，S期的减弱至G1甚至subG1，G1减弱至subG1。而不是S期增值旺盛，再说都凋亡了，还增值啥呀！多思考，想清楚，否则就出现明显的判断失误了。

————————————————————————————————————————————————————————————————

bohe老师说的极是，要多思考，想清楚，不过我对bohe老师的说法有些不同看法

1.关于周期紊乱的说法：某些类型的细胞发生凋亡时具有细胞周期特异性，即有些药物只诱导处于某一细胞周期的细胞凋亡，当细胞凋亡发生在G0G1期时，subG1在GOG1前清晰可见，而选择性发生在S或G2的凋亡，能否用PI单染检测尚有不同看法

2.关于不是S期增值旺盛的说法：如果搂主的实验是选择性诱导G0G1期细胞凋亡，那么S期增值旺盛是有可能的，另外，搂主问的是和正常细胞比较，我的理解，这里的正常细胞应该是正常二倍体细胞，而不是未经诱导的实验组阴性对照细胞

欢迎批评指正，共同提高

作者: 一叶 时间: 2012-7-31 12:49

非常感谢您的解答，请教cllly22，按道理讲凋亡增多，S期应该低吧，为什么反而高了那？做凋亡的那个老师说最前面的那个峰是凋亡，G0G1前面的亚二倍体峰不知是怎么回事。请问亚二倍体是怎么回事？多谢指教

————————————————————————————————————————————————————————————————

1. 多数情况下，可能是会出现按道理讲出现的情况，出现不按道理的结果未尝不是好事，再查一下你用的药物是诱导哪期细胞凋亡的，如果多次结果都如此，一定是有原因的，找找原因，可能你的科研会有突破,另你的正常对照是否为未诱导实验细胞？

2.最前面的峰不是凋亡，多是碎片，G0G1前面的亚二倍体峰就是GOG1前面的那个小峰，基本是正态分布的

3.亚二倍体和是正常二倍体相比较而言的，这就是为什么我们实验要做正常细胞的原因了，把凋亡峰的平均荧光强度与正常二倍体GOG1峰的平均荧光强度多比值，小于1.0，直观上亚二倍体峰在正常二倍体峰的前面。

4. 既然做了凋亡的实验，对细胞周期就应该有一定的了解，建议看一下这方面的基础内容

作者: bohe221 时间: 2012-7-31 12:49

1.关于周期紊乱的说法：某些类型的细胞发生凋亡时具有细胞周期特异性，即有些药物只诱导处于某一细胞周期的细胞凋亡，当细胞凋亡发生在G0G1期时，subG1在GOG1前清晰可见，而选择性发生在S或G2的凋亡，能否用PI单染检测尚有不同看法

2.关于不是S期增值旺盛的说法：如果搂主的实验是选择性诱导G0G1期细胞凋亡，那么S期增值旺盛是有可能的，另外，搂主问的是和正常细胞比较，我的理解，这里的正常细胞应该是正常二倍体细胞，而不是未经诱导的实验组阴性对照细胞

————————————————————————————————————————————————————————————————

判断周期是否紊乱最关键在于细胞DNA含量分布是否仍然保持相对规律，不管subG1出现没有，我们要判断细胞周期的变化总得还能准确清晰地分辨细胞周期啊。和第一张图相比，第二张图上从原来G1到G2的荧光强度分布区间里，细胞的分布早已没有规律可言，就算用cycle软件模拟，能看到的也是和分布曲线很不吻合的模拟“细胞周期”，反倒是细胞荧光强度呈相对连续无起伏的弥散分布，这是胞内DNA相对不规则损失的强有力证据，也就是说细胞群里每个细胞DNA含量都失去细胞周期的特有聚集性，无法呈现规律性，而只呈现相对随机性。那么怎么判断SPF呢？又怎么判断SPF显著增加呢？
另外，楼主说的正常细胞应该是指“正常”也就是没有诱导前的传代细胞（是不是肿瘤细胞就不知道了）。

作者: 园丁## 时间: 2012-7-31 12:50

两位分析得都有道理。看得出都是流式高手兼cell cycle & apoptosis的专业人事！

大家学术讨论，希望以文会友，彼此学习，共同进步！

对于楼上说的“当细胞凋亡发生在G0G1期时，subG1在GOG1前清晰可见，而选择性发生在S或G2的凋亡，能否用PI单染检测尚有不同看法”，俺也考虑过，有可能！其实和bohe兄说的“所有期的细胞DNA都被切割，所以G2期荧光强度减弱至原来S期的强度，S期的减弱至G1甚至subG1，G1减弱至subG1”是一个道理。而这就使subG1法受到怀疑，没有查到相关文献，自己也很想弄清楚！两位能否推荐给我看一下？

对楼上说的“即有些药物只诱导处于某一细胞周期的细胞凋亡”的说法有点异议。个人认为更多情况下是“有些药物诱导的细胞凋亡只在某一期发生”！

关于楼主的图，俺认为这样的图用来看看趋势还是可以的，想发文章还差一点点！试着多做几次，多几个剂量和时间点，更好的图更加利于分析。第二张图的确不好说！

作者: birdfish 时间: 2012-7-31 12:51

谢谢各位指教。我的对照是未处理的肿瘤细胞。溺水的小鱼，您好。能否发一张您做的图呀。多谢。
毕业在即，能否拿这两张图做毕业论文？这些图到底有没有意义呀？
急！

作者: 一叶 时间: 2012-7-31 12:51

你的这两张图其实还是可以的，不用担心。

作者: kuaizige 时间: 2012-7-31 12:51

我的凋亡的荧光图还是有很漂亮的，但是很惭愧的是我的流式图也作的很不漂亮，还不如楼主的能说明问题，真不好意思。如果你想看看具体的凋亡图，我可以给你的。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)