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标题: [求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题 [打印本页]

作者: mysmdbl 时间: 2012-7-31 13:56 标题: [求助]有关乳鼠心肌培养时消化下来的细胞很少的问题

本人近期进行了5次乳鼠心肌培养，一次比一次消化下来的细胞少，本人用的是高糖的DMEM培养液加10%的小牛血清，0.25%的胰酶。共消化四次，每次消化20分钟，第一次消化的产物弃去，后3次加等量的培养基终止消化，滤网滤过1000转离心8分钟沉淀下来的细胞加培养基差速贴壁两个小时再贴壁48小时看实验结果。每次做7只鼠只能获得两个3.5cm培养皿的细胞。
本人想请各位帮忙解答一下消化细胞少与哪些因素有关，多谢!

作者: kswl870 时间: 2012-7-31 13:57

注意几点：
1、0.25%的胰酶浓度太高，可以改为0.15~0.2%。
2、时间太长，每次消化只要10-12分钟就要吸去已经消化的细胞。
3、用等体积的小牛血清中止消化，离心取细胞，用血清在培养箱孵育。
4、要消化10次左右，把每次消化分离的细胞加在一起，在进行实验。
5、每次7只太少了，我做过40多只的。
6、差速贴壁1.5~2小时，与细胞活性和贴壁的培养瓶（皿）有关，要观察。

作者: 911 时间: 2012-7-31 13:58

楼上的朋友说得都对，不过有一点我意见不一，比如做组化的时候，平均一个孔一个老鼠足够的细胞密度，不一定要那么多，当然做western，流逝另外。另外，感觉还是0.1%的酶比较好，0.25的太猛了。同时也可以吹打，加快消化速度，一般4-5次就消化完毕。请楼主参考

作者: KGZ564 时间: 2012-7-31 13:58

我们所用的胰酶浓度一般为0.08%,如果消化效果不好也可考虑一下消化温度的问题,是否能保证胰酶的最佳温度．

作者: 911 时间: 2012-7-31 13:58

个人感觉，温度的差异可以用吹打的方法来弥补，不一定要控制在37度的，毕竟水浴来水浴去麻烦。另外，筛网过滤是否一定需要？我每次都不用，也没发现什么不好，即使有细胞碎片可以换液来解决得。

PS：心肌细胞算是比较杂实的细胞了，经得起猛烈吹打，很多细胞比它娇嫩的。

作者: langlang 时间: 2012-7-31 13:59

老鼠的只数不必太多，只要每次消化完全，就能够得到所需细胞数，7-8只足够了。个人认为是你消化的程度过了，我以前做也是每次离心时看到的细胞很少，为了得到更多的细胞延长离心时间，结果又损失了部分细胞。后来降低酶的浓度，每次消化10分钟，离心后都可见到细胞，状态很好。其实你可以观察，如果你收集的细胞状态好的话，贴壁的时间就早，90分钟分离就可以了，细胞悬液里大部分为心肌细胞，如果消化的不好，90分钟后成纤维细胞也不能完全贴壁。建议你从0.06%的酶浓度开始做起，或设几个浓度找出最佳条件，一定要控制好37度的环境，很重要（可以在孵箱中进行），10分钟，收集除第一次的细胞悬液。过筛网不是必要条件，我每次都做，是为了计数种板更准确些。

作者: kswl870 时间: 2012-7-31 13:59

不好意思，忽略了一个问题：你用什么配胰酶?

要用分离专用的缓冲液配制，不含钙离子。配制时先调PH值，再加入Herpers液。我现在记不住组成，上班时看了再告诉你。

太低浓度的胰酶，消化时间延长，做久了好象有点烦，对吗？

作者: pengke1983 时间: 2012-7-31 13:59

要是麻烦，直接用NaOH调节pH也行。

作者: kswl870 时间: 2012-7-31 14:00

QUOTE:

原帖由 pengke1983 于 2012-7-31 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要是麻烦，直接用NaOH调节pH也行。

-----调PH值用0.1M的HCl，或0.1M的NaOH，调至7.2-7.4，但HERPERS要后加，否则已经缓冲了，再调很困难。要注意渗透压。

作者: mysmdbl 时间: 2012-7-31 14:00

谢谢各位的帮忙！
我是用d-hank's液配制的胰酶配好之后调的PH值，7.3-7.4之间吧。不知道有没有问题。

作者: kswl870 时间: 2012-7-31 14:00

Ca++呢？这是很主要的问题。
还有你如何保持在消化过程（几个小时）中的PH值稳定？

作者: kswl870 时间: 2012-7-31 14:01

我使用的心脏细胞分离缓冲液，是从国外文献中引用的，效果不错，第一次实验进行分离，差速帖壁后纯度约70%，第二次达到90%左右。供你参考：（建议你别使用d-hank's液）

NaCl: 120mM
NaH2PO4·2H2O: 1mM
Glucose: 5.5mM
KCl: 5.4mM
MgSO4·7H2O: 0.8mM

调整PH值到7.2~7.4，在1000ml中，加入Hepes液20ml。

作者: tieshazhang 时间: 2012-7-31 14:01

楼上
你说的先把缓冲液调整到7.2~7.4，可Hepes是酸性的，加入之后缓冲液即变成酸性的啦

作者: kswl870 时间: 2012-7-31 14:02

Hepes液20ml是买Gibco公司的成品，加入后PH值少有变化。相对稳定，可能与加入的对象原来就是缓冲有关，同时是在1000ml中加20ml，量不大。

但不加Hepes，长时间暴露会PH值不稳定。看一下不含Hepes液的1640培养在暴露时，PH值的变化你就知道了。

作者: 969 时间: 2012-7-31 14:02

你直接加PBS配就可以了
从你后面描述的看是根本就没有消化下来，建议加胶原酶，胰酶浓度可低点，一半0.125%足够了，组织块要剪小，不然不好分离，可以边摇晃边水浴，必要的时候加大力度，不要怕细胞被摇死，一定要把那些被细胞破损释放出来的DNA包膜包住的组织块和细胞块摇散，要是分都分离不出来还不如不消化；还有就是血清的问题，不知道你是什么小牛血清，如果是一般国产的建议加胎牛，我曾经做过对比，小牛组的连成纤维都不贴壁，而胎牛组只需要差速分离1个小时就有心肌贴上去了

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