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标题: [求助]用流式细胞仪测细胞周期 [打印本页]

作者: october7    时间: 2012-8-1 14:59     标题: [求助]用流式细胞仪测细胞周期



用流式细胞仪测细胞周期怎么做?需要特殊试剂盒吗?
其结果是每期细胞在所有细胞中的百分比吗?

多谢

作者: baidukk    时间: 2012-8-1 15:00

用PI染色

一 PI单染色法
基本原理
  其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性,主要包括以下几个方面:
1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器
PBS溶液(配制方法见附录);
PI染液:将PI溶于PBS(pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇
400目筛网
流式细胞仪
实验步骤
1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min,弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小时。
4. 离心弃去固定液,3mlPBS重悬5min。
5. 400目的筛网过滤1次,500—1000r/min离心5min,弃去PBS。
6. 用1ml PI染液染色,4℃避光30min。
7. 流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光,激光光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
8. 结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
注意事项
  细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

作者: vvmmoy    时间: 2012-8-1 15:00


我做的不用试剂盒,就是将细胞收集,70%乙醇固定过夜,用PI染色,然后去检测。结果是G0/G1期,G2/M期,S期细胞的百分比
因为是根据PI染色的荧光强度来判断DNA的含量的,所以会得到2N(对二倍体细胞而言),4N和处于这两个数值之间DNA数量的细胞个数。

作者: dotaaa    时间: 2012-8-1 15:00


不用RNA酶?

作者: 园丁##    时间: 2012-8-1 15:01

用!
当然,空气中有很多RNA酶,不加的话,CV值等差一点!

作者: HP007    时间: 2012-8-1 15:01


RNA酶是PI染色必需的,我们一般我把它当作PI染色的步骤呵呵

作者: dog002    时间: 2012-8-1 15:02

据我做流式的经验来看,细胞固定的时间越长,cv值就越大,流式图就越难看,我们一般固定半小时至2小时,如条件允许可不固定,直接上机检测,大家可试试看
作者: jujuba    时间: 2012-8-1 15:06


请教,整个操作要不要无菌?多谢。PI染液需不需要过滤?

作者: october7    时间: 2012-8-1 15:06


不需要无菌
PI染液不需要过滤,但是染色之后上机检测的细胞悬液需要用200目的塞网过滤,因为PI染液很粘,容易堵塞机器,所以流式上机一般先做表型,最后做凋亡、周期等。检测完毕需要注重流式机器的清洗

作者: Ao7    时间: 2012-8-1 15:07


细胞固定后可以多长时间以内再染色检测仍可以呢?仪器有一点问题不能马上检测,3天以内还可以吧?谢谢!





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