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标题: [求助]质粒转染的问题 [打印本页]

作者: woshituzhu 时间: 2012-8-13 11:02 标题: [求助]质粒转染的问题

我用脂质体进行质粒转染后，第二天细胞全部死了，请教是什么原因？我的操作都是按说明书进行的，质粒也是我按说明书提取的。

作者: 831226 时间: 2012-8-13 11:03

可考虑以下原因：
1.培养基必须在转染24小时前换用无双抗的。
2.质粒虽然是按说明书提取的，但要看清楚质粒提取试剂盒是否可以去除内毒素。
3.如果选用Invitrogen Lipofectamine 2000，它提供的参考步骤并不一定是你选用的培养板规格，须参照后面的列表．
4.培养板非常容易污染，必须排除微生物污染的可能．
5.可以考虑转染5小时左右吸去转染液体，换用含血清的培养基继续培养．
6.转染前你培养了多少时间？如果进行顺式转染，必须在细胞生长达到７０－８０％再进行转染

作者: toy 时间: 2012-8-13 11:03

试试把脂质体剂量减小点，我感觉说明书上推荐的浓度通常偏高，你可以用较小的剂量试试。
当然前提是，确实没有污染或者上面rmwdxy9说的问题。
祝你好运！

作者: woshituzhu 时间: 2012-8-13 11:03

我是用的Invitrogen Lipofectamine 2000转染,是参照后面的列表,我的培基一直没用抗生素,转染时细胞已长满了.同板没转染的长的很好,我是转染12小时后准备换含血清培基是发现全死了,质粒提取试剂盒是Promega的.不知还有哪些该注意的?不知各位在质粒提取后怎么处理的?我是在提取后先用无水乙醇沉淀(-20度)两小时,然后用70%的乙醇-80度过夜.离心吹干后用水溶解,不知是不是最后没吹干残留乙醇的缘故否?我吹了2小时都不怎么干就加水了.请各位指教.

作者: rxcc33 时间: 2012-8-13 11:04

个人认为你还可以考虑以下方面：
1.请确认你的Lipofectamine 2000是否已经过期，经过我们实验室的实践：尽量使用开封半年内的Lipofectamine 2000，因为过了半年后，就算没有过失效期，但是细胞毒性大大增加，而转染效率却大大下降。
2.确认你在使用Promega质粒提取试剂盒是使用了内毒素去除树脂（Endotoxin Removal Resin）。
3.按照Promega质粒提取试剂盒的protocol，在第19步加入nuclease-free water后直接放入-20或-80度冻存就可以，我们没有另外沉淀。
4.去除质粒提取中的酒精可以试用下面的方法：将Ep管倒置在灭菌的滤纸上，大概10-20分钟后就可以干了，注意不要时间过长，否则太干了，不太好溶解。
5.你可以尝试适当减低转染试剂的用量，并在转染5小时时观察细胞情况，并且换10％FBS的培养基，看看情况怎么样，因为转染液对细胞的损伤非常大。
祝您实验成功！

作者: 101010 时间: 2012-8-13 11:04

各种培养细胞或细胞株对转染试剂的毒性敏感程度不一样, 脂质体的毒性大一些, 如果是转染试剂的问题,建议使用毒性低一些的转染试剂,如阳离子聚合物转染试剂，可以试试梭华-sofast。

作者: xingyi08 时间: 2012-8-13 11:05

我们用Invitrogen Lipofectamine 2000转染时，量全部都是减半的、感觉说明书上推荐的浓度过高了。

作者: woshituzhu 时间: 2012-8-13 11:05

呵呵，请问什么叫顺式转染呢？

作者: woshituzhu 时间: 2012-8-13 11:06

请问你提到的顺式转染是什么意思呢？

作者: DDD 时间: 2012-8-13 11:07

QUOTE:

原帖由 woshituzhu 于 2012-8-13 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问你提到的顺式转染是什么意思呢？

瞬时转染～～

作者: 13775112843 时间: 2019-11-22 10:30

楼上面各位回答的都非常好，我个人认为，lipo的转染试剂毒性略大，不妨换个毒性低的RFect看看，用着还不错的。仅供参考，祝好运！

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