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标题: [讨论帖]关于96孔板铺细胞的几个问题 [打印本页]
作者: yychen    时间: 2012-8-14 11:52     标题: [讨论帖]关于96孔板铺细胞的几个问题


我的实验室经常做mtt,我的问题是细胞铺不匀,今天已经看过以前大家发的有关96孔板铺细胞的问题了,可是还是有疑问,想结合自己的经验拿来与大家讨论一下:
1, 我觉得稀释前把细胞吹匀很重要,但是吹的时间长会不会对细胞有损伤呢?
2, 如果一次是铺一个板的话,稀释好的细胞悬液一般是10ml,这时候吹细胞用枪是不可能的了,我用2ml的吸管吹过,觉得劲很大,不太好使就改用那种有又长又细嘴的滴管吹(听师兄说好象是专门用来吹细胞的),结果吹了至少有十几下,就铺板了,我们是拿枪加,每孔100ul,可是后来加完觉得好象还是不匀加的过程中也有摇晃,看有人说加的过程中也要吹<可是那样要增加很多操作,会不会污染啊?吹的时候是不是不把吹管拿出来,加几个孔就吹两下这样子啊?
3. 有很多人建议用排枪,我们有排枪,可是没有那个配套的装细胞悬液的艚啊?请问有人知道在哪卖吗多少钱啊?有人建议用96孔板的盖子,（我门加DMSO的时候是用那个)可是那个盖子装的了10ml 的液体吗??而且面积那么大很不好操作啊感觉?希望有用盖子操作的前辈指点一下,仔细介绍一下实验操作!谢谢
4, 铺完板后到底要不要晃呢?或者在机器上振荡??有人说要晃,有人说千万不要晃!我的唯一经验是如果振荡好象细胞很容易集中到中间,长成驮,几天长成两层,可是不晃细胞好象很容易在四周.所以不知道到底要怎么办>我猜想是不是跟振荡的时间和力度大小有关呢??
5 关于细胞浓度的问题:我铺板用的是最普通的HELA细胞,稀释成1*10^4,每孔100ul,等于每孔是1000个细胞,可是我按这个稀释加进去的细胞都有点少,通常对照才能长到0.7-0.8的样子,,处理数据最郁闷的就是加了药的比对照长的还好,我细胞是不是铺的太少了??吹细胞的管子会影响我的细胞个数吗?
6 最后讨论一下加DMSO 的问题,我们实验室有两中DMSO 一种是进口的,一种国产的,最后加DMSO 的时候都是用国产的,用排枪加,听同学说加进口的那种跟国产的颜色不一样,不知道这个会不会很影响实验结果??
7 加的药有颜色应该不会很影响实验结果吧?不知道大家最后倒掉mtt加DMSO之前里面剩的液体要怎么处理?我们是倒置在卫生纸上吸一下,我有试过用书上的方法用滤纸小心的吸里面的液体,感觉会很容易吸到里面兰色的孔底的东西,害怕把细胞给弄下来,所以只好放弃.
8 感觉影响mtt的结果的因素太多了!希望做的好的有经验的前辈可以给点意见!!刚开始做实验,不知道说的对不对,希望大家都来讨论哈!!!
作者: bohe221    时间: 2012-8-14 11:53

5 关于细胞浓度的问题:我铺板用的是最普通的HELA细胞,稀释成1*10^4,每孔100ul,等于每孔是1000个细胞,可是我按这个稀释加进去的细胞都有点少,通常对照才能长到0.7-0.8的样子,,处理数据最郁闷的就是加了药的比对照长的还好,我细胞是不是铺的太少了??吹细胞的管子会影响我的细胞个数吗?

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个人感觉你接种浓度小了！一般而言，肿瘤细胞都用5*10^4，200ul/每孔，接种。你可以算一下，你接种的细胞数少了一个数量级的。而且，Hela细胞体积有点大，细胞数你可以相对往下调整一下。细胞数少，是你结果偏小的主要原因，这样误差就更大了，不利于分析的。
作者: bohe221    时间: 2012-8-14 11:54

6 最后讨论一下加DMSO 的问题,我们实验室有两中DMSO 一种是进口的,一种国产的,最后加DMSO 的时候都是用国产的,用排枪加,听同学说加进口的那种跟国产的颜色不一样,不知道这个会不会很影响实验结果??

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这个应该影响不大，而且你每次都是用国产的，就可以消除这种差别的。但要注意，加DMSO后，反应时间长短，将会影响检测结果的。所有每次操作最好控制差不多相同的时间。
作者: bohe221    时间: 2012-8-14 11:54

7 加的药有颜色应该不会很影响实验结果吧?不知道大家最后倒掉mtt加DMSO之前里面剩的液体要怎么处理?我们是倒置在卫生纸上吸一下,我有试过用书上的方法用滤纸小心的吸里面的液体,感觉会很容易吸到里面兰色的孔底的东西,害怕把细胞给弄下来,所以只好放弃.

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加的药有颜色会影响检测结果的，而且用的是不是同一批96孔板也会影响检测结果的。

加DMSO之前，我一般是用枪吸出里面的液体，将96孔板稍稍倾斜，用刚好是你加液量的枪容量去吸，一般不会吸出来孔底的兰色结晶。比如：加200ul的细胞悬液，吸的时候枪的容量就调到200，不要用1000的容量去吸！

祝实验顺利！
作者: 铜雀    时间: 2012-8-14 11:56


我做过几次MTT，试着解答你的几个问题，共同讨论：
1, 我觉得稀释前把细胞吹匀很重要,但是吹的时间长会不会对细胞有损伤呢?
答：细胞吹匀很重要，吹得时间过长对细胞也有损伤。原因一是机械损伤，二是长时间将培养液暴露在空气中，会变碱，细胞耐酸不耐碱，应该算是化学损伤。

2, 如果一次是铺一个板的话,稀释好的细胞悬液一般是10ml,这时候吹细胞用枪是不可能的了,我用2ml的吸管吹过,觉得劲很大,不太好使就改用那种有又长又细嘴的滴管吹(听师兄说好象是专门用来吹细胞的),结果吹了至少有十几下,就铺板了,我们是拿枪加,每孔100ul,可是后来加完觉得好象还是不匀加的过程中也有摇晃,看有人说加的过程中也要吹<可是那样要增加很多操作,会不会污染啊?吹的时候是不是不把吹管拿出来,加几个孔就吹两下这样子啊?
答：我觉得不是增加操作就会污染，我通常是加完一排孔会吹几次。
4, 铺完板后到底要不要晃呢?或者在机器上振荡??有人说要晃,有人说千万不要晃!我的唯一经验是如果振荡好象细胞很容易集中到中间,长成驮,几天长成两层,可是不晃细胞好象很容易在四周.所以不知道到底要怎么办>我猜想是不是跟振荡的时间和力度大小有关呢??
答：我通常是上下轻轻震动几次，细胞四周生长对药物要比中心多层积聚生长敏感一些
5 关于细胞浓度的问题:我铺板用的是最普通的HELA细胞,稀释成1*10^4,每孔100ul,等于每孔是1000个细胞,可是我按这个稀释加进去的细胞都有点少,通常对照才能长到0.7-0.8的样子,,处理数据最郁闷的就是加了药的比对照长的还好,我细胞是不是铺的太少了??吹细胞的管子会影响我的细胞个数吗?
答：你的细胞数的确不多，24hMTT时，我通常种到10000个/孔左右，因为细胞数少，细胞可能不处于对数生长期，不能反映正常的对药物的作用。如果细胞数过多也不行，因为细胞数过多，药物浓度达不到饱和，实际药物浓度和你设计的药物浓度不一致。所以细胞数要有你药物作用的时间和细胞的实际情况灵活决定。
6 最后讨论一下加DMSO 的问题,我们实验室有两中DMSO 一种是进口的,一种国产的,最后加DMSO 的时候都是用国产的,用排枪加,听同学说加进口的那种跟国产的颜色不一样,不知道这个会不会很影响实验结果??
答：不要一次用国产的，一次用进口的，一直用一种就可以啦，颜色不一样没有很大影响，MTT最后求的是细胞存活率，趋势应该是一样的

7 加的药有颜色应该不会很影响实验结果吧?不知道大家最后倒掉mtt加DMSO之前里面剩的液体要怎么处理?我们是倒置在卫生纸上吸一下,我有试过用书上的方法用滤纸小心的吸里面的液体,感觉会很容易吸到里面兰色的孔底的东西,害怕把细胞给弄下来,所以只好放弃.
答：药物有颜色可能会对结果有影响，因为你不知道药物在490nm或570nm时的光吸收值有多少，对照如果也用有同样颜色的溶剂作对照可以减少影响。我从来没有倒掉过MTT，我都是用移液器吸的，加多少吸出多少，移液器头贴近孔壁的下缘，基本上剩不下什么液体拉。
8 我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。
作者: kuaizige    时间: 2012-8-14 11:56


1.装细胞悬液的容器叫V型加样槽，可以高压灭菌，重复使用，一个25元。
2.hela细胞在96孔里接种的密度大约是3*10^4，这样如果培养48-72h密度刚好。我做过试验验证。
3.为了防止细胞在孔里生长不均，可以提前把96孔板放进培养箱几个小时，然后再取出加细胞，加后 静置5分钟，再放入培养箱。
4.最后是吸出培养液和药物混合液，然后才加MTT，所以药物颜色应该不会对实验结果造成影响。
作者: yychen    时间: 2012-8-14 11:57


谢谢各位前辈给我的回帖和建议!!."为了防止细胞在孔里生长不均，可以提前把96孔板放进培养箱几个小时，然后再取出加细胞，加后 静置5分钟，再放入培养箱。"这是为什么啊?呵呵,有人知道原因吗?
为什么要提前放进去呢?
作者: rxcc33    时间: 2012-8-14 11:58


我们实验室用的是VWR的这个， 叫做reagent reservoir，$88.34/200个。
应该是一次性的，不过我们也重复用几次，酒精冲洗后紫外线消毒过夜。
cuturl('http://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?object_id=0065154&resultNum=0')

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1.装细胞悬液的容器叫V型加样槽，可以高压灭菌，重复使用，一个25元。
作者: orangecake    时间: 2012-8-14 12:01

8 我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。

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请指教，我觉得加药应该垂直于液面的中心加啊！！
作者: yychen    时间: 2012-8-14 12:02

8 我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。

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这个我想了很久也没想出来
作者: idea2011    时间: 2012-8-14 12:02


其实如果想省钱的话,直接用96孔板的包装盒(塑料的那个)就行
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-8-14 12:02

3.为了防止细胞在孔里生长不均，可以提前把96孔板放进培养箱几个小时，然后再取出加细胞，加后 静置5分钟，再放入培养箱。

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请教一下，这个是什么原理啊，我做24孔版的是后也是细胞容易聚到中间，我的做法是把板子左右倾斜后静止，效果一般
作者: gogo    时间: 2012-8-14 12:03


我以前也存在细胞不均匀的问题，影响结果真的很头疼。

现在我是竖着加细胞，横着给药～～呵呵

不是后面两位理解的手势问题噢，试想，假设存在细胞吹不匀的问题，除了注意吹匀外，按照这种方法可以平均你的实验结果，不知道这样说对不对，或者可不可以理解？：）

1、我一般做Hela都是1×10～5量铺的板，吹细胞就用直头吸管，轻微的吹吸二三十下，一般来说，加一块板的过程中细胞还是挺均匀的
2、药物颜色我认为对结果没什么影响的，最后吸干净是一样的
3、最好不要用覆板法倒液体，细胞有可能会倾出，而且不容易倒干净，对于有颜色的药物实验来说就肯定影响结果了
4、DMSO，应该没什么关系，我以前用的进口的，现在用的国产的。颜色确实存在不同，进口的稍黄一些，气味也较重

最后要说，MTT实验本来就是精确度不高的实验，大家只有细化自己的每一步，减少操作误差，才能提高实验的准确性了，祝大家都实验顺利吧～～
作者: yychen    时间: 2012-8-14 12:04


谢谢楼上的意见,我前天按前辈的说法加细胞前提前把96孔板放到温箱里了,加完后左右上下晃了3下,然后静置,今天镜下观察还可以呵呵,比以前好多了,细胞也没有集中在四周或是中间,虽然还没有出结果可是觉得铺的应该比较均匀,(我是做72h)的,只是最后我们加mtt是不把里面的培养基和药吸出来的饿,(其中是100ul细胞悬液,100ul药,加50ulmtt)这样我最后家DMSO之前就有250ul的液体在孔里了,我门的枪是200的 我想不出除了倒还有什么办法把液体弄出来呢?要不吸两次?
作者: 66小飞侠    时间: 2012-8-14 12:04

如果你觉得细胞铺板不过均匀，你不妨用枪头稍微吹打几下，个人觉得效果还不错！
作者: yychen    时间: 2012-8-14 12:05


一共就100ul,不敢吹了呵呵,不过我现在的主要问题是怎么把液体弄出来呢?
作者: caihong    时间: 2012-8-14 12:09


我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。

实在不明白这横竖是什么意思，望赐教！
作者: jujuba    时间: 2012-8-14 12:09

我觉得不管是96孔板还是24孔板,加细胞悬液以前最好还是加一点培养液进去,能盖住底部就好,这样效果会好一点
作者: 乌贼老弟    时间: 2012-8-14 12:10

对不起，我没有说清楚，应该说每一横排从左到右的顺序加细胞悬液，加受试物是 每一竖排从上到下的顺序。希望这次表达清楚拉。原因是加细胞悬液时，随着时间的延长，细胞要下沉的，密度不可能绝对的均匀，如果加了5横排的细胞悬液，很有可能最后一横排要比第一排细胞数目要多，如果再一横排一横排的加受试物，可能不能表现正常的结果，如果竖排加受试物的话，因为要求均值，影响相对的会缩小。
作者: yychen    时间: 2012-8-14 12:10


谢谢楼上群友的解释,今天我的MTT结果出来了,,这次按照各位大侠的指点细胞是比较韵了,可是我的细胞数铺少了以前我们都是做4天,这次我铺了3*10的4,下午5点种的细胞,第三天早上就加MTT了,(也就是说不到72小时,差了7,8个小时) ,结果我的对照才长到0.7-0.8的样子,真是气四我了!!也不知道是不是我的细胞状态不行啊,长这么慢!以前不也长挺快吗,



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