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标题: [讨论帖]常用原代动物细胞培养 [打印本页]

作者: 一叶 时间: 2012-8-16 12:39 标题: [讨论帖]常用原代动物细胞培养

常用原代动物细胞培养
鉴于原代细胞培养是细胞培养中的一个难点问题(尤其是一些难养的细胞)，我们打算建立原代细胞培养技术资料库，最后，我们将整理成细胞版的精华帖，以方便群友们使用。请群友们支持，细胞培养高手踊跃参加！

作者: 一叶 时间: 2012-8-16 12:40

一、上皮细胞：
1.表皮
2.气管上皮
3.肺泡II型上皮
4.口腔粘膜上皮
5.肝细胞
6.前列腺上皮
7.乳腺上皮
8.肾小管上皮
9.子宫颈上皮

二、神经外胚层细胞培养
1.神经细胞
2.神经胶质细胞

三、内皮细胞培养
1.脐静脉内皮细胞培养
2.主动脉内皮细胞培养
3.脑微血管内皮细胞培养
4.肺微血管内皮细胞培养

四、肌肉细胞培养
1.乳鼠心肌细胞培养
2.成年大鼠心肌细胞培养
3.平滑肌细胞培养
(1)脐动脉平滑肌细胞培养
(2)主动脉平滑肌细胞培养

五、骨组织细胞培养
1.软骨细胞
2.成骨细胞
3.破骨细胞

六、成纤维细胞培养
1.胚肺成纤维细胞培养
2.心脏成纤维细胞培养

七、巨噬细胞培养
1.腹腔巨噬细胞培养
2.肺泡巨噬细胞培养
3.肝枯否细胞培养

八、脂肪细胞

九、肝星状细胞培养

十、免疫细胞培养

十一、肿瘤细胞原代培养

另外，也欢迎大家补充其它的原代细胞培养。

作者: summerxx 时间: 2012-8-16 12:41

我要培养人胸腺基质细胞（上皮细胞为主），也算一个

作者: 园丁## 时间: 2012-8-16 12:41

乳鼠心肌细胞培养方法详述

一．材料
所需液体：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
试剂 Trypsin, SDS, DMEM 均购于 Sigma Chemical Co.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司，其余均为国产分析纯。
取鼠：标准SD大鼠，鼠盆用棉铺好，取鼠。
物品：白大衣、饭盒
小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）
瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]
250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]
500ml烧杯1个，用作废液缸。
50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）
三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）
离心管及帽（12-14个），两个试管
吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）
台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用 2个、微量加样器 1000ml及500ml
以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。
二．培养方法：
事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
具体方法为：
1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。
2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。
3．用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。
4．把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一定要注意监控。
5．温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升
6．10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。
7．接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，打开关。
8．同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。
9．取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。
10．消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。
11．离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。
12．取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。
（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）
三．讨论

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06％浓度的胰酶对细胞损害较小，比起一些文献记载的0.15％浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时间较长，所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别[1]。

心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在一天左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好，DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充[2]。

我们也拍摄了很多细胞的图片，效果很清晰，但目前没有在手头上，以后有机会补上。

四．参考文献
1.Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2+]I transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997；319：91-9
2.Animal cell culture methods edited by Jennie P.Mather and David Barnes.--California:Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cmSBN0124800408:CNY619.26

作者: kewanqi2011 时间: 2012-8-16 12:42

小鼠树突状细胞的原代培养，很费劲，但养成了。有疑问就请与我联系。

作者: nn255 时间: 2012-8-16 12:42

我用贴块法培养动脉粥样硬化患者（一般60岁以上）的动脉平滑肌细胞，现在正在进行中，原代已经有了，现在没有传代细胞。我可以参加吗？

作者: bananapeople 时间: 2012-8-16 12:43

也说说我的试验结果吧，脐静脉内皮细胞。

图片附件: 33213970.jpg (2012-8-16 12:43, 36.92 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13370

作者: jujuba 时间: 2012-8-16 12:44

可否加上原代胰岛的培养？
我可以提供原代海马细胞的培养方案，还没有整理出来电子版，有疑问可以联系我。

作者: 一叶 时间: 2012-8-16 12:44

只要是很稳定可靠的原代细胞培养实验方法都可以报名，不过必须严谨一些！

作者: u234 时间: 2012-8-16 12:44

原代胚胎成纤维细胞培养

一、实验器材：手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、实验试剂：无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞（MEF）生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

三、实验动物：孕期14至16天的孕鼠

四、实验步骤：
1. 处死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开，用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开，露出子宫，最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉PBS，再重复此步骤一次，留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中，用手术刀片将其细细切碎。
3.用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体，放在15ML离心管中，4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，加10ML胰酶，重悬沉淀，放37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4.将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中，用200目尼龙滤网过滤后，1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML　MEF生长培养基洗涤两次（此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤，结果无差别）。
5.细胞沉淀用15ML生长培养基悬起，细胞计数（八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞）。
6.3×106细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中，接种到200ML的培养瓶中。
7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
8.细胞长满后，先用PBS冲洗，倒掉，加胰酶消化（此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟），按1：5传代。
9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存。（冻存液要现配）
五、实验结果：见下图

六、讨论：1.原代培养，一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。
3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。
4. 消化细胞时间不要过长。

图片附件: 52656852.jpg (2012-8-16 12:45, 44.7 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13371

作者: guagua 时间: 2012-8-16 12:45

偶也报个名：
人神经母细胞瘤的原代培养、裸鼠荷瘤实验以及裸鼠肿瘤的原代培养，偶全做过，都很理想。

作者: yapuyapu 时间: 2012-8-16 12:45

斑竹:你是一个有创见的斑竹,只是我刚开始一个新的领域(对我而言):外周血内皮祖细胞,挺困难的,刚进入正轨,提议你把这方面的也加进去,因为目前有大量的文献和工作涉及这方面,在组织工程,基因治疗,缺血性血管疾病的治疗等方面有极大前景.到时我可以加上我的体会.

作者: 泡泡 时间: 2012-8-16 12:46

报名：我养的家兔和人的椎间盘细胞，为类软骨细胞，原代培养半年多了。申请参加。

作者: 一叶 时间: 2012-8-16 12:46

斑竹:你是一个有创见的斑竹,只是我刚开始一个新的领域(对我而言):外周血内皮祖细胞,挺困难的,刚进入正轨,提议你把这方面的也加进去,因为目前有大量的文献和工作涉及这方面,在组织工程,基因治疗,缺血性血管疾病的治疗等方面有极大前景.到时我可以加上我的体会.

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偶不是那个有创见的斑竹啊，不过你说的是对的外周血内皮祖细胞在组织工程里用的很多

作者: one 时间: 2012-8-16 12:47

能否加上原代乳鼠骨骼肌细胞培养？

作者: bgf5 时间: 2012-8-16 12:47

人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）亲自做过，
鼠胸主动脉培养亲自做过。

这两种可以来写。

3.脑微血管内皮细胞培养
4.肺微血管内皮细胞培养
看过，自己没有做过。

原代肿瘤细胞看实验室实验技术师做过。

作者: plaa 时间: 2012-8-16 12:48

有没有哪位养过原代胰岛B细胞啊？

作者: moonlight45 时间: 2012-8-16 12:49

对于楼上介绍的：乳鼠心肌细胞培养方法详述，我也来谈谈自己的一点经验：

1。取材时：直接将小鼠浸入75%的酒精小烧杯中10秒钟左右，然后将小鼠用镊子夹出，放入超净台内准备好的灭菌平皿中，这样一次将10只小鼠全部浸泡消毒后，全部操作就在台内完成。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，然后用75%的酒精棉再次消毒胸腹。小眼科剪沿胸骨屏左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，一颗扑通扑通跳动的小心脏就直接跳出来。然后用弯头眼科镊夹住心脏中部，就可以直接将心室部分夹下，放入冰浴的D-Hank's液中。然后在分离残血和结缔组织，剪碎组织。

2 消化这一步骤：参考文献后，我选用80U/ml的II型胶原酶和0.5mg/ml的胰酶的配方进行复合消化。这样在消化过程中，组织块很容易消化。否则由于心肌致密的组织结构，胰酶要消化不下8次才能完全将组织块完全消化。如果每次消化时间是15分钟的话，基本上3次消化就可以完全了。

3，尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。

作者: jujuba 时间: 2012-8-16 12:50

有谁成功建立过小鼠皮下种植瘤模型？传授点经验及教训。不胜感激！

作者: zhezhe 时间: 2012-8-16 12:51

大鼠皮层神经元原代培养

液体配制：
硼酸硼砂缓冲液：0.05M四硼化钠45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；
胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡盐液定容至100ml
所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干备用。

操作步骤如下：
1。  孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2。  在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3。  随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。

4。  用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5。  将所收集的上清经200目筛网过滤。

6。  过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。

7。  细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

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作者: zhezhe 时间: 2012-8-16 12:52

『注意以下几点』

1。上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。

2。上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择孕13d 左右的小鼠。

3。神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够！！

4。在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中最好还是用同一来源（厂家）的玻片。

5。如果有B27和neurobasal培养基，那么就方便了（不用加AraC）－－
1）把细胞悬液用（DMEM＋20％FBS）悬浮，种到培养皿上6－12h后，全量换成2％B27的neurobasal培养基，继续培养，3d半量换液。
2）把细胞悬液用直接用2％B27的neurobasal培养基悬浮接种。
3）可以用新生1d内的胎鼠皮层直接培养。

作者: 101010 时间: 2012-8-16 12:52

胶质细胞培养（astrocyte, oligodendrocyte）

取材及胶质细胞的混合培养
1。  P2 SD大鼠经低温麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2。  剪碎组织成1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3。  随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的离心管内终止消化液作用5min。

4。  吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5。  所得上清于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入25cm2培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3d进行全量换液。

摇床振摇分离星形胶质细胞和寡突胶质细胞
培养至7～10天，换液后放入孵箱继续培养24h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280r/min摇动18h。此时寡突胶质细胞90％以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

分离培养悬液内的寡突胶质细胞
吸出悬液至离心管内950r/min离心10min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×105/cm2种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。24h后换成DF12＋N2的无血清培养液，此后每三天半量换液1次。

瓶底星形胶质细胞的继续培养
25cm2培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks液洗2次后常规传代，以1.5×105/cm2种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1次。

作者: leifengta 时间: 2012-8-16 12:52

动脉粥样硬化患者VSMC的提取：
实验材料：眼科剪刀1把眼科镊子2把 1×PBS约200ml M199培养液离心机 5ml小皿 10ml大皿
实验步骤：
1、  在超净台内用10ml的离心管分装5ml的1×PBS（已高压灭菌）。
2、  手术台上取患者发生动脉粥样硬化改变的病变动脉，分放入准备好的PBS中，拿回实验室在超净台中，无菌条件下剥去外膜，用手术刀片刮去内膜，留下中膜并将其剪成1×1mm大小组织块。
3、  消化法：PBS清洗组织块后并将其转移入10ml的离心管，加入0.125％胰酶消化37℃30分钟，室温吹打100分钟或者振荡器振荡100分钟，待组织块变小且消化液变粘时，收集消化液配平以1500转/分钟离心10分钟后，收集细胞种植于预先加入M199培养液的5ml小皿中放入37度5％CO2的培养箱中。
4、  贴块法：PBS清洗组织块后移入已准备好的10ml大皿中，块间距为0.5cm，放入37度5％CO2的培养箱中，3小时后，待组织块贴壁后，再加入2ml培养液后放回37度5％CO2的培养箱中。
注意：最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下，勿使组织块吹下。
5、  随后每3天予以半量换液。
6、  一周后可见组织块周围有细胞爬出，大约3周后80％融合。
因本人系非细胞生物学专业人员，本细胞培养时间又很短，多次进行细胞传代未成功，还望有经验的专家指点。

作者: pengke1983 时间: 2012-8-16 12:53

合成培养液的配制re制剂的制备
一、原则：1、暂不用的制剂-20度冰冻（含抗生素），
　　　　　2、一周内要用的，4度冷藏。
　　　　　3、一般用三蒸水制备。
4、解冻：
5、双份的思想
一、胎牛血清的准备：零下15度－正4度－室温－56度30分钟灭活。一般已灭菌处理过，不需过滤。

二、合成基本培养液的配制：
1、制备三蒸水
2、加温至15~30度
3、加入干粉，搅之使溶
4、加入NaHCO3(多为2mg?)调节PH值。
5、HEPES少许
6、必要时用1NHCL或1NNaOH调节PH（因滤过时PH可能受影响）
6、加水至最终量
7、以0.22微米以下微孔滤膜滤过消毒。

三、抗生素的配制：
1、青链霉素的配制：
2、庆大霉素的配制：2ml(8万u)庆大加NS至20ml, 抽1ml, 加99mlNS, 制成40u/ml之工作液。或1ml(4万u)庆大加NS至1000ml, 配制好后-20度冰冻。
3、使用前解冻后加。

四、生长培养液的配制：
1、基本培养液（使用前解冻后加） 80%　－　90%
2、血清（多为小牛血清，使用前解冻后加）10%　－　20%
3、抗生素（青霉素100U/ml和链霉素100ug/ml）（使用前解冻后加）

五、缓冲液的配制：
1、HEPES液：47.6g加三蒸水200ml。
2、D-hanks液：KCL(0.4g/L)、KH2PO4(0.06)、NaCL(8.0)、NaHCO3(0.35) 、Na2HPO4·7H2O(0.06g OR Na2HPO4·12H2O 0.08g)、酚红(0.02)。注：单位(g/L)
3、高温消毒15磅30分钟
4、保存见总原则。

六、胰蛋白酶：
0.25%
过滤。

七、胶原酶I：
2mg/ml
过滤。

作者: 轰轰 时间: 2012-8-16 12:53

过滤
1.大型过滤(超过100ml的过滤)
1.1器械：
漏斗 - 滤器(不锈钢，带弯曲气嘴-橡胶管-CO2钢瓶) - 滤膜 - 橡胶管(耐高温) - 滴管 - 分装瓶

漏斗
滤器(不锈钢，带弯曲气嘴, 便消毒)
滤膜
橡胶管(耐高温)
滴管

分装瓶(一般100ml)
瓶塞(耐高温)
培养瓶

滤器架(不锈钢)
橡胶管(接钢瓶)
CO2钢瓶(可调压？量？)
超净台
酒精灯
酒精缸
记号笔

1.2步骤：
1.2.1清洗、消毒分装瓶(一般100ml)，准备培养瓶
1.2.2配置工作液
1.2.3处理滤过装置
清洗、漏斗.滤器.橡胶管.滴管(蒸馏水)
处理滤膜(剪之使大小合适，三蒸水湿润后装入滤器，勿旋紧)
准备高压锅(加水至电热管水平以上)
放入高压锅(橡胶勿打折，否则膜破)
拧紧螺丝
打开电源，值守在旁
打开放气阀(待水沸后关闭)
气压上升至15磅以上时打开放气阀，待其下降一点后再关闭气阀。以免喷破滤膜。
气压上升至15磅以上后计时30分钟
断电
打开放气阀(否则爆炸)
冷后取出物品
放入温箱至干(立即要用者，无需置温箱，无需干燥)
1.2.4过滤
接好过滤装置
超净台内无菌原则
一人于超净台，将滴管悬于分装瓶口(勿碰)
另一人控制CO2钢瓶调节阀，使过滤速度适中
换瓶时可调小CO2，同时压闭橡胶管。
过滤完毕，取活计滤出液细菌培养。(无菌后才可使用)
标记保存滤出液。(一月内用者置4度，其余-5至-20度冰冻)
1.2.5清理
自来水清洗浸泡过滤装置
蒸馏水清洗过滤装置
烘干后小心保存

作者: 轰轰 时间: 2012-8-16 12:54

更换培养液步骤
准备：
培养瓶、带刻度移液管、大橡胶胶头
DMEM液
清洗
消毒
超净台下操作：
培养瓶至超净台
点燃酒精灯
处理瓶口(烧)
拨下瓶塞
处理瓶口(烧)
倒尽培养液(一说倒一半)
移液管加DMEM
处理瓶口(烧)
处理瓶口及瓶塞盖好
进CO2温箱

作者: 轰轰 时间: 2012-8-16 12:54

5更换培养液步骤
准备：
培养瓶、带刻度移液管、大橡胶胶头、(最好有离心管)
胰蛋白酶液、DMEM液
清洗
消毒
超净台下操作：
取原代瓶至超净台
点燃酒精灯
处理瓶口(烧)
拨下瓶塞
处理瓶口(烧)
倒尽培养液
加入0.25%胰蛋白酶
处理瓶口及瓶塞盖好
倒置显微镜下观察细胞至变形(此时还未脱落)
进超净台
倒尽胰蛋白酶(9分钟时)
滴管配有力胶头吸DMEM冲击贴壁细胞(18分钟时)
倒置显微镜下观察细胞脱落
传另一培养瓶
倒置显微镜下观察(有未脱落细胞)
用胰蛋白酶再作同样处理
略(同上)
处理瓶口及瓶塞盖好
进CO2温箱

作者: 轰轰 时间: 2012-8-16 12:55

7何时贴壁

一般第24小时后应贴壁，否则便不成功

2003-09-25 48小时后一定贴壁

但如标本量较小，可72小时后见贴壁(是否48小时？因星期天无法进肿瘤科实验室观察细胞)

12h后收集未贴壁细胞并计数
何湘平,纪占欣,刘传缋. 适用于膜片钳研究的新生大鼠骨骼肌细胞培养[J ] . 中国应用生理学杂志,1995 ,11(1) :83.

作者: IAM007 时间: 2012-8-16 12:55

开辟这个栏目是个很好的创意！我先提几点建议：
1）每个细胞不应该只有一个或两个人来完成，因为每个细胞的原代培养的方法有很多种，每个人的经验都值得借鉴，只要是成熟的方法都可以
2）每个细胞应该开辟分栏目，以后相关的内容或方法更新都可以及时地添加进去
3）应该考虑知识产权的保护，每个引用相关原代培养方法的战友都应该自觉地引用所学该方法的文献（如果有的话），这是对劳动者最基本的尊重
4）有很多细胞的原代培养是很多人很长时间摸索的经验，付出的艰辛和心血只有经历过的人才能明白，所以对于这些乐于助人的战友应该给予相应的更高的加分（按情况）

加分感谢是应该的，区分却比较难了

本人做过乳鼠海马及皮层神经元原代培养，大鼠脑微血管内皮细胞原代培养现在非常稳定，我来写这部分，神经元还是我们的老斑竹midas来吧！

最近有点忙，等我准备好了，一定给大家奉献上！希望对广大战友有帮助！

作者: IAM007 时间: 2012-8-16 12:55

还可以报到吗我培养过乳鼠的肺肾肌肉及肝, 鼠胚成纤维细胞. 有感兴趣的与我联系

作者: jujuba 时间: 2012-8-16 13:17

开辟这个栏目是个很好的创意！我先提几点建议：
1）每个细胞不应该只有一个或两个人来完成，因为每个细胞的原代培养的方法有很多种，每个人的经验都值得借鉴，只要是成熟的方法都可以

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我也考虑过这个问题，只是，太多方法就乱了，而且一般有比较经典的几种方法，太麻烦的方法就不去推广了。原则上要求最多两种，要是方法都很好的话，多点也是可以的。确实是这样，只要是成熟的方法都可以。

作者: kuohao17 时间: 2012-8-16 13:18

为什么没有骨骼肌卫星细胞呢？

作者: baidukk 时间: 2012-8-16 13:19

大鼠乳鼠成骨细胞，传代50次以上，贴张照片先。

图片附件: 29228823.jpg (2012-8-16 13:19, 31.53 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13372

作者: milkdog 时间: 2012-8-16 13:19

本人摸索了近半年的原代培养：供稿如下：
家兔椎间盘(intervertebral disc )细胞的体外培养方法
Material and method：
Material :
1.  培养皿、培养瓶、烧瓶、试管等。
2.  分离组织需要的眼科剪子、眼科镊子。
3.  5%CO2孵箱、PH计、95%氧气源。
4.  36电动恒温水浴。
5.  培养液、各种缓冲液及添加剂DMEM高糖培养基、Hank’s缓冲液、20%胎牛血清，转换生长因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰岛素-转铁蛋白-硒（10ug/mL胰岛素，5ug/mL转铁蛋白，和0.5ng/mL亚硒酸盐）青霉素100U/Ml，链霉素100U/ml 。
6.  消化液胶原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%台盼兰、0.25胰蛋白酶
Method 1 组织块法
1.  取材：空气栓塞法处死家兔后，在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM培养基（含双抗）。迅速带回到无菌超净台上。（注意事项：椎间盘位于相邻两个椎体之间，取材过程较为繁琐，要求动作迅速，争取在家兔死后半小时内完成，否则，该组织对缺氧耐受性差导致培养失败）。
2.  剪切：在超净台上，进一步将周围组织分离，用Hank’s液冲洗数遍，直到冲洗液透明为止。眼科剪刀将组织修剪为1~2cm3大小的小组织块，Hank’s冲洗干净。加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小，否则不容易爬出足够数量的细胞)
3.  接种：用吸管吸取小组织块入培养瓶底部，摆放均匀，一个25cm2的培养瓶可放置10-15个小组织块，翻转培养瓶，加入少量培养液。4~6小时后，待组织块充分贴壁后，再翻转回来（动作一定要轻巧，以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底）
4.  置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25胰蛋白酶传代分瓶。

Method 2 消化法
前面步骤同组织块法1，2。
（3）组织块再进一步剪切，此时培养液中最好不加血清。完毕后，加入消化液，移
入到10ml 离心管，培养箱内消化。每隔20分钟，用吸管吹打一次，观察液体有
否变浑浊，并取少量液体，在相差倒置显微镜下观察。0.4%台盼兰染色计算活细
胞数目。接种密度在105数量级。置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细
胞95%融合时，0.25胰蛋白酶传代分瓶

作者: milkdog 时间: 2012-8-16 13:20

Result:　IVD细胞为类软骨细胞，描述：单层细胞形状不规则，可呈三角形、多角形，梭形及不规则形。不同于成纤维细胞。附图：

图片附件: 99152385.snap.jpg (2012-8-16 13:20, 16.46 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13373

作者: milkdog 时间: 2012-8-16 13:20

又一张

图片附件: 59585292.snap.jpg (2012-8-16 13:20, 12.63 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13374

作者: milkdog 时间: 2012-8-16 13:20

组织块法

图片附件: 84108166.snap.jpg (2012-8-16 13:20, 21.66 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13375

作者: milkdog 时间: 2012-8-16 13:21

细胞传代前状态 95%融合

图片附件: 41517226.snap.jpg (2012-8-16 13:21, 21.09 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13376

作者: milkdog 时间: 2012-8-16 13:21

请问为什么ＤＨＡＮＫ要冰浴？还有，胰酶的量如何？

作者: 66小飞侠 时间: 2012-8-16 13:22

我报个名：鸭胚成纤维细胞原代培养。
我已经作过N次了，非常熟练，100%成功。

作者: skytree 时间: 2012-8-16 13:23

1．材料
1．1． 10-12日龄非免疫受精鸭胚购于雅安偏远山区
1．2．标准胎牛血清(FBS) Tianjin.h&y bio.co;ltd
1．3． MEM营养液（细胞增殖液；细胞维持液；洗液） GIBCO
Invitrogen Corporation
1．4． 10倍胰酶（自配）
1．5．抗生素医用80万单位青霉素和医用100万单位链霉素
1．6．灭菌的无钙、镁平衡盐溶液（自配）
2．实验器材与仪器
2．1实验器材
国产玻璃螺旋口细胞培养瓶（100ml）；培养皿；离心管（10ml）移液管（10ml与1ml）；漏斗；10层纱布；三角锥瓶（100ml）；吸耳；酒精灯；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；镊子；滤器及配套滤膜（25mm直径孔径0.22um）；50ml注射器；烧杯；蛋座；记号笔；离心管架；金属饭盒；照蛋器。
2.2 实验仪器
仪器名称  产地
超纯水仪  Water pro ps.labconco
电子天平  ShangpingFA2004. 上海天平仪器厂
高压灭菌仪  HIRAYAMA4
双蒸水仪  上海亚荣生化仪器厂
Orion台式PH测试仪  868型 OrionResearch.Inc
倒置显微镜  OLYMPUS
细胞培养箱  Queue
台式高速低温离心机  Beckman coultertm
超净台  苏州安泰空气技术有限公司
水浴锅  国华电器有限公司
低温冰箱  海尔集团
电热恒温鼓风干燥箱  DHG-9140型上海精宏实验设备有限公司
3.4 原代鸭胚成纤维细胞的制备。（10×ATV消化法）
实验前，无菌室用紫外线照射30min以上；超净台使用前应彻底擦干再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）擦拭一遍。双手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步骤参考文献[2][4][5][6]进行的)
①取10-12日龄发育良好的鸭胚，气室向上置于蛋盘内，用碘酒擦拭鸭蛋表面，后用酒精脱碘，并在气室端打一小孔，沿气室用镊子小心剪去蛋壳露出气囊，以镊子去除覆盖于绒毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附着的血管。用镊子撕开尿囊膜，夹住鸭胚颈部，移置于一小培养皿中。
②去除胚的头，四肢和内脏，用基础营养液清洗2-3次，直至组织出现透明，倒尽清洗液。
③用眼科剪剪碎胚体直至0.1-0.5立方毫米。剪越碎越好。
④移组织碎块于三角锥瓶内，加0.2ml/胚的10×ATV 37℃水浴锅内温热消化 2min，后用吸管移至离心管中,用离心机5000rpm 离心5min弃上清液。
⑤加入含双抗的10%血清的基础营养液，移离心管下层组织碎块于三角锥瓶内，由于分散的细胞在没有胰蛋白酶的作用下，会很快聚合成小团，为减少细胞成团应不断吹打，直至成细胞全部分散开。
⑥取灭菌纱布叠成8-10层置于漏斗上并使中部略凹陷，以含双抗的10%的基础营养液润湿纱布，将已吹散的细胞悬液经纱布过滤除杂。
⑦过滤后的细胞悬液补加含有双抗的10%血清的基础营养液，按10ml装入细胞培养瓶（容量为150ml的细胞瓶），将细胞瓶置于37℃细胞培养箱内静置培养。2小时后观察细胞贴壁情况，24小时后确认无污染。一般情况，24小时后细胞可基本长成单层。

作者: 二子 时间: 2012-8-16 13:23

请教战友，用无CO2供给的培养箱培养24孔盘原代细胞的方法。关键注意问题有什么？PH会不会出现大的变化？

作者: jkobn 时间: 2012-8-16 13:24

猪甲状腺细胞原代培养方法
1.材料
猪甲状腺由锦州市屠宰场提供。F-12培养基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；胶原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH　　　　　　（sigma公司）
2.方法
杀猪后迅速取出甲状腺1～2个，置于盛有75％酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室（1小时以内）。立即置于pH为7.4的PBS缓冲液（含青链霉素）中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成１mm3大小的碎块。置含0.25％胰酶和300U/ml胶原酶的容器中，放于37℃温箱中消化60min，每隔15min需摇动一次。用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。以1000转／分钟离心10分钟后，弃上清。将细胞沉淀用F-12培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网（200目）过目，再1000转／分离心10分钟，弃上清。沉淀悬于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95％，调整细胞浓度接种于培养板中（１ml／孔）。置于37℃的5％CO2孵箱中，每二至三天换一次液，至细胞融合成片后用于实验。
3.结果
猪甲状腺细胞培养24小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。
4.讨论
胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素（TSH）是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。本人也曾尝试过不加TSH，与加TSH对比明显可见细胞增长较慢，且形态不好。

图片附件: 50781639.jpg (2012-8-16 13:24, 60.38 KB) / 该附件被下载次数 8
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作者: skytree 时间: 2012-8-16 13:25

细胞原代培养
材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胶原酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸或卵巢，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胶原酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

细胞记数：取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

作者: skytree 时间: 2012-8-16 13:25

心肌细胞的分离及培养
器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒
溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶
动物：小鼠
准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。
培养过程：
1. 两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。
2. 取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3. PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。
4. 放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5. 再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。
6. 重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。
7. 将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。
8. 加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。
9. 培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。
10.显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。
11.4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。

或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。

作者: skytree 时间: 2012-8-16 13:26

肝细胞原代培养
材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

作者: dongdongqiang 时间: 2012-8-16 13:26

本人最近正准备做人甲状腺细胞培养，看到您的帖子喜出望外，还有几点疑问想请教xiaoma793：
1.您贴上来的照片是已经贴壁的细胞吗？这种状态是否传代时可以不用胰酶消化，直接吹下来就可以了？
2.甲状腺是血液循环非常丰富的组织，分离细胞时常有较多红细胞混杂，您是用什么方法去除的？
3.以您的经验，这种方法培养的甲状腺细胞最多能传几代？
盼望您的指点！

作者: okhaha 时间: 2012-8-16 13:26

DEF图

图片附件: 30107564.jpg (2012-8-16 13:26, 29.08 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: okhaha 时间: 2012-8-16 13:27

DEF单层细胞图片~~~~~~~

图片附件: 22624785.jpg (2012-8-16 13:27, 29.08 KB) / 该附件被下载次数 3
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作者: xevin 时间: 2012-8-16 13:28

大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养

脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，与外周血管内皮细胞不同，它具有高跨内皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征，从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障[1]。由于体外培养的脑微血管内皮细胞保持了较多的其体内固有的特点[1]，因此目前脑微血管内皮细胞体外培养模型已被广泛应用于血脑屏障的研究、脑血管疾病的病理生理及分子生物学研究、新药筛选、脑微血管内皮细胞生理生化及药理学研究等领域。而大多数体内实验采用大鼠为动物模型，而且大鼠具有较多的细胞生物学研究所需的抗体可用，因此进行大鼠脑微血管内皮细胞的培养具有重要的意义。自从Panula等[2]首次成功培养大鼠脑微血管内皮细胞以来，国内外有关大鼠脑微血管内皮细胞的分离和培养方法已有较多的报道，我们发现国内的方法多以组织匀浆、两次尼龙网过滤分离脑微血管段为主[3,4]，也有采用酶消化、梯度离心及尼龙网过滤的[5]，但细胞得率均较低，而近些年来国外大多数方法采用以大脑皮质为材料、酶消化及梯度离心分离脑微血管段并进行原代培养[6~9,11,12]。由于原代培养中无法避免地混杂成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、星型胶质细胞等其他细胞的生长，而且工作量大、过程繁琐且费用高[1]，进行较纯的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养一直是国内外的一个难点。
本人参照文献[6]、[7]、[8]的方法，成功地摸索出大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法，并获得纯度较高的脑微血管内皮细胞。

作者: xevin 时间: 2012-8-16 13:28

1 材料与方法

1.1 实验动物
每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。
1.2 试剂
纤连蛋白（fibronectin），Ⅳ型胶原，鼠尾胶，葡聚糖（dextran，分子量100~200kDa），DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）购自Sigma公司；D-Hanks液，PBS，10×PBS按配方自制；Ⅱ型胶原酶购自Worthington公司；明胶，牛血清白蛋白（BSA），HEPES购自Amresco公司；Percoll购自Amersham Biosciences；DMEM（高糖）购自Gibco BRL公司；肝素钠，NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），胶原酶/分散酶（collagenase/dispase）购自Roche公司。
1.3 重要仪器
低温离心机（1 Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；2 himac CR 22F，购自Hitachi）
1.4 试剂配制
1 mg/ml鼠尾胶（用0.2%乙酸配制），1%明胶（用D-Hanks液配制），1%Ⅱ型胶原酶（用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度），1%胶原酶/分散酶（用DMEM配制，用时稀释成0.1%），15%葡聚糖（用PBS配制），20%BSA（用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 um滤膜过滤除菌，较难过滤！），DNase Ⅰ（用冷PBS配制成2 U/ul），以上试剂经0.22 m滤膜过滤除菌后分装保存于-20 ℃；50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液, 0.67 ml 10×PBS, 0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液（含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 ug/ml），pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4 ℃，用时加入20%FBS，1 ng/ml bFGF。
1.5 培养皿处理
涂布3种不同的基质：培养前一天加入1 ml 1%明胶于35mm塑料培养皿，置于37 ℃培养箱过夜，接种前用D-Hanks液漂洗2次；接种前4 h，加入鼠尾胶6~10 ug/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后，置于室温1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次；50ul 0.1%纤连蛋白、50ul 1 mg/ml Ⅳ型胶原和400ul双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次。
1.6 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养
大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑（包括海马），随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质，用D-Hanks液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶（含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑）混匀后37 ℃水浴消化1.5 h，离心（1000 r/min，8 min，室温），去上清液，加入20%BSA悬浮混匀后离心（1000 g，20 min，4 ℃）或加入15%葡聚糖悬浮混匀后离心（4000 r/min，20 min，4 ℃），去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀，加入2 ml 0.1%胶原酶/分散酶（含20 U/ml DNase I）悬浮混匀后37 ℃水浴消化1 h，离心（1000 r/min，8 min，室温），去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50%Percoll（25000 g，60 min，4 ℃），离心（1000 g，10 min，4 ℃），靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次（离心1000 r/min，5 min，室温），去上清液，加入DMEM完全培养液（含20%FBS，100 ug/ml肝素钠）悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿（1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑），置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。

作者: xevin 时间: 2012-8-16 13:28

1.7 鉴定方法
形态学、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测

2 结果

2.1 细胞形态观察
接种当时可见由圆形的内皮细胞构成的呈单枝状或分枝状的脑微血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片（见图1-1）；培养12~24 h后可见培养的细胞从贴壁的微血管段周围长出，细胞呈短梭形，区域性单层生长，经换液后微血管段的残余部分不断减少，成纤维细胞、周细胞等杂细胞含量较少；随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，可见“旋涡状”分布，大约5~7天细胞达到融合，短梭形的内皮细胞占90%以上，但可见少量周细胞等杂细胞生长于内皮细胞单层表面或细胞克隆间隙（未示）。细胞生长过程见图1，细胞接种于纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿。
2.2 涂布不同基质的细胞生长情况
明胶及鼠尾胶涂布的培养皿微血管段贴壁时间较长，6 h可见少量微血管段贴壁但无内皮细胞长出，12~24 h可见一些内皮细胞长出，24 h后脑微血管段完全贴壁并有较多的内皮细胞长出，两者无明显差异（见图2-1~4）；纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿培养后6 h即可见微血管段贴壁并有一些内皮细胞长出，12~24 h内基本完全贴壁并有较多的内皮细胞长出（见图2-5,6）。
2.3 免疫组化
Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测可见培养的脑微血管内皮细胞的胞浆及核周有棕黄色着色，胞核呈空泡状结构；对照染色为阴性。

3 讨论

我们采用两次酶消化、梯度离心分离得到脑微血管段，探索各种不同的培养条件，成功地进行了较纯的大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养，内皮细胞纯度可达90%以上，而且细胞得率较高，10只动物可培养8~10个35 mm一次性塑料培养皿，培养面积大约80~100 cm2，与国内的一些方法[3~5]相比，细胞得率有明显的提高。
由于新生鼠易于混有较多的杂细胞且大脑较小以及哺乳期大鼠优于超过1月龄的大鼠[9]，我们采用2~3周龄哺乳期的SD大鼠作为培养材料。脑微血管内皮细胞原代培养的关键是首先分离获得纯度较高且活力好的脑微血管段。在解剖过程中仔细去除软脑膜、大血管及大脑白质收集大脑皮质，可减少成纤维细胞和平滑肌细胞的生长，对于提高内皮细胞的纯度具有重要意义。由于胶原酶对内皮细胞的损伤较小，我们采用0.1%Ⅱ型胶原酶消化剪碎后的大脑皮质分散组织，同组织匀浆法[3,10]相比，酶消化法可避免组织匀浆对内皮细胞的损伤，从而有利于提高细胞的活力。经胶原酶消化后采用20%BSA或15%葡聚糖离心可分离脑微血管段与神经组织及大血管，得到底层的脑微血管段，这种方法被广泛应用于脑微血管段的分离[5~9,11,12]，我们发现20%BSA较15%葡聚糖而言，其分离获得的脑微血管段数量更多，而且脑微血管段状态更好更易贴壁生长。由于周细胞是脑微血管内皮细胞原代培养中最常见的杂细胞，它会明显抑制内皮细胞的生长[7]，因此原代培养中应尽量减少周细胞的数量，我们采用两次酶消化方法[7]，控制两次酶消化的时间，用0.1%胶原酶/消化酶分散出内皮细胞外围的周细胞，最后采用一定浓度的连续梯度的Percoll分离以去除周细胞和红细胞得到较纯的脑微血管段。在酶消化过程中加入适量的DNA酶可分散消化过程中释放的DNA所引起的微血管段凝结块，有利于增加微血管段的得率。对于Percoll离心，我们尝试了3个浓度（33%、45%及50%）后发现，浓度越大，脑微血管段离靠近离心管底的红细胞及周细胞越远，分离效果也越好，因此采用50%Percoll效果最好，并且最好采用水平转头的低温离心机以提高离心效果。内皮细胞纯化的其他方法有机械刮除法、克隆培养法、FACS分类法[13]、Thy1.1免疫反应杀伤法[7,14]、采用血浆来源的胎牛血清[8]、磁珠结合法[10]等，但是我们发现机械刮除法和克隆培养法并不适合大鼠脑微血管内皮细胞的纯化，因为原代内皮细胞传代后状态不佳且易被杂细胞所抑制[7]，而后面几种方法比较昂贵不予推荐；血浆来源的胎牛血清不含PDGF，不促进杂细胞的生长，但是其较昂贵，可选择胎牛血清用于原代培养。

作者: xevin 时间: 2012-8-16 13:29

脑微血管内皮细胞的原代培养需要涂布明胶、鼠尾胶、纤连蛋白等基质以利于脑微血管段贴壁和内皮细胞的生长。我们尝试不同基质后发现其对脑微血管段的贴壁和内皮细胞的生长作用不同，纤连蛋白/IV型胶原优于鼠尾胶，而鼠尾胶比明胶好，而且接种密度的要求前者比后两者要低，后两者需要达到一定密度才有利于脑微血管段贴壁。另外我们发现内皮细胞不易生长于玻片上，而较易生长于塑料培养皿上，这与文献报道基本相符[8,14]。内皮细胞生长需要添加内皮细胞生长因子以促进内皮细胞的增殖抑制杂细胞的生长，我们采用bFGF可有效促进内皮细胞的生长，同时添加100 ug/ml肝素协同bFGF的作用并可抑制平滑肌细胞的生长[9]。同时为了保证内皮细胞的营养，并去除脑微血管段的残余碎片，我们采用20%FBS的血清浓度并隔天换液。
我们培养的脑微血管内皮细胞呈短梭形，区域性单层生长，随着培养时间的延长及内皮细胞的增殖，可见“旋涡状”分布，约5~7天后，各区域之间可逐渐融合，其形态和生长特点与大多数文献报道相似[6~9,11,12]。根据内皮细胞的短梭形的形态特点、Ⅷ因子相关抗原表达阳性可鉴定我们所培养的细胞确为脑微血管内皮细胞[3,5,8]。
我们的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型的建立，对于研究脑内皮的生理、生化及药理研究是一个较好的工具，同时可与星型胶质细胞共培养用于构建血脑屏障模型[1]。相信随着技术方法的不断改进，脑微血管内皮细胞体外培养的模型将逐渐接近于其在体特征，并被广泛应用于相关研究[1]。

参考文献（References）
[1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287
[2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95
[3] 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495
[4] 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63
[5] 钱志远等。细胞生物学杂志，1999，21：42
[6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139
[7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1
[8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23
[9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312
[10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554
[11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435
[12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45
[13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269
[14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473

上述所贴内容基本源自本人同名的article(已发表于<<细胞生物学杂志>>，2005，27：84-88)，请参考本人方法的站友自觉引用！

作者: ero11 时间: 2012-8-16 13:30

图1 大鼠脑微血管内皮细胞原代培养过程中的生长与形态变化
1.接种后当时，可见单枝状及多枝状脑微血管段，×100；
2.培养12 h后，可见内皮细胞从贴壁的微血管段游离长出，×100；
3.培养第4天，细胞不断增殖，呈短梭形，单层生长，×40；
4.培养第4天，同3，×100；
5.培养第7天，细胞单层达到融合，可见“旋涡状”分布，×40；
6.培养第7天，同5，×100。

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作者: ero11 时间: 2012-8-16 13:30

图2 三种不同基质下内皮细胞的贴壁及生长情况
1.1%明胶涂布的培养皿接种后6 h，可见少量微血管段贴壁不牢，×100；
2.1%明胶涂布的培养皿接种后12 h，可见一些内皮细胞游离长出，×100；
3.鼠尾胶涂布的培养皿接种后6 h，可见少量微血管段贴壁不牢，×100；
4.鼠尾胶涂布的培养皿接种后12 h，可见一些内皮细胞游离长出，×100；
5.纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿接种后6 h，可见一些微血管段贴壁并有内皮细胞游离长出，×100；
6.纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿接种后12 h，可见大多数微血管段贴壁及内皮细胞游离长出，×100。

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作者: is2011 时间: 2012-8-16 13:31

请求：偶要培养骨髓基质细胞，想请问各位大侠用什么最好得方法从大鼠骨髓中取基质细胞。我得体会：用DMEM冲洗骨髓腔后，用5ml以及1ml的注射器吹打数次。然后一只大鼠的双侧胫骨和股骨的骨髓细胞接种到2个75平方cm的培养瓶中，24后吸去培养液，用PBS洗3次或2次，再用胰蛋酶＋EDTA把细胞从壁上消化下来，再观察细胞的数量，结果发现细胞好少，而且单个贴壁的细胞几乎没有，只有少数成团的贴壁细胞（和其他细胞混合在一起，吹打时没被打散的细胞团）。理论上，细胞应该被吹打成单个，才更容易贴壁，这就和我们的实验结果有矛盾。我发觉，在吹打时，要把细胞吹打成单个，得需用较大得劲吹打，但是，所得细胞可能已不是活得。当你用较小得力吹打时，细胞团又很难打开，而且所得细胞里有好多得非基质细胞，大大影响了基质细胞得贴壁。我想用红细胞裂解液把红细胞裂解掉，再用胰酶把细胞消化成单个细胞，这样就可减少吹打次数和吹打劲，但我不知道红细胞裂解液对基质细胞是否有很大得影响。哪位高手能够给我指点一二？我要得细胞主要是基质细胞中得干细胞。再问一下，怎么样配红细胞裂解液？

作者: october7 时间: 2012-8-16 13:31

谁会人的前脂肪细胞原代培养啊
还有可不可以把我师兄的大鼠前脂肪细胞培养写上来啊

作者: jrwyyplt 时间: 2012-8-16 13:32

大鼠胰岛细胞原代培养

一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，

作者: gogo 时间: 2012-8-16 13:32

预定：淋巴细胞转化，脐带平滑肌细胞原代培养

作者: yapuyapu 时间: 2012-8-16 13:33

视神经少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定
1 材料和方法
1.1 DMEM/F12条件培养液（亚硒酸钠40μg·L-1，腐胺16.2 mg·L-1，转铁蛋白100 mg·L-1，胰岛素234U·L-1，甲状腺素0.4μg·L-1，黄体酮0.62 mg·L-1，谷氨酰胺3g·L-1）。DMEM/F12培养基、小牛血清购自Hyclone公司，兔抗鼠GC抗体、亚硒酸钠、腐胺等购自Sigma公司。
1.2 视神经胶质细胞的来源、培养取新生2d的Wistar大鼠10只（第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心提供），无菌条件下取出双侧视神经。接种至24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上。而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培养基，37(C，50mL·L-1 CO2，100%湿度连续培养3d。3d后弃废液，改为含5g·L-1小牛血清DMEM/F12条件培养液继续培养。每周换液2次。在获得足够的细胞数量后，改用无血清条件培养液继续培养，每2d换液一次。
1.3 形态学观察每天在倒置显微镜（日本Olympus），观察培养细胞的生长过程和形态学变化并拍照。
1.4 免疫细胞化学鉴定：将含细胞盖玻片取出，0.01mol·L-1 PBS冲洗3次×5min；冷丙酮固定10 min；PBS冲洗（3次×5min）；30g·L-1过氧化氢室温孵育15min；PBS冲洗3次×5min；滴加正常山羊血清，室温孵育20 min；滴加1:100 GC抗体，阴性对照以PBS代替一抗，37(C孵育60min；PBS冲洗3次×5min；滴加生物素标记羊抗兔IgG，37(C，20min；PBS冲洗3次×5min；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液；DAB工作液（武汉博士德公司）显色，自来水终止反应；脱水，透明，D·P·X封片保存。
2 结果
2.1 形态学观察结果
组织块24ｈ开始贴壁，48～72ｈ可见神经组织边缘游出少量细胞，主要为圆形或梭形（图1）。8～9d左右，细胞基本铺满培养孔。此时改用无血清条件培养基培养进行纯化。培养过程中，部分细胞死亡。12d左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角型，直径约6～10μm。细胞核较大，胞质少（图2）。
2.2 免疫组织化学染色结果
培养的视神经少突胶质细胞的免疫组织化学染色GC蛋白阳性，未加一抗的呈阴性。染色结果显示成熟的少突胶质细胞突起丰富，互相形成蜘蛛网状（图3）。苏木素复染，异质细胞较少，90%以上为阳性细胞（图4）。

3 讨论
抑制神经再生基因Nogo的发现为视神经损伤的修复、视功能保护研究带来了希望。视神经胶质细胞包括星形胶质细胞和少突胶质细胞2种类型,分化不同,功能各异。成熟的少突胶质细胞不再具有分裂增殖能力，为分裂终期细胞[2]，培养较为困难。
1980年McCarthy[3]等建立了从脑灰质组织分离、纯化星形胶质细胞和少突胶质细胞的分离培养模型。目前国内外多采用该法[4]。利用少突胶质细胞和星形胶质细胞贴壁能力的不同采用振动分离法进行分离、培养。此法主要用来获取星形胶质细胞，获得的少突胶质细胞较少。存在着操作步骤多容易被污染、分离过程中因振荡离心易造成机械性损伤导致细胞死亡等缺点。
本实验采用视神经组织块培养的方法，对新生大鼠的视神经胶质细胞进行条件化原代培养，利用少突胶质细胞和星形胶质细胞生长条件的不同，采用条件培养基纯化2种细胞。少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞是从一种普通双潜能的少突胶质细胞－2型星形胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell，O2A）发育而来[2]。大鼠出生后约1周，少突胶质细胞逐渐成熟。因此，从新生大鼠取材可获得O2A祖细胞。体外研究发现甲状腺素、胰岛素、转铁蛋白、腐胺、黄体酮和微量元素硒等，可使O2A祖细胞朝少突胶质细胞定向分化。而血清等可以诱导O2A祖细胞分化为Ⅱ型星形胶质细胞[2、5]。我们利用这一特点，逐步减少条件培养基中的血清浓度，促进O2A祖细胞向少突胶质细胞分化。最终采用无血清条件培养基，抑制星形胶质细胞及其它异质细胞增殖，而少突胶质细胞在此条件下则基本不受影响。GC是表达于少突胶质细胞膜以及髓鞘的一种主要类脂，它是识别少突胶质细胞普遍应用的特异性化学标志物[2、4]。免疫染色鉴定结果表明纯度较高超过90％。此方法简便、可靠、易于推广，便于对少突胶质细胞相关课题进行研究。

作者: 831226 时间: 2012-8-16 13:33

我想请问各位高手，胚胎小鼠或者胎后3天小鼠的肠管神经丛如何分离，最好是具体步骤，感谢各位的关心了！

作者: dragonkilly 时间: 2012-8-16 13:34

请教脂肪细胞原代培养方法。特别是脂肪细胞计数问题一直困扰我。

作者: TNT 时间: 2012-8-16 13:34

收集足月顺产或剖腹产新生儿脐带，保存于5%糖盐水中，4℃。(脐带在4℃ 5%糖盐水中保存时间不超过24h)。在超净工作台上将脐带取出，置灭菌弯盘中，用生理盐水冲洗脐静脉至冲出的液体不含红细胞。钳闭脐带一端，从另一端向脐静脉内注入37℃预热的0.25%胰蛋白酶，钳闭另一端。置37℃的生理盐水中10~15min。取出脐带，松开一端钳子，放出消化液，加入含15%新生小牛血清的M199培养基[含有85ml M199培养基(1000ml M199培养基，0.292g谷氨酰胺，3.0g Hepes ，2.0g NaHCO3)，15ml新生小牛血清，青、链霉素贮存液5μl，胰岛素1U]以终止反应。离心800rpm×10min，弃上清。沉淀用含M199培养基稀释，以1×105的密度接种。置于5%CO2孵箱中培养。每三天更换一次培养液，每天定时观察培养液的酸碱度和透明度。在相差显微镜下观察细胞贴壁和生长状况，直到细胞融合。

作者: redbutterfly 时间: 2012-8-16 13:34

软骨细胞培养

软骨细胞的原代培养
龄新西兰乳兔(雌雄不限，共18只，分6次处理),溺死，置于75％酒精溶液中10分钟，拿入超净工作台，自眼外眦至耳屏前剪开皮肤暴露皮下组织，再次严格消毒，自外眦外将颧弓由根部剪断，暴露髁状突，去净髁状突表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取髁状突表面的透明软骨，以磷酸缓冲液（PBS含青霉素、链霉素各100U/L）冲洗2遍，将软骨剪切成1－3mm3 左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化30-35分钟，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培养瓶，加0.1％Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200r/min离心7分钟，弃上清，以含10％新生牛血清DMEM的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面的酶，悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％。将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。2天后换液1次，以后隔天更换培养液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况。待细胞贴壁达到85％－90％后传代。

软骨细胞的传代培养
待细胞贴满壁后传代。传代时,吸干培养液,用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25％胰蛋白酶－0.01％EDTA（1比1）消化液,以覆满瓶底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL 左右含血清的培养液终止消化,收集第1代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养瓶底壁脱落,收集细胞混和液, 1200r/min离心7分钟, 弃上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗细胞3次,制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％，调整细胞浓度为5×107/ml,用于实验。

传代　吸干培养液,用PBS 液轻洗细胞2次,培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆满皿底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大,少部分细胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养皿底壁脱落,收集细胞混和液,离心,用PBS 液漂洗2 次,再制成细胞悬液,计数,检查细胞活力,按每个培养皿接种2 ×105 个细胞再培养。

作者: one 时间: 2012-8-16 13:35

偶然间发现，不知道有没有人在写。支持一下青山：

原代近端肾小管上皮培养
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=388262&sty=1&tpg=149&age=0')
脐动脉平滑肌细胞！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=474575&sty=1&tpg=145&age=0')

作者: dongdongqiang 时间: 2012-8-16 13:35

HUVEC分离培养

溶液以及器材：

1.  用RPMI-1640配I型胶原酶 0.1g/100ml

2.  配三抗：

青霉素：100ku/L
链霉素：100ku/L
庆大霉素：100ku/L

3.  培养液（M199＋ECGS[3ug/ml]＋15％胎牛血清）有EGF可以适当加点10ng/ml

4.  大瓶生理盐水
5.  广口瓶（脐带数＋1）
6.  止血钳（脐带数×2＋2）
7.  大针头数个（用于吸取生理盐水，胶原酶）
8.  手术剪刀数把

使用前器械高温蒸气灭菌。

实验步骤：

1.  去妇产科取当天新鲜脐带（广口瓶；生理盐水），试验前放入4度冰箱。

2.  辨别脐带静脉（粗大的那根），顺着静脉瓣插入大针头，注入生理盐水，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液。

3.  夹住脐带下端，从上端灌注0.1%的胶原酶，钳住脐静脉上端，37度孵育15分钟（已经足够）；如果消化液中出现絮状物，说明消化时间过长。

4.  收集消化液，并用含小牛血清的RPMI-1640 冲洗脐静脉，冲洗液并入消化液中。1000－1500转离心10分钟。

5.  将细胞悬浮于培养液中（一根脐带一般可以一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔），细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。

6.  正常情况下三天长满传代，正常的内皮细胞长满后如同卵石状，见下图。

7.  使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。

图片附件: 21624775.jpg (2012-8-16 13:35, 26.17 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13382

作者: loli 时间: 2012-8-16 13:36

求海马神经元原代培养方法;大家是否可以注明一下培养细胞的用途啊,好象不同的实验方法对细胞的要求是不一样的吧

作者: wu11998866 时间: 2012-8-16 13:36

建议增加一个真皮微血管内皮细胞！
因为首先不同部位的内皮细胞特性不一致，以往研究烧创伤创面愈合多运用脐静脉内皮细胞或者ECV304,缺乏说明力度,其次，从我们实验室看，大家都希望做这方面工作，但是由于分离难、贴壁难、成纤维细胞污染等问题大都知难而退，毕竟研究生这3年耗不起！希望斑竹考虑！

作者: bananapeople 时间: 2012-8-16 13:37

星型胶质细胞原代培养
新生1-2天Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死，取脑放入冷的D-Hanks平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。分离两侧大脑皮质并剪成1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min，用含10% FBS的DMEM培养基终止消化，离心1000rpm 10min，去上清，再用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，经75µm筛网过滤，收集滤液，离心1000rpm 10min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5×106/ml，种植于75cm2培养瓶，经1小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75cm2培养瓶继续培养，两天换液一次。7天后将培养瓶放入水平摇床，260rpms 2小时 37℃,换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1小时，重新置于水平摇床，260rpms 18小时37℃，换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA1：1混合液消化、传代备用。

作者: zzzz 时间: 2012-8-16 13:37

兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定
一、摘要目的：建立兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定的方法。方法：成年新西兰白兔两只（正常及梗阻各一只），采用酶法分离技术获得膀胱平滑肌细胞后于10%小牛血清的DMEM中培养，观察细胞形态和扩增情况，用爬片染色、电镜、蛋白质α-肌动蛋白（α-actin）鉴定细胞类型。结果：倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构、细胞爬片HE染色及电镜检查均证实为平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。结论：该方法易行、可靠、在短期内可获得大量高纯度膀胱平滑肌细胞。

二、材料及方法
1、试剂及标本
成年同龄雄性新西兰白兔2只，体重约2.5~3k(购于南京军区南京总医院动物实验中心)，一只为正常成年雄性新西兰白兔，一只为膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西兰白兔。DMEM、Ⅱ型胶原酶及α-肌动蛋白抗体（α-actin）购于北京华美公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；胰蛋白酶购于南京生兴公司。
2、膀胱平滑肌细胞酶法分离
肌注盐酸氯胺酮200mg及氟哌利多5mg麻醉，待兔进入麻醉状态后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱组织。超净台内依次庆大霉素溶液（浓度为100单位/毫升）、生理盐水及D-Hanks液中浸泡洗涤5分钟，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。肌肉剪成肉糜后0.1%胶原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40过夜消化（约10-12小时）。然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分钟，消化液变混浊呈絮状提示消化良好。用100目细胞筛过滤该絮状液，混悬液离心（1000转/分，离心半径13cm）5分钟，沉淀的细胞移入培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2、370饱和湿度孵育箱中静置培养，培养液每周更换2-3次。
3、传代培养
待培养的细胞通过增殖达到约80%汇合状态时做传代处理。弃去原培养瓶中的旧培养液，加入适量的PBS(因培养液中的胎牛血清对胰蛋白酶有抑制作用)，轻轻摇动，清洗残留的培养液后弃之。加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞，将培养瓶放置于CO2培养箱，不时在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大后，吸出消化液，并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。细胞进行计数后，按照1X105~106密度将细胞接种于培养瓶中。
4、培养细胞的观察及鉴定
采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE染色观察细胞形态。电镜检查。免疫组化染色检测α-actin。
结果
两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构（图1 对照组2周的细胞；图2 实验组培养2周的细胞）。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型(见图3)。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构（图4分离后培养细胞的电镜检查发现平滑肌细胞致密班结构）。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应（图5）。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。
图1 对照组2周的细胞
图2 实验组培养2周的细胞
图3 细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型
图4 分离后培养细胞的电镜检查发现平滑肌细胞致密斑结构
图5 SMA免疫组化证实该方法能获得单一膀胱平滑肌细胞（棕色为SMA阳性）

作者: zzzz 时间: 2012-8-16 13:38

三、讨论
平滑肌细胞的培养方法可分为两类：组织块法和酶消化法。组织块法适用于细嫩、易碎的组织；其方法较简单；但容易产生杂质如成纤维细胞等，成纤维细胞生长快，故培养之细胞质量较差；培养的大多数细胞无收缩性；且原代细胞的获得需3~4周，获得大量平滑肌细胞耗时长（17）。既往酶消化法较组织块法复杂、精细；适宜的酶浓度和培养时间的确定较为困难；然而在较短时间内可获得大量的平滑肌细胞，1996年有学者报道（Chambers（18）等）酶消化法纯度为70%。可见一种快速、高效、高纯度的酶消化法培养膀胱平滑肌的方法显得尤为重要。
本实验研究两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%（在以下的膀胱平滑肌细胞的共聚焦检测中也证实了这一点）。膀胱平滑肌的鉴定（10）主要根据其细胞形态及α-actin的检测。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构；细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型；电镜检查可见平滑肌细胞密班结构，这些细胞形态学的检测均证实其为膀胱平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应更进一步证实了该方法所获得的细胞为膀胱平滑肌细胞。已有学者通过实验发现：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞细胞膜通道的密度有所下降；细胞膜电位和细胞膜电阻稍微降低。他们认为通过酶消化法所获得的膀胱平滑肌细胞经培养、传代后仍基本保持着原有的电生理特性，由此在体外研究的结果可较好的反映体内情况（21）（20）。梗阻后的膀胱平滑肌细胞在生长扩增中明显较正常膀胱平滑肌细胞时间长，也说明了这种酶消化法对膀胱平滑肌细胞的影响不是太大，还是保留着体内的基本特性。在我们的激光扫描共聚焦显微镜的检测中平滑肌细胞内的钙离子荧光强度在M受体激动剂的影响下发生明显变化，这更进一步证实了该方法分离培养出的膀胱平滑肌仍保持着收缩功能。
从实验研究中我们体会到该方法：1、简便、易行、易掌握及短期内可获大量高质单个膀胱平滑肌细胞；2、应严格无菌操作；3、仔细彻底剥除膀胱黏膜、黏膜下及浆膜层，是确保获的大量高质单个膀胱平滑肌细胞的基础；4、膀胱平滑肌组织应尽量减碎以确保充分消化；5、严格控制胶原酶和胰蛋白酶的浓度和消化时间，见消化液混浊、组织块呈絮状，或在倒置显微镜下见消化液中有较多单个细胞或细胞小团块时即终止消化；6、细胞筛的运用也是获得高质单个膀胱平滑肌细胞的基础。
1. Chamley CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture.Physiol Rev 1979 59（1）:1-61.
2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI.Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder .1996 Exp Physiol 81 (4):553-564.
3．Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and
their interaction with biopolymers.J Pediatr Surg. 2003 Jan;38(1):21-24.
4.Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human　detrusor smooth muscle. BJU Int. 2003 Sep;92(4):476-478.
5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties　of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle
cells.J Urol. 2001 Feb;165(2):627-632.

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作者: zzzz 时间: 2012-8-16 13:38

This is picture 2,
图二，斑竹见笑

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作者: zzzz 时间: 2012-8-16 13:38

This is picture3,
图三，斑竹见笑

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作者: zzzz 时间: 2012-8-16 13:39

This is picture4,
图四，斑竹见笑

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作者: zzzz 时间: 2012-8-16 13:39

This is picture5,(所有资料均为原创)
图五，斑竹见笑

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作者: jrwyyplt 时间: 2012-8-16 13:40

大家对分离细胞有什么好的方法吗？有抑制上皮细胞生长的制剂吗？

作者: BUK 时间: 2012-8-16 13:40

淋巴细胞转化

实验步骤

采血：
需要在严格无菌条件下采血。肝素抗凝，室温保存，24hr-72hr转化效率高。也有保存更长时间，采血后不要将血液置冰箱中，长途运输也不要冷藏。

分离淋巴细胞：
采集血液4-5mL，与2mL1640（含1%双抗）在离心管内混合，然后缓慢沿管壁注入淋巴分离液（已37℃预热），3000rpm离心30min。
收集白细胞层，转移至另一离心管中，加入10mL1640（含1%双抗），轻轻吹打均匀，1500 rpm离心15min。弃上清，如此反复洗涤3次，收集白细胞。

转化
取1 mL全培养基（+0.5%pHA）加入已经洗涤三次的白细胞离心管中，轻轻吹打均匀，转入24孔板中，加入自备EBV液0.6mL，20ug/ mL环孢霉素0.2 mL，放入37℃5%CO2培养箱中培养。
3-4天后观察细胞，镜下可见集合的细胞团，以及已被转化的明显增大的类淋母细胞，4-5天后可加入0.5 mL全培养基（1640+15%FBS+1%双抗+1.6%1M Hepes），然后视细胞生长情况更换培养基，并且转入培养瓶中。

附：
EBV液制备：
培养B95-8细胞，待细胞长满，培养基变黄，收集于50mL离心管中，于-80℃冰箱中，过夜，37℃水浴融化，再置于-80℃冰箱中，如此反复冻融三次，2000 rpm离心20min，上清0.2um过膜，-80℃冰箱中冻存备用。

作者: BUK 时间: 2012-8-16 13:41

人脐带平滑肌细胞
材料：新鲜脐带
方法：冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌胶原酶消化液（1mg/mL)，室温消化30min，1000rpm离心5min，弃上清，加1mg/mL胰蛋白酶37℃消化20min，1000rpm离心5min，弃上清，再加入胰蛋白酶37℃消化20min，1000rpm离心5min，弃上清，加胶原酶（1mg/mL)弹性蛋白酶（0.5mg/mL)混合消化液37℃消化20min，1000rpm离心5min，弃消化液，再加混合消化液37℃消化20min，1000rpm离心5min，细胞加10%FBSDMEM培养基重悬，转入培养皿37℃5%CO2培养箱中培养即可。

作者: summerxx 时间: 2012-8-16 13:41

软骨细胞培养

软骨细胞的原代培养
龄新西兰乳兔(雌雄不限，共18只，分6次处理),溺死，置于75％酒精溶液中10分钟，拿入超净工作台，自眼外眦至耳屏前剪开皮肤暴露皮下组织，再次严格消毒，自外眦外将颧弓由根部剪断，暴露髁状突，去净髁状突表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取髁状突表面的透明软骨，以磷酸缓冲液（PBS含青霉素、链霉素各100U/L）冲洗2遍，将软骨剪切成1－3mm3 左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化30-35分钟，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培养瓶，加0.1％Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200r/min离心7分钟，弃上清，以含10％新生牛血清DMEM的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面的酶，悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％。将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。2天后换液1次，以后隔天更换培养液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况。待细胞贴壁达到85％－90％后传代。

软骨细胞的传代培养
待细胞贴满壁后传代。传代时,吸干培养液,用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25％胰蛋白酶－0.01％EDTA（1比1）消化液,以覆满瓶底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL 左右含血清的培养液终止消化,收集第1代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养瓶底壁脱落,收集细胞混和液, 1200r/min离心7分钟, 弃上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗细胞3次,制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％，调整细胞浓度为5×107/ml,用于实验。

传代　吸干培养液,用PBS 液轻洗细胞2次,培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆满皿底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大,少部分细胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养皿底壁脱落,收集细胞混和液,离心,用PBS 液漂洗2 次,再制成细胞悬液,计数,检查细胞活力,按每个培养皿接种2 ×105 个细胞再培养。

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你好，我们实验室培养关节滑膜细胞，在传代时候跟你做的有所不同。
我们在用胰酶消化之后，先把胰酶吸走，再加入培养液，那样势必会浪费
一些细胞。我是初学者，这些也是师姐的做法，不知道你的实验中不吸走
胰酶而直接加入培养液对细胞会不会有损害？
望指教，谢谢

作者: 大白菜 时间: 2012-8-16 13:42

大家好，有谁培养过大鼠肠成纤维细胞吗？都说成纤维细胞是最好培养的，可我折腾了三个多月也没一点进展，最好培养的我都不行，本人深受打击，谁能帮帮我啊？谁来救救我吧！大家好，有谁培养过大鼠肠成纤维细胞吗？都说成纤维细胞是最好培养的，可我折腾了三个多月也没一点进展，最好培养的我都不行，本人深受打击，谁能帮帮我啊？谁来救救我吧！

作者: 大白菜 时间: 2012-8-16 13:42

大家好，有谁培养过大鼠肠成纤维细胞吗？都说成纤维细胞是最好培养的，可我折腾了三个多月也没一点进展，最好培养的我都不行，本人深受打击，谁能帮帮我啊？谁来救救我吧！

作者: lixi559 时间: 2012-8-16 13:42

我今天第一次上这个论坛是个新手，请大家多多指教，斑竹多多关照！我一直都在做乳鼠的心肌细胞培养，看了上面两个帖子，在补充一点自己的心得：我们用胰酶做了好多次，各种浓度以及与胶原酶的各种复合浓度，觉得效果都不是很理想，细胞状态不大好，后来就单用0.2%的胶原酶，细胞状态很好！48小时左右后开始搏动。
若还有用胰酶觉得不够理想的，请试用以下上面的方法！
以后再有其他体会继续支持！

作者: ritou1985 时间: 2012-8-16 15:17

脐静脉内皮细胞培养：
准备的药品：pbs,199培养液，I型胶原酶（SIGMA）。
主要的器械：手术剪，镊子，止血钳，丝线，鞘管（PTCA用的动脉鞘的扩张管，6F或7F）。
首先，以PBS漂洗脐带1-2次，用剪刀将脐带剪成数段15CM左右长短（本人认为这个长度较为合适）。
之后，以止血钳提起一段脐带的一端，将鞘管插入脐静脉中，并经该鞘向静脉内注入PBS10-8ml左右（最后注入空气吹净残留液体），后以丝线将另一端结扎（一定要扎紧），并从鞘管注入适量胶原酶，一般1ml（0.1%）足以,并以止血钳将该端钳闭。后将如此处理的脐带放入小烧杯中，在温箱中孵育10-15分钟（视酶的活力而定）。
最后将消化后的脐带轻轻揉捏2-3次，将结扎线及止血钳除去，后经鞘管向内注入199培养液（8-10ml就可以了，一次即可），将冲刷下来的酶液收集到离心管中，1000rpm离心5-6分钟，后倾去培养液，加入事先配制好的内衣细胞培养液（199，20%FBS,双抗,内皮细胞生长因子），吹打数次制成细胞悬液，接种入培养瓶。一般一段脐带所得细胞放入一个25CM培养瓶（最好是一次性的塑料瓶）。
注意：
1如果培养瓶内有较多残血，先不要紧张，因为这样并不影响内皮的生长，第二天予换液一次即可。
2一定要确保有足够数量的内膜消化下来，否则细胞生长缓慢影响质量（如离心后，管底的白膜-消化下来的内膜较少，必要时可两段脐带合为一瓶）

作者: 盼盼 时间: 2012-8-16 15:18

我正准备培养大鼠的神经元细胞，难度挺大的，能不能加入你们啊？虽然是新手，但在培养的过程中也会有体会，能在这和大家一块分享吗？

作者: toy 时间: 2012-8-16 15:18

SD大鼠VSMC的原代培养(贴块法)：
实验材料：手术剪1把、手术钳2把、眼科剪刀2把、眼科镊子1把、大头针4个、手术刀片、无菌1×PBS约500ml 20%FBS的DMEM、5ml小皿3个、 10ml大皿1个、杀鼠板1块。（以上均为无菌物品）
实验步骤：

1、 150-200gSD-大鼠，短头，浸入75%的酒精中15min
2、置入超净台中，将大鼠固定于杀鼠板上，在无菌条件下打开腹腔，分离出胸主、腹主，摘出。
3、 PBS清洗3遍，剥去外膜，用手术刀片刮去内膜，留下中膜并将其移入1ml的培基中、剪成1×1mm大小组织块。
4、再将PBS清洗组织块，移入25ml的培养瓶中，用尖嘴弯管均匀贴好组织块，放入37度5％CO2的培养箱倒置培养6小时后，待组织块贴壁后，再加入2.5ml培养液后放回37度5％CO2的培养箱中。
注意：最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下，勿使组织块吹下。
5、随后每3天予以全量换液。
6、 3-5天后可见组织块周围有细胞爬出，大约2周后80％融合。
本人曾做过3个月的SD大鼠VSMC的原代培养，基本上的所有的障碍都遇到过，现在已做的相当成功，并乐意与大家分享经验！

作者: feima+ 时间: 2012-8-16 15:19

脾脏单个核细胞悬液的制备
(1) 大鼠断颈处死后，无菌取脾置于消毒平皿中称重;
(2) 超净工作台上置10cm直径无菌平皿，加入5～10ml D-hanks平衡液，置一80目的不锈钢筛于平皿中，脾脏置于筛网中，用剪刀剪碎脾，用5ml玻璃注射器针芯轻轻捻磨脾脏，使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中， D-hanks冲洗一次；
(3) 用吸管吸取冲洗液，200目的钢筛过滤一次后收集至离心管中；
(4) 1000rpm，离心5～10min，弃上清；
(5) 加入约1ml双蒸水，吸管打匀后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液，然后加入大量D-hanks调节渗透平衡，以***红细胞，但对白细胞没有影响；
用D-hanks液洗涤细胞2～3次，用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml链霉素、10%的胎牛血清的RPMI－1640重悬细胞，调节细胞浓度为5×106/ml，台盼兰染色检测细胞存活率大于95％；
(7) 接种至培养板或培养瓶中。
我摸索了近一个月时间，培养还不错，不过如果要长期培养要加il－2刺激，很高兴和大家分享经验！

作者: yes4 时间: 2012-8-16 15:19

哪位师兄or师姐做过垂体瘤细胞的原代培养，有什么需要特别注意的地方吗？给点指示！我最近在学习中……

作者: 铜雀 时间: 2012-8-16 15:19

我是一个10多年临床医生，说起原代细胞培养我就感到很气愤，因为我在去年读研究生期间为了人类滑膜原代细胞培养走了很多弯路，被很多国内文献欺骗过，请各位战友不要过分相信国内文献的方法，避免像我一样差不多用两个月时间摸索实验条件，在心理紧张的条件下生活。我的文章正在发表，请大家只看不要复制，明年3月份后可以引用我在《中国临床康复杂志》或《中华类风湿杂志》的文章里“材料与方法”中的内容。如果需要实验过程中操作方法图片可以与我联系。
人类滑膜原代细胞培养：
1、将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中（可不要动它），在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室；
2、在超净台中将标本放入培养皿中，加入α-MEM洗涤；
3、获得组织切开，仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织，附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织（可作另一管消化），仔细剔除脂肪组织，用α-MEM洗二次（以去除红细胞），放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎
4、用双倍获得组织的体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟（在此期间震动混匀数次）；
5、30分钟后收集第一管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟，上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织，继续用于消化；
6、离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转，离心6分钟，最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中培养。
7、60钟后收集第二管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转离心6分钟，最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接种到培养瓶中培养。
8、必要时可做第三管细胞收集；并立即作原代滑膜细胞培养。
9、每2-3天换液一次。
体会：
1，虽然国内外文献有组织块培养法获得滑膜细胞，但我试过，没有获得滑膜细胞，可能方法没掌握好或实验条件不同；
2，我探索过用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02%EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化细胞或合用，只有单用collagenaseⅠ有用、最好；
3，机械法很难获得细胞；
4，全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用国产即可
5，必须用Ca－free的PBS。

作者: 铜雀 时间: 2012-8-16 15:22

这是我在研究生期间的实验探索，文章发表在《第一军医大学学报》2004年第五期《s-RANKL体外诱导人外周血CD68+单核细胞分化破骨细胞研究》的“实验方法” 上，在这里主要讨论实验体会，请各位战友批评指正。
人PBMC分离和培养
1，将静脉血20ｍl用ACD抗凝剂以容积比血：抗凝剂＝9：1抗凝处理
2，按血：分离液＝1：2注入国产淋巴细胞分离液上层，400g 20℃离心30分钟
3，交接层重浮于4倍体积的RPMI1640并通过离心法200g，10min洗三次
4，获得细胞可做分选或其他实验。
体会：
1，实验中我用过肝素方法抗凝，但效果不好，因为肝素抗凝后交接层混浊，洗涤后没有细胞。后来是一位老师推荐我用ACD抗凝剂，效果very good
2，实验用的是国产淋巴细胞液（天津TBD），没有用过进口的Ficoll/Paqnl
3，分层时的离心温度只能在20－25℃，过高细胞容易死亡或破坏，过低分层效果不好。我刚开始不知道，试过用5℃离心，其结果是一塌糊涂
4，不能使用角离心机。

作者: 一叶 时间: 2012-8-16 15:24

我是一个10多年临床医生，说起原代细胞培养我就感到很气愤，因为我在去年读研究生期间为了人类滑膜原代细胞培养走了很多弯路，被很多国内文献欺骗过，请各位战友不要过分相信国内文献的方法，避免像我一样差不多用两个月时间摸索实验条件，在心理紧张的条件下生活。

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所以本贴也标明了，希望战友们不是引用文献，而是把自己的经验，将自己的成熟的方法奉献出来，当大家在奉献自己真实的实验经验的同时，大家才能享受到其他人真实的实验经验。

青衫自己也会有一些方法提供给大家，因为做过的原代培养比较多，估计有十来种吧，不希望和大家重复，并且有的方法做得好，有的不好，所以暂时没有贴出来。

作者: plaa 时间: 2012-8-16 15:26

乳鼠肝脏细胞原代培养

一周龄大鼠，断颈处死，活力碘消毒,无菌取出肝脏，于无菌维持液中漂洗，用眼科剪仔细清除肝包膜,韧带,沿肝边缘剪切肝尖组织(绕开肝蒂等)转入青霉素小瓶中，用眼科剪绞碎,剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，加入5倍体积无菌维持液,用滴管轻轻吹打,吸出上层血细胞,再用无菌维持液反复清洗3~5次，加入10倍体积无菌胰蛋白酶消化液,37℃消化，消化过程中不断震荡，至组织块边缘变薄(镜下观),离心(1000rpm,10分钟)弃去上面酶液，用无菌维持液将组织块清洗2~3次，加入新鲜无菌胰蛋白酶消化液重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，1000rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌维持液悬浮，离心，洗1~2次，用20%生长液悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于塑料培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。培养48小时后，换新鲜配置的培养液培养5小时，可除去绝大部分血细胞及杂细胞，37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层肝细胞.

作者: orangecake 时间: 2012-8-16 15:26

看来看去俺那个还是冷门啊
人和大鼠的前列腺基质细胞原代培养呵呵

作者: jkobn 时间: 2012-8-16 15:26

大家好！这是第一次上论坛，请大家多多关照！
有谁做过猪心肌细胞的原代培养，能交流一下吗？
或者在哪里能买到这株细胞？急！

作者: zsxan1990 时间: 2012-8-16 15:27

猪肺泡巨噬细胞的培养可以吗？
1、细胞培养所用溶液及其配制
1×RPMI1640及：按照产品说明配制，过滤除菌，4℃保存备用。
新生牛血清：56℃灭活30min，-20℃保存备用。
2×104U/ml青、链霉素液（双抗）：青链霉素各2×106 U溶于100ml灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚红溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml双蒸水中，NaOH调节pH至7.2~7.5，过滤除菌，分装，-20℃保存备用，使用时1∶10倍稀释。
7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml双蒸水中，115℃高压灭菌15min，置4℃冰箱冷藏备用。
10% RPMI1640营养液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml双抗，用7.5% NaHCO3或10% HCl溶液调节pH值至7.2~7.4。
2、将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS30.0ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，2000r/min离心10min，收集沉淀。洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的1×RPMI1640营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37C CO2培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。

图片附件: 60080991.snap.jpg (2012-8-16 15:27, 61.55 KB) / 该附件被下载次数 9
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作者: TNT 时间: 2012-8-16 15:27

呵呵，来晚了，我养大鼠心肌微血管内皮细胞2年了，方法很成熟，能否呢？

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:28

新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞的原代培养。
将出生2天以内的新生SD大白鼠10只，用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用冷的D-Hanks液清洗并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，将组织剪碎为1mm3，用0.125%胰蛋白酶,37ºC消化10分钟，过滤（200目尼龙滤网），离心（1000rpm 10分钟），去上清，加入DMEM/F12完全培养基（其中含10%胎牛血清，10%马血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml）制成细胞悬液。计数后按5×105/cm2接种于培养瓶。贴附30min后，转移细胞悬液至新瓶中，加入DMEM/F12完全培养基，在37ºC, 5%CO2培养箱中培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上37ºC, 240rpm，摇18小时，去掉悬浮的细胞，用D-Hanks液清洗3次，进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞。经免疫细胞化学法检测，98%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:31

我养过Ⅰ和Ⅱ大鼠星形胶质细胞、神经元。而且养过BHK-21、COS7、C6、和Hela四种细胞，有问题者，可以共同探讨。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:31

神经细胞培养

一．设备：无菌操作设备。

二．大型设备CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜，用于准确地取材。

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。

高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪，pH剂，天平等。

三．培养器皿及手术器械

1。培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2。培养板，24-40孔，可用于开放培养。

3。培养瓶：

4。吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5。各类培养液贮存器。

6。小型手术器械。

准备：

一配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:33

二培养基质常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶

三消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

（一）选材常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

（二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。

（四）抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:33

这是以前的方法，现在有所改进，有现成的神经元培养添加剂：B27,即可。

作者: 911 时间: 2012-8-16 15:33

大鼠肺泡巨噬细胞(AM)分离培养
材料:1、雄性wistar大鼠；2、常规手术器械及注射器若干；3、1.5%戊巴比妥钠(35mg/kg)；4、生理盐水；5、含10％胎牛血清的RPMI1640；6、苔昐蓝；
方法：
取雄性wistar大鼠，体重200－250g，用1.5%戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉后，固定于鼠板上；颈部常规消毒后，剪开颈部皮肤,分离暴露气管,其下穿线；在气管正中剪一V型切口，行手术插管并固定；将约6ml生理盐水注入肺腔，轻揉肺部，抽出灌洗液，重复灌洗10次；将肺泡灌洗液移入50ml离心管中，300g离心5min沉淀细胞；用含10％胎牛血清的RPMI1640重悬AM，将AM浓度调至1×106/ml左右后，平均接种于约10cm培养皿中。在CO2孵箱370C培养2小时换液，用D-Hank’s冲去非贴壁细胞，370C继续培养24小时。苔昐蓝吞噬实验显示，95％以上的AM具有活力。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-8-16 15:34

人脐静脉血管内皮细胞
Ascertained the HUVEC by the presence of factor VIII-related antigen

图片附件: 56954011.jpg (2012-8-16 15:34, 51.65 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13389

作者: 2541 时间: 2012-8-16 15:35

微血管内皮培养来了，望大家讨论，斑竹给加分啊

大鼠心室肌微血管内皮细胞的原代培养
材料和方法
1、  仪器：
手术器械一套，倒置显微镜（Leica）,CO2细胞孵育箱（Heraeus），超净工作台（苏州净化设备有限公司），扫描电子显微镜（Hitachi）。
2、  主要试剂
DMEM高糖培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105单克隆抗体（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗体（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗体（华美公司），抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品，其他试剂均为国产分析纯以上级别。
3、  方法
3.1 植块法原代细胞培养[1]：
细胞培养瓶的处理[2]：选用50ml玻璃培养瓶，高压蒸汽灭菌，瓶底铺自制鼠尾胶（制作方法参见2），移入80℃烤箱烤干，临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。
选用80克SD大鼠（雌雄不限，购自复旦大学实验动物部），1%戊巴比妥钠（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，将大鼠移至超净台进行操作，止血钳固定四肢，逐层打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，由升主动脉处剪下心脏，放入D-Hanks平衡盐缓冲液中，冲净心腔中的血液，辨清心脏解剖结构，去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔，保留左心室，小心去除心内膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方，滴加1ml进口胎牛血清，均匀接种于处理过的50ml培养瓶中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养，使其贴壁，4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶，约48小时后组织块周围有星形细胞长出，80至96小时组织块周围有大量细胞长出，去除组织块，继续培养36-48小时，待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代，取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。

作者: 2541 时间: 2012-8-16 15:36

图片来了，相差显微镜鉴定

图片附件: 12622024.snap.jpg (2012-8-16 15:36, 45.05 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13390

作者: 911 时间: 2012-8-16 15:36

骨髓基质细胞的原代
材料方法
1. 材料：
1.1材料来源：取自健康成人行骨髓内固定术扩髓前收集骨髓腔内骨髓。
1.2主要试剂：
DMEM培养基
胎牛血清（FBS）
β-甘油磷酸钠（β-GP）
维生素C
青链霉素
胰蛋白酶（1:250）-EDTA
1.3主要仪器设备
双人超净台 Farma Scientific美国
单人超净台 Farma Scientific美国
二氧化碳孵箱 Farma Scientific美国
低温冰箱 Farma Scientific美国
倒置相差显微镜 Nikon 日本
细胞培养皿35Ф Corning 美国
6孔、96孔培养板 Corning 美国

2. 方法
2.1原代细胞培养：于髓内钉内固定术扩髓前，用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓，置入预装有DMEM培养液的无菌50ml离心管带至实验室。1000rpm离心10分钟弃上层脂肪，取沉淀细胞加入适量DMEM， 22G针头吹打成单细胞悬液，细胞计数后按所需浓度接种于培养瓶或培养板，加入完全培养液（含青链霉素各100u/ml,体积分数10%的胎牛血清、β-GP 10mmol/L、维生素C 50ng/ml、高糖DMEM）置于37℃,含体积分数5%的CO2 湿化空气孵箱中培养，3天后半量换液，以后隔日全量换液，倒置相差显微镜每日观察细胞生化情况。
2.2传代培养：原代培养至7-8天，细胞接近80%融合倒出培养液，1×PBS清洗两遍，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化细胞2分钟，镜下观察至细胞分离脱壁后，立即加入完全培养液终止消化，细胞刮刀刮除细胞，将瓶内液体吸入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入完全培养液将细胞重悬，并混合均匀计数后接种于培养皿，行传代培养。
以下是部分照片

图片附件: 37274976.snap.jpg (2012-8-16 15:36, 74.91 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13391

作者: 911 时间: 2012-8-16 15:37

另一张

图片附件: 14698488.snap.jpg (2012-8-16 15:37, 104.5 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13392

作者: 969 时间: 2012-8-16 15:37

我是一个10多年临床医生，说起原代细胞培养我就感到很气愤，因为我在去年读研究生期间为了人类滑膜原代细胞培养走了很多弯路，被很多国内文献欺骗过，请各位战友不要过分相信国内文献的方法，避免像我一样差不多用两个月时间摸索实验条件，在心理紧张的条件下生活。我的文章正在发表，请大家只看不要复制，明年3月份后可以引用我在《中国临床康复杂志》或《中华类风湿杂志》的文章里“材料与方法”中的内容。如果需要实验过程中操作方法图片可以与我联系。
人类滑膜原代细胞培养：
1、将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中（可不要动它），在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室；
2、在超净台中将标本放入培养皿中，加入α-MEM洗涤；
3、获得组织切开，仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织，附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织（可作另一管消化），仔细剔除脂肪组织，用α-MEM洗二次（以去除红细胞），放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎
4、用双倍获得组织的体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟（在此期间震动混匀数次）；
5、30分钟后收集第一管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟，上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织，继续用于消化；
6、离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转，离心6分钟，最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中培养。
7、60钟后收集第二管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转离心6分钟，最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接种到培养瓶中培养。
8、必要时可做第三管细胞收集；并立即作原代滑膜细胞培养。
9、每2-3天换液一次。
体会：
1，虽然国内外文献有组织块培养法获得滑膜细胞，但我试过，没有获得滑膜细胞，可能方法没掌握好或实验条件不同；
2，我探索过用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02%EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化细胞或合用，只有单用collagenaseⅠ有用、最好；
3，机械法很难获得细胞；
4，全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用国产即可
5，必须用Ca－free的PBS。

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您好!
看到你的帖子非常高兴。我也在培养滑膜细胞，不过是大鼠的。大鼠的滑膜组织我们没有人能确认，养出来的细胞与文献上不符，可谁也没见过滑膜细胞。按文献操作细胞挺杂的，可能是我们方法不当，您能将原代培养的滑膜细胞图片发给我们看看吗？怎样去除那些脂肪细胞，培养液全是油滴啊：（

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:38

成熟DC的鉴定－－形态、免疫荧光

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作者: 我佛慈悲 时间: 2012-8-16 15:38

图贴错了
成熟DC的鉴定－－形态、免疫荧光

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作者: xue258 时间: 2012-8-16 15:39

那位大虾培养原代造血干细胞、肝细胞、心肌细胞超过20-30天，请指教。

作者: 克隆鱼 时间: 2012-8-16 15:39

怎么没有人做神经干细胞，我来顶一下
实验胚胎小鼠纹状体神经干细胞的分离培养及鉴定

材料
1、  实验动物：孕13d的昆明种二级小鼠。
2、主要试剂
主要试剂  来源
DMEM/F12  GIBCO
rh-EGF  peprotech
rh-bFGF  peprotech
B-27 supplement  GIBCO
HEPES  Sigma
Trypsin  Sigma
Ploy-L-lysine  Sigma
胎牛血清（FBS）  杭州四季青公司
青霉素  华美
链霉素  华美
胰酶阻断剂（STI）  GIBCO
葡萄糖  药剂科制剂室
台盼蓝  西安化学试剂厂
蔗糖  西安化学试剂厂
酚红  西安化学试剂厂
KH2PO4  西安化学试剂厂
Na2HPO4.12H2O  西安化学试剂厂
NaCL  西安化学试剂厂
KCL  西安化学试剂厂
抗-nestin mab  chemicon
抗-βtubulin mab  chemicon
抗- GFAP pab  neomarker
抗- GalC mab  chemicon
FITC 偶联荧光抗小鼠二抗  博士德

作者: 克隆鱼 时间: 2012-8-16 15:41

2、  主要仪器

主要仪器  来源
解剖剪  上海医疗仪器厂
虹膜剪  上海医疗仪器厂
眼科剪  上海医疗仪器厂
离心机  上海医疗仪器厂
自动双重纯水蒸馏器  教保处
微孔滤膜滤器  教保处
MCO-17AC CO2 培养箱  SANYO
XTD-10A体视显微镜  芜湖光学仪器厂
无菌超净工作台  苏州净化设备厂
50ml 细胞培养瓶  NUNC
96孔细胞培养板  NUNC
24孔细胞培养板  NUNC
6 孔细胞培养板  NUNC
倒置显微镜  Leica
OLYMPUS荧光显微镜  OLYMPUS
OLYMPUS光学显微镜  OLYMPUS

方法：
神经干细胞的培养
①原代细胞的培养：取孕13.5天昆明种二级孕小鼠，引臼脱颈处死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐层剖开腹部皮肤、肌肉、腹膜，取出子宫,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔细剥离胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪开颅骨，取出胎鼠脑组织并转移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，体视显微镜下剥离脑膜,分离胎鼠纹状体，仔细剥离血管及脑膜，将收集到的纹状体在D-hanks液中漂洗两次，置于盛有4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪将组织剪碎,加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期间每隔5min震荡一次。500转离心5min, 弃上清，D-hanks液清洗两次，将沉淀细胞重悬于增殖培养基中，培养基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、链霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰抛光的吸管反复吹打，分散组织制成单细胞悬液，吸取9滴细胞悬液、1滴0.4℅台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板在3分钟内计数出活细胞和死细胞（台盼蓝排斥法），调整细胞密度，以105个/ mL接种75mL培养瓶中（NUNC）, 于5℅CO2 培养箱, 37℃培养。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。
②传代培养：当神经球直径大约100um时收集细胞于离心管中，600转离心5分钟，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，吸管轻轻吹打细胞，使之形成单细胞悬液，计数后以104个/ mL接种75mL培养瓶中，于5℅CO2 培养箱, 37℃培养，完成一次传代。此后每隔两天半量换液，5-7天机械分离细胞传代1次。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

作者: BUK 时间: 2012-8-16 15:42

相差显微镜下观神经球

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作者: BUK 时间: 2012-8-16 15:43

相差显微镜下观神经球2

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作者: BUK 时间: 2012-8-16 15:43

神经球nestin荧光染色

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作者: zzzz 时间: 2012-8-16 15:44

我今天第一次上这个论坛是个新手，请大家多多指教，斑竹多多关照！我一直都在做乳鼠的心肌细胞培养，看了上面两个帖子，在补充一点自己的心得：我们用胰酶做了好多次，各种浓度以及与胶原酶的各种复合浓度，觉得效果都不是很理想，细胞状态不大好，后来就单用0.2%的胶原酶，细胞状态很好！48小时左右后开始搏动。
若还有用胰酶觉得不够理想的，请试用以下上面的方法！
以后再有其他体会继续支持！
我的分还是零，请斑竹看在鼓励新人的份上奖励一点！

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我也同意你的看法，胶原酶II型在消化心肌细胞上的确比胰酶好，消化的完全，得量高，细胞状态也完全。但是我用0.1％的浓度就已经很好了，我的胶原酶是问GBICO买的。胰酶+EDTA消化的时候，组织往往聚成团块，而且非常粘稠，使得吸上清很困难。用胶原酶就不会有这种问题。而且胶原酶反复冻融后，效价仍然很好，而胰酶冻融三次后就很差了。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-8-16 15:44

我也在培养乳鼠的原代心肌细胞，用胰酶不加EDTA做过几次，虽然组织块消化不完全，但细胞状态还可以，24-48小时可以见到搏动。
后来改用胰酶和胶原酶2混合液，不过比楼上的浓度低很多，胶原酶2实在不便宜……消化比较完全，但是10只鼠只能提两块六孔板的量，我是做流式需要细胞数比较大。请教各位前辈一般每次提几只？种几个板或瓶？

作者: 小荷尖尖 时间: 2012-8-16 15:45

看到有好多同仁培养大鼠主动脉内皮细胞,我也在做内皮细胞培养,现在看到一种新的大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,正在摸索中,说出来与大家讨论.
材料与方法：
材料 :
1. 培养皿、培养瓶、烧瓶、试管，玻璃针等。
2. 眼科剪、眼科镊、手术刀片。
3. 5%CO2孵箱、PH计。
4. 恒温水浴箱。
5. RPMi1640培养基，D-Hank’s缓冲液、胎牛血清，内皮生长因子（ECGF），青霉素，链霉素,戊巴比妥钠等。
方法：
1.　取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
2.　剪切：在超净台上，将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中，用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1～1.5ｍｍ的环。
3.　接种：将动脉环竖直放入35ｍｍ培养皿(1%明胶4℃预置过夜,用前2ｈ移入ＣＯ2培养箱,用前培养液冲洗)中。置ＣＯ2培养箱2ｈ后,加入1.5ｍl培养基。放入37℃,5%ＣＯ2培养箱中培养。72ｈ后细胞从环内外生长迁出,环内为内皮细胞,环外为成纤维细胞。将动脉环除去后,可看到内膜面细胞集落与外膜面之间有明显的无细胞区界限，用玻璃针剔除成纤维细胞,得到纯的内皮细胞生长克隆。继续培养10～15ｄ，此时FBS浓度为２０％,形成细胞单层。
4.　置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液，培养时添加15% FBS，5～10μg/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待细胞90%~95%融合时，0.25胰蛋白酶消化传代。
5．　内皮细胞鉴定：相差显微镜下,细胞呈单层铺路石状;免疫组化证明有vWF相关抗原存在
6.　注意事项:将分离出来的主动脉热处理时温度以60℃2秒为宜,太低则成纤维细胞多,太高或时间久则内皮细胞迁出减少.

作者: S6044 时间: 2012-8-16 15:45

材料与试剂：
1、  镊子、剪子、培养皿
2、  离心管、培养瓶、吸管、滴管
3、  200目筛网
4、  胶原酶（10ml）『20mg胶原酶、200mg牛血清白蛋白、10毫升双蒸水』国外也用培养基配，我没有试过
原代培养人前脂肪细胞
A 取无菌条件下新鲜切除的人腹部皮下脂肪组织约5－10克，放入培养皿，用1×PBS冲洗2－3次，充分洗去血污，剔除结缔组织和可见血管。
B 充分剪碎脂肪组织为1mm×1mm的小块。
C 将其加入到含有5毫升胶原酶的离心管里，37度水浴振荡消化1小时。
D 将含有组织的消化液加入到有10毫升DMEM/F12培养基的离心管中，并且使用吸管反复吹打使组织块分散，然后通过孔径25μM（200目）的筛网过滤，收集滤液和未过滤的组织块。
E 将滤液以600g离心5分钟弃上清，加入原代培养的基础培养基制成细胞悬液。
F 将未滤过的组织按照上述过程再处理一次，将俩次获得的细胞悬液混匀计数，按照104个/cm2的密度接种于培养瓶里，于37度，5％CO2培养箱中培养。

接种12－16小时基本贴壁。在增殖状态下的前脂肪细胞可以使用胰蛋白酶消化的方法传代，并且可以冻存和复苏。

作者: KGZ564 时间: 2012-8-16 15:46

现将我的论文《视神经少突胶质细胞的体外培养及鉴定》参考文献及图片附上。此文发表于《眼科新近展》2003年6月第3期：151-152。

参考文献

1. Goldberg JL，Barres BA. Nogo in nerve regeneration [J]. Nature 2000; 403(6768): 369-70.
2. 何平，沈馨亚. 少突胶质细胞增殖和分化的研究进展[J]. 神经解剖学杂志2000；16(2)：183-188.
3. McCarthy K D, DeVellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglia cell cultures from rat cerebral tissue [J]. J Cell Biol 1980; 85: 890-902.
4. 伍亚民,马海涵,廖维宏. 大鼠星形胶质细胞和少突胶质细胞的纯化培养与鉴定[J].创伤外科学2000；4：207-209.
5. Raff MC, Miller RH, Noble M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium [J]. Nature 1983; 303(5916): 390-6.

作者: hyuu 时间: 2012-8-16 15:46

请教新生大鼠胃肠道平滑肌细胞培养方法。谢谢！

作者: 一叶 时间: 2012-8-16 15:46

你们用胶原酶消化乳鼠心肌细胞的方法能不能详细的介绍一下！我看一般的文稿都是用胰酶，用胶原酶的配方和注意事项给介绍一下吧！谢谢！

作者: shenkunjie 时间: 2012-8-16 15:47

三、内皮细胞培养
1.脐静脉内皮细胞培养
2.主动脉内皮细胞培养
3.脑微血管内皮细胞培养
4.肺微血管内皮细胞培养

为何没有心脏微血管内皮细胞培养？

作者: dragonkilly 时间: 2012-8-16 15:47

我是新手，看到这真是太好了，对我相当有帮助
强烈建议斑竹把发布各个培养信息的人员联系方式附上，更细节的问题可以请教

作者: tangxin_80 时间: 2012-8-16 15:47

有哪位大侠知道下丘脑弓状核的神经元培养？是否与其他的脑神经元培养方法相同？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-8-16 15:48

现整理如下，力求精益求精。
兔晶状体上皮细胞培养方法和体会：
1、原代培养：健康成年白家兔空气栓塞处死,立即取出眼球,1∶1000庆大霉素生理盐水冲洗干净,置超净工作台无菌操作。角膜缘剪开去除角膜、虹膜,将晶状体前囊膜连同赤道部囊膜撕下,Hank液冲洗,剪成1mm×1mm小块,上皮面向下置25mL组织培养瓶内贴壁培养。把培养瓶轻轻翻转,加入适量的加入含15%胎牛血清的DNEM营养液,囊膜片在瓶内的上面而培养液在下面。置于37℃、5%CO2、95%空气、100%湿度的CO2培养箱中孵育4-6h左右,待囊膜片贴壁后再将培养瓶调回原位,此时培养液覆盖囊膜片而不使囊膜片漂浮,每周换液2次。晶体上皮细胞在接种3天后,在倒置显微镜下可见,植块边缘有新生的细胞爬出,细胞呈规则六边形,大小均匀,胞质透明。一周后可融合成小片细胞。二周后可长满融合成单层细胞。细胞多为类圆形、多角形。

2、传代培养：细胞铺满瓶底或生长到一定密度时,用0.25%胰蛋白酶消化,1∶2传代培养。传代时在培养瓶或培养皿底放置适当大小的盖玻片,细胞生长其上,便于光镜及免疫组化观察。细胞一般24h内贴壁,约3～4d细胞可达融合,融合的细胞和原代相似,大小基本一致。传代超过4～6代时,细胞的增长显著下降,转变成成纤维细胞形、三角形和长形。

3、个人体会：晶状体上皮细胞位于晶状体前囊膜及赤道部囊膜下，单层排列，没有其他细胞成分，是绝对的单一细胞培养。但细胞数量少较难贴壁。所以采用先置于培养瓶待其贴壁后翻转浸入培养液。另外要注意将囊膜剪小，上皮面向下，操作时有点难度的。培养基没什么特别的，用小牛血清也可以，但生长较慢。一般把多个囊膜置于同一培养瓶加大组织密度，效果较好。个人认为最好不用酶消化法，因为本来细胞就很少了。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-8-16 15:48

照片是胶片的，手边暂时没有扫描仪，争取尽快添加照片。

作者: cocacola 时间: 2012-8-16 15:48

有关huvec的有吗？

作者: october7 时间: 2012-8-16 15:49

与楼上不同的是，我想知道肾小管上皮细胞的原代培养。
另外，细胞的鉴定是免疫组化好还是免疫荧光好？
而且阳性率要达到多少以上才可以？

作者: minran_1980 时间: 2012-8-16 15:49

那位老师养过脑微血管内皮细胞？我刚开始培养遇上了一些困难，请帮忙分析以下：
1.微血管段在10倍倒置相差显微镜下是什么形态？我的怎么那么小，难确定。
2.微血管段用胶原酶消化后都是较为浑浊的吗?

作者: huifeng0516 时间: 2012-8-16 15:50

成骨细胞原代培养问题，帮忙解答或提供链接，谢谢！急！
拟用酶消化法。

问：1.如用胰蛋白酶和II胶原酶消化时间安排，条件。
2.如何纯化成骨细胞（去除成纤细胞）。
3.如何促进贴壁，多久可贴壁？
4.第一次换液时间？
5.还有那些注意事项？
我按文献方法培养，48小时才贴壁20%，成纤维细胞长势良好，成骨细胞渐少，呵呵。

作者: dragonkilly 时间: 2012-8-16 15:50

养了３次脐静脉内皮细胞了。但是不是细胞数太少就是有成纤维细胞的污染。唉，看到这个帖子，真是受益非浅啊。

作者: ALALA 时间: 2012-8-16 15:50

怎么没有看到有做大鼠视网膜血管内皮细胞分离与培养的呢?有没有哪位高手做过?能否提供点经验啦!谢谢!

作者: bgf5 时间: 2012-8-16 15:51

有谁成功做过原代滋养层细胞的，请传授点经验及教训，谢谢！

作者: youyou99 时间: 2012-8-16 15:51

我也养胰岛B细胞，各位前辈有何经验请赐教！尤其是培养出细胞后如何分离得到纯度高的B细胞？

作者: skytree 时间: 2012-8-16 15:51

有没有水生动物肝细胞原代培养的，出来指点一下 .

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你好！我在做南美白对虾的肝细胞，有眉目，但方法还得完善，所以还不敢站出来，你在养什么细胞啊？要不我们私下交流一下？

作者: ladyhuahua 时间: 2012-8-16 15:52

小肠上皮细胞

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