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标题: [求助]我的原代人脐静脉内皮老养不好,为什么? [打印本页]

作者: one 时间: 2012-8-29 11:11 标题: [求助]我的原代人脐静脉内皮老养不好,为什么?

我养的是原代人脐静脉内皮细胞,不知道为什么老长不好.从医院拿到脐带,三小时之内做完,用pbs冲洗干净,然后用0.25%胰酶消化十分多钟,收集胰酶消化液和冲洗液(用全培终止消化)于离心管中,以1000rpm,离心5分钟,用15%胎牛血清的DMEM全培重新悬浮细胞,转移到塑料培养瓶中,最初7、8天长的还可以，但以后就开始萎缩，不知什么原因？

作者: skytree 时间: 2012-8-29 11:11

养原代好像培养基最好是另配吧，想你这样得可能条件差点了，原代细胞很挑得，上次有个同学用四季青得胎牛养不出来，换成GIBCO得就都搞定了。

作者: 911 时间: 2012-8-29 11:15

分离脐静脉内皮细胞的实验步骤
1. 选取无HBV、HIV感染，无扭曲、打折、破损的新鲜脐带（20~25 cm）；
2. PBS从一端静脉注入冲洗残留血液；
3. 夹紧一端，从另外一端静脉注入约15 ml胶原酶A液（22 U/100 ml，溶于Hanks液并过滤除菌），控制消化时间在7～10 min（其间可按摩血管以增加内皮细胞脱落）；
4. 注入15~20 ml M199培养基，吸出注入的液体于10 ml 含20％ FCS的M199培养基；
5. 1500 rpm，5 min，细胞重悬于含20％ FCS和10 U/ml bFGF的M199培养基，于1％明胶铺底的一次性培养方瓶内培养生长；
6. 第二天细胞贴壁后换新鲜培养基，以后每2～3天更换培养基；
7. 细胞长满后，用不含Ca2+、Mg2+的PBS清洗，0.25％胰酶短暂消化后，分瓶传代培养。
关键在于bFGF,M199,明胶

作者: one 时间: 2012-8-29 11:16

谢谢楼上的，您这样培养的挺好，是吗？我试一下，希望能好运。非常感谢朋友的热心。

作者: one 时间: 2012-8-29 11:31

难道一次性的培养方瓶（塑料的）也要加明胶吗？bFGF是生长因子吗？和VEGF有什么区别？请指教。

作者: newway 时间: 2012-8-29 14:14

我们实验室养的HUVEC很好，现把主要试剂和配方列出，希望对楼主有所帮助。
（一）主要试剂
1. M199培养基 Hyclone , 美国
2. Hepes Promega, 美国
3. 胎牛血清 Hyclone , 美国
4. Ⅰ型胶原酶 Sigma，美国
5. 青霉素、链霉素华北制药厂
6. 胰蛋白酶 Sigma，美国
7. 内皮细胞生长因子添加物（ECGS） Sigma，美国
8．谷氨酰胺
（二）常用试剂配方
1． M199培养基：
M199培养基 1包
谷氨酰胺 0.292g （超过15天应按比例重新加入）
Hepes 3.0g
NaHCO3 2.0g
超纯水至1000ml
调节pH值至7.2，过滤除菌，分装至100ml盐水瓶，4℃保存。
2．D-Hanks液
NaCl 8.0g/L
KCl 0.4 g/L
Na2HPO4.12H2O 0.135 g/L
KH2PO4 0.06 g/L
NaHCO3 0.35 g/L
葡萄糖 1.00 g/L
超纯水至1000ml
调节pH值至7.4，过滤除菌，分装至250ml盐水瓶，4℃保存
3．青、链霉素储存液
青霉素 80万U
链霉素 100万U
超纯水至4ml
过滤除菌，分装至1ml小包装，—20℃冻存
关于HUVEC分离、传代、鉴定我以前发过帖子，你可以参考一下
1、分离cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3952436&sty=3')
2、传代cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/3957046')
3、鉴定cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3881599&sty=3')

作者: 66小飞侠 时间: 2012-8-29 14:14

我觉得7、8天了，细胞也该传代了啊，再不传代细胞就老死了

作者: yueban-1147 时间: 2012-8-29 14:15

提高血清浓度，通常原代细胞需20%FBS。

作者: whitesheep 时间: 2012-8-29 14:15

你们原代培养的HUVEC真的是2天就全部贴壁吗？我的细胞为什么3－4天才陆陆续续贴壁呀？

作者: one 时间: 2012-8-29 14:15

我也在养原代内皮细胞
只是好象养内皮细胞必须加ECGS
但是现在sigma没有现货
我查了以下上海微科公司有内皮生长添加剂（成分为含促生长肝磷脂），才215RMB，不知道这个效果怎么样
请问各位有没有用过的呀
效果好吗
若可以，可以紧急贴补一下啊
我养内皮细胞已经养的伤心了
请高手们指教下

作者: kswl870 时间: 2012-8-29 14:16

我刚刚开始用ECGS（SIGMA），到时告诉你效果。
如果暂时没有，我看到园子里介绍贝复济，也是一种内皮细胞生长因子，在医院里可以买到的

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