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标题: [求助]SD大鼠乳鼠心肌消化后取上清加入含10%胎牛血清... [打印本页]

作者: XYZQ 时间: 2012-8-29 16:01 标题: [求助]SD大鼠乳鼠心肌消化后取上清加入含10%胎牛血清...

SD大鼠乳鼠心肌消化后取上清加入含10%胎牛血清＋DMEM培养液的离心管中，离心8 min（1000 g/min）后怎么看不到沉淀啊?还是浑浊的?

作者: 缘yuan 时间: 2012-8-29 16:01

一般原代培养分2种，消化或组织块培养，试一试后者，细胞培养的书上都有

作者: kuaizige 时间: 2012-8-29 16:01

楼上战友，我也遇到类似的问题，我的做法是
1、适当提高转速1500转，离心8分钟，最高可达2000转，我试过2000转8分钟，心肌细胞的活性还不错
2、心肌消化后的上清是否粘稠，（同学常把它形容成鼻涕状，呵呵），上清如果粘稠的话细胞沉降速度变慢，也可能得不到沉淀，这时要把握酶的浓度，从0.06-0.25%之间摸索一个最适合自己实验室的，我们实验室选择0.1％的效果不错，还要掌握消化的时间长短，再者，收集上清到离心管的时候不要立刻加培养基终止消化，可以用滴管再吹打几次然后在加培养基终止。
3、要确定上清里的确有消化好的心肌细胞
能想到的就这些啦，希望能对你有所帮助

作者: 铜雀 时间: 2012-8-29 16:02

离心请尽量换算成离心力，因为离心机的型号半径不一样

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:02

我的师姐在养成骨细胞,她说我的培养基里不能加血清,离心得到沉淀后再加有血清的培养液.但我看大家都是加血清的啊.我明天又要处理老鼠了,要好好观察一下.

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:04

请问峰景,上清如果粘稠是酶的浓度太高还是太低了?

作者: remenb 时间: 2012-8-29 16:04

加血清是终止胰酶的消化，时间短不加也行应该。

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:04

我一直认为，在细胞培养中加血清的目的是增加生长因子，有利于细胞生长。在终止消化中血清又有什么作用呢？

作者: 铜雀 时间: 2012-8-29 16:05

酶的浓度高或者低都可能会出现粘稠，消化液粘稠主要是由于死细胞的内容物释放出来所致，也可能是由于消化过度，但是我不知道如何判断怎么的程度算是消化过度，呵呵真是不好意思，可能有点学艺不精。
当用酶消化组织块或者传代的时候如果加入血清就可以终止酶的消化作用。至于原因，园子里有相关的帖子，你可以搜一下。

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:05

我今天处理了5只乳鼠，我用没有血清的DMEM配的0.1%胶原酶，消化后取上清到离心管中后马上离心（转速1200转，离心10分钟）了，每次都能见到沉淀了，离心后倒去上清，加入的也是没有血清的DMEM，放进培养箱中。消化5次后，把几个离心管的合并再离心一次，也有沉淀。接种后看到了很多细胞。不知道明天，后天结果会怎样。虽然这个做法和大家的方法不同，但我认为是可行的，所以今天试了一下，结果如何很快就知道了

作者: 铜雀 时间: 2012-8-29 16:06

期待你的好消息，胶原酶可以用DMEM配制？

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:08

是的。我老板说，我冲洗心脏时也可以用DMEM，将对心脏的损伤降到最低。不过这样有没有统计学意义，不知道哦，但无论用什么方法，只要实验成功就好。
你现在也在培养心肌细胞吗？如果可以，能把你的操作过程发给我看看吗？

作者: 铜雀 时间: 2012-8-29 16:10

是应该将心脏的损伤将到最小，我也用DMEM冲洗过心脏，只不过发现DMEM本身是红色的，不好辨别心脏的血是不是清洗的干净啦，所以后来又换成缓冲液啦，呵呵。

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:10

有道理，是很不好辨别心脏的血是不是清洗的干净啦，我还没有用DMEM洗过心脏，打算试一下，听你这样说还是用缓冲液吧。我在清洗心脏的过程中是一直在冰台上操作的，你是这样的吗？

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:11

今天看了细胞,还是圆圆的,没有贴壁,也没有看到跳动,看来又不行了.哎!

作者: 铜雀 时间: 2012-8-29 16:11

细胞还是透亮的吗？如果是可以再等等

作者: wu11998866 时间: 2012-8-29 16:13

是的,细胞还是透亮的.

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