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标题: [求助]细胞污染的原因。 [打印本页]

作者: 克隆鱼 时间: 2012-8-31 16:34 标题: [求助]细胞污染的原因。

求助：
我使用的是GIBCO的DMEM，加三抗（青链霉素，两性霉素B），新生小牛血清，培养RPE细胞。
反复出现污染，每次都是培养液出现好象薄雾一样的浑浊，细胞背景变得细沙状。
第一次出现污染，将所有的试剂做细菌实验，（即将培养液，培养液+血清，培养液+胰酶，分装入小瓶，放入培养箱），发现是胰酶污染，遂将所有培养用具全部消毒，，重新配置胰酶及培养液。
期间朋友来要了一瓶冻存的细胞，使用DMEM F12培养液，在培养过程中出现类似情况，老师说象真菌感染，遂加入两性酶素B治疗浓度，调整好细胞状态。后未再出现类似状况。

本人在重新复书细胞培养过程中，发现有的复书后即有污染，好不容易找到两瓶好的，传代并冻存，大约一周后，再次出现上述情况。同时发现培养箱中其他人有类似现象。请老师看，说是细菌污染，建议立即扔掉。朋友也说这种现象和她的有区别。没有这么“脏”。

重新复书本次冻存的细胞，连续失败3次，均有污染症状。
怀疑是系统污染。

向上述朋友要了一瓶同样的细胞，使用上述同批配置的新培养液及胰酶等液体，在另外的地方培养。结果传代第二天就出现同样症状。不敢在别人处养了。

同时了解到原细胞培养箱其他人的细胞同样有类似污染症状。
但是，奇怪的是，本人5月14号做原代培养放进去的培养瓶，液体仍十分清透，毫无污染迹象。（注：所使用的细胞培养液不一样）。

再次将将所有的试剂做细菌实验，（即将培养液，培养液+血清，培养液+胰酶，分装入小瓶，放入培养箱），3天培养液仍清亮。同时其他人如法炮制，未发现培养液污染。

为什么会污染？？
分析原因：
1.  细胞冻存过程中有污染？
但是朋友拿的是我5月19号冻存的细胞，拿回去虽然出现类似现象，但老师看象真菌，加两性酶素B后即调整过来。且朋友说看来和我的污染不太一样。同样的老师也说我的看上去象细菌污染。
而且我从朋友那里重新拿来的细胞，在其他地方养，传代一次即出现同样污染的表现。所以看来不太象细胞本身的问题。
2.  使用原料污染？
朋友的细胞好好的，同时我不在原系统培养，但传代一次即污染，别人的细胞都好好的，看来应该仍然是原料的问题。但是为什么培养液细菌培养阴性？
3.  本人操作过程污染？
我养细胞已经5个月了，不能算是新人。自己觉得操作过程还算正规。但是反复出现类似情况，同时其他人也有相同的污染表现。而且换了地方，只传代一次就出现类似表现，细胞液明显浑浊，觉得也太快了。
4.  系统污染？
但是为什么换了地方还会这样？
5.  原料有问题？
会不会是这次购买的DMEM有问题？（污染者的共同点）有能通过滤膜的毒素？一旦和细胞接触就会大开杀戒？

我真的郁闷死了。想哭。好象什么办法都想尽了，换地方，换原料，换细胞，为什么还是出现同样的污染表现？求求各位大侠，各位高手，你们有遇到过这种状况吗？还有可能是什么原因呢？

作者: 克隆鱼 时间: 2012-8-31 16:35

这是我细胞在状态还比较好的时候的照片，但已经出现污染征象了，还有小黑点。

图片附件: 21306660.snap.jpg (2012-8-31 16:35, 43.63 KB) / 该附件被下载次数 124
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13524

作者: misswu61 时间: 2012-8-31 16:35

我看应该是细菌污染！不知道你能否在显微镜下看到象线状的东西来回窜！如果是的话，应该就是细菌了！

对你的培养箱进行一下彻底的消毒吧！

作者: zsxan1990 时间: 2012-8-31 16:35

你三抗加多大浓度的？一般青链分别是终浓度为：250u/ml,250ug/ml
而且抗生素一般是抑制细菌真菌生长，并不杀死它们，是不是你们实验室的试剂污染了，建议你实在不行加万古霉素试试，特别注意及时清洁培养箱和超净工作台。检查酸池的酸是否过期，灭菌设备是否工作正常。

作者: ROSE李 时间: 2012-8-31 16:36

首先要排除原材料污染问题,在使用前,检查原料(培养基和胰酶等)是否污染.如果实在不确定就用一次性少量的过滤器再滤一下,可能浪费一点钱,但可以排除一个原因.
第二:灭菌效果.检查灭菌锅有没有坏.之前实验室也发生污染,原因是灭菌锅的压力表坏了,那时候也找不到原因,后来才发现是灭菌锅,真是苦恼啊
第三,如果怕培养箱是污染的,可以把盖子拧紧,如果怕ph值变化太大,可以添加hepes,一般长得快的瘤细胞是很好养的,盖子拧紧也可以.
如果不是以上原因,就是您操作的问题了

作者: lagua123 时间: 2012-8-31 16:36

听我一句，养细胞我养了四年了。细胞种类不下15种。

你的问题：细沙样一层。传代一次后出现。
我说是bacterial contamination.

Do as followings

1. Throw away everything that you used.Including all the medium, FBS, PBS, Trypsin.
Anything that you have opened once in the previously culture, pls throw away. No need test them like culturing them seperately in the incubator.

2. Stop culture 1 week.

3. Thaw new freezed cell in newly prepared reagent.

4. Wait and see.

作者: bongte 时间: 2012-8-31 16:39

有没有考虑过是培养瓶不干净的缘故，如果你用的不是一次性的培养瓶的话，我有一次也遇到了污染问题，最后才找到是培养瓶的原因。
不过，有时做实验就是很邪门的，你可以先歇一会再做，到时问题自然就解决了。我的一个师兄就是这样做的。

作者: u234 时间: 2012-8-31 16:40

出现细沙状和小黑点多数是支原体污染。可以查查支原体的引物，然后，培养细胞培液24小时，取少量做PCR看看。我们实验室最近正在遭受支原体污染，真是倒霉。如果真是支原体污染，建议扔掉细胞，重新化细胞。或者加庆大霉素，不过效果不是很好。

作者: 克隆鱼 时间: 2012-8-31 16:41

衷心感谢各位朋友的回复！！
首先回应上面两位朋友的问题：
1.肯定不是压力锅的问题。因为同时有另外一个实验室使用消毒锅，非常稳定；
2.使用培养瓶，有一次性的，有玻璃瓶，但都有污染；
3.所配置的培养液（包括养细胞就死的那几瓶），在温箱里已一周，未见污染。
4.所用三抗，为GIBCO成品。按10% 使用。但其他朋友甚至在培养液没有添加常规抗生素，照样生长旺盛。
5.所用酸液，同时其他人使用，未见污染。

我最近也请教了许多老师，老师们的意见，认为还是细菌感染，(实践证明抗真菌，使用加量两性霉素B无效）。昨天在一瓶培养液发现了好像吸丝状的东西，同时检查冰箱，发现4度冰箱的培养液均有摇起来见浑浊（已加血清及三抗）。

一位有经验的师兄说，看上去像支原体感染。
但是请教一位老师，老师根据症状判断是丝状杆菌，认为污染源很可能在冰箱。

我目前的打算：

1.停做实验已四天，抛弃所有已污染细胞；同期发现其他人细胞继续污染。说明大家肯定有一个共同的环节污染。
2.重新购买培养基及血清（目前已配置的培养基，及尚未开封的都暂时不用）消毒所有的待用品。
3.跟其他几位商量，暂时停养细胞，彻底消毒实验台，培养箱；
4.清理冰箱；
5.检测支原体。
6.将以前冻存的细胞拿到其他朋友处清代为复苏，观察。

有朋友对支原体感染有经验吗？？

我会继续汇报，非常感谢大家的回复！！！
希望能够挺过去，否则真的好惨！！！

感谢楼上各位，希望你们继续顺利实验下去！！

作者: 园丁## 时间: 2012-8-31 16:41

检测支原体污染的最简便的方法有染色和PCR：
1．  染色（DAPI）
由于细胞状态差时也可能有一些小碎片能染色，因此需要加入阴性对照细胞。例如取生长良好且PCR检测支原体为阴性的小鼠fibroblast细胞，将怀疑污染支原体的细胞培养液取一部分加到fibroblast细胞上，培养3天以上后可进行DAPI染色，同时也取正常的fibroblast细胞作为对照。这种方法由于可能培养了支原体，因此存在一定风险。
染色过程：配固定液（3份甲醇1份乙酸）。细胞一般培养在玻片上或4孔皿内。以1/10培养液量向细胞培养液中加入固定液，预固定2分钟。弃培养液，再加固定液固定10分钟，开盖干燥5分钟。加入DAPI（母液1mg/ml,工作浓度0.5ug/ml ,1：2000稀释于水）染色5分钟。蒸馏水洗一次即可观察。

2．  PCR（严格的讲，每次鉴定需要两个人独立进行。特别是对刚得到的细胞，必须在一个相对隔离的环境中检测无支原体污染后方可进行实验。对那些需要连续培养的细胞每隔1个月就应当检测一次）
常用的PCR手段检测支原体污染有两种：一步法和两步法。
一般两步法敏感性非常高，可检测少到1个支原体基因组DNA的量，因此假阳性的可能性增加了。两步PCR在进行第二次PCR时要非常小心，因为第一步产生的支原体DNA可能污染其他管子，造成假阳性。这种方法一般用于检测培养液或经过特殊抗生素处理后的细胞。
一步PCR法检测：待检测细胞需要在无抗生素条件下培养至少3天（不换液），由于在存在抗生素的条件下支原体生长被抑制，可能使PCR检测不到实际的污染。同时，若PCR检测结果阳性，也不一定表示一定有具有活性的支原体污染，因为经过特殊抗生素杀灭支原体后可能有残留的支原体DNA存在，这种情况必须将细胞连续传代几次后再做PCR。
步骤：取1ml细胞培养上清（不换液，不加抗生素条件下培养3天以上），13000g离心6分钟，弃上清，PBS洗两便沉淀。加100ul PBS重悬沉淀，95℃处理15分钟。然后可抽体DNA，取1ul 做PCR。若不抽提DNA，可将加热后的样品（可用蛋白酶K处理）分几个稀释度后直接做PCR。若做经过特殊抗生素处理的细胞支原体检测，必须在抗生素处理后连续无抗生素培养2周以上，期间在传代几次，保证没有残留的支原体DNA。

PCR的假阳性：
1）  残留支原体DNA，不存在有活性的支原体
2）  PCR操作过程中的污染
3）  PCR试剂中本身含有支原体DNA（例如Taq酶本身来自细菌）

PCR的假阴性：
1）  支原体的含量不在PCR的检测范围内
2）  PCR过程中Taq酶被细胞抽体物抑制，因此最好加入支原体的内参。

支原体污染的挽救：
一般情况下最保险的方法将污染的细胞高压后丢弃。若不得不挽救，常用的抗生素如下：（Until now, three groups of agents were shown to be highly active against mycoplasmas: macrolides, tetracyclines, and quinolones）。可以一类和两类合用。

作者: 园丁## 时间: 2012-8-31 16:44

支原体属于没有细胞壁的一类特殊的细菌，由于其柔韧性，支原体能通过0.45um的过滤器。支愿体生长比细菌缓慢，需要1~3小时甚至更长。同时支原体生长有一个较长的平台期，因此可能需要1星期才能发现明显的污染现象。大多数mycoplasma帖附在细胞壁上生长，但也有少数能穿透细胞膜进入细胞生长。由于细胞培养过程中P/S的广泛使用，常使支原体污染被抑制而不是完全消灭，这种在显微镜下看不见的污染现象同样是危险的。更可怕的是，支原体在液氮中无需保护也能生存，因此有人将细胞保存在液氮的气相中。
细胞培养过程中支原体污染的来源见下表：
Table2 . Sources of mycoplasma contamination
• Original (primary) tissue isolate (<1%)
• Culture reagents (predominantly fetal bovine serum) 目前较少见
• Laboratory staff 常见（大部分细胞污染的支原体是人的寄生菌）
• Cross-contamination from infected cultures 最常见,实验室中发现的支原体污染常是同一种类
当处理已经被支原体污染的细胞时，操作过程中产生的微小液滴是污染的主要来源。这个难以避免的污染源将污染培养瓶、培养液和环境，从而使其他未受污染的细胞发生交叉污染。其次，研究人员口腔中的支原体飞溅也是重要的污染源。
支原体污染后对细胞的影响非常广泛，细胞生长和大多数实验数据都将受到影响，部分影响由下表列出。
Table 3. Effects of mycoplasma contamination on cell cultures
• General effects on eukaryotic cells:
– Altered levels of protein, RNA and DNA synthesis
– Alteration of cellular metabolism
– Induction of chromosomal aberrations (numerical and structural alterations)
– Change in cell membrane composition (surface antigen and receptor expression)
– Alteration of cellular morphology
– Induction (or inhibition) of lymphocyte activation
– Induction (or suppression) of cytokine expression
– Increase (or decrease) of virus propagation
– Interference with various biochemical and biological assays
– Influence on signal transduction
– Promotion of cellular transformation
– Alteration of proliferation characteristics (growth, viability)
– Total culture degeneration and loss
支原体污染的常见表型有：细胞生长变慢、细胞活力下降、贴壁细胞漂起、出现许多黑色小颗粒。

作者: 园丁## 时间: 2012-8-31 16:44

支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,M.FermentaneATCC19989发酵支原体 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原体 ,M.HominisATCC23114人型支原体 ,M.OraleATCC23714口腔支原体 ,M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体。其共同引物序列来自16s和23s保守区域，外部引物为Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；内部引物为Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。

作者: kulee 时间: 2012-8-31 16:45

我的细胞也是同病相连啊!

作者: yapuyapu 时间: 2012-8-31 16:45

革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌天然对青霉素就有抗药性，加双抗是没有用的呀！

作者: 克隆鱼 时间: 2012-8-31 16:45

太感谢了！
很可能是感染支原体，因为我的培养液+胰酶是在培养箱放了1周才浑浊的。
因为积分不够，自己的帖子看不到回复，郁闷.....

作者: is2011 时间: 2012-8-31 16:47

我的细胞也是支原体污染，表现和各位讨论的很相似。因为是国内建系的，比较便宜，就重新买了一株，结果，买回来就是细胞之间有黑粒，而且感觉细胞表面粗糙。查资料时发现书上说世界上30－50％的细胞都存在支原体污染。而我们这里大家许多人都拿着半死不活的细胞在继续试验，唉！真的有防不胜防的感觉。各位还有什么高招吗？

作者: TNT 时间: 2012-8-31 16:47

细菌污染拉，应该时培养箱的问题，好好清洁一下，还有最好把细胞培养实验室整个清洁。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-8-31 16:51

我的细胞也碰到污染问题，前后两次正好相隔一个月。第一次培养无菌生长，那时刚开始养细胞不到一个月，给师姐一吼都蒙掉了，现在也想不起是什么样的表现了。这一次有经验了，低倍镜下见培养基中漂浮着云雾状的小颗粒，摇动培养皿看得更明显。200倍下看，细胞上贴了一层黑黑的颗粒，没有见到会乱窜的细菌。培养结果是“嗜麦牙寡氧单胞菌”，用CIFRAN（悉复欢，临床所用针剂）10微克/毫升的终浓度，处理后未见同样的污染。
细胞污染是大问题。现在细胞虽然抢救回来了，但状态并不好。

作者: nn255 时间: 2012-8-31 16:52

我实验也出现一片沙子一样的东西，怀疑是支原体污染，用Roche的试剂处理没有效果，后来发现用胰酶消化可以将大量的颗粒消化下来，然后继续培养，可以减轻症状，细胞生长好一些，建议如果细胞珍贵，可以考虑这个做法吧，但首先你的细胞不是那么容易消化下来的那种

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