标题:
[求助]如何提取细胞的上清？
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作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:06
标题:
[求助]如何提取细胞的上清？
请教大家，想检测细胞上清中蛋白的活性，当细胞生长至对数生长期时，先用无血清的培养基处理细胞24小时后，再用药物处理，如何提取细胞上清呢？和提取细胞的蛋白有什么区别呢？
作者:
yes4
时间:
2012-9-4 13:07
应该和提取细胞总蛋白一样。因为你检测的是细胞中蛋白的活性。
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:07
我不是检测细胞中蛋白的活性，检测的是细胞分泌的蛋白的活性，所以要提起上清，还请大家多指教。谢谢!
作者:
sunnyB
时间:
2012-9-4 13:07
你可以看看这个:
有兴趣请:
applygen@gmail.com
蛋白抽提试剂盒-II (液体样品蛋白抽提和回收，100 extraction)
P1255 100 次提取 280 元
200 次提取 480 元
描述：
蛋白抽提试剂盒-II 用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等。适用于各种液体样品(10 µl～1000 ml)，如蛋白溶液、胞浆胞核蛋白提取液、细胞或微生物培养基上清液、血液、尿液、脑脊液等各种体液。蛋白回收率95%，远高于经典的丙酮或三氯醋酸沉淀法，且可有效去除样品中的脂质，不影响后续SDS-PAGE和Western Blot实验。可用1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，15分钟完成提取，简便高效。
次试剂盒也适于从细胞悬液提取总蛋白。实体组织和细胞总蛋白提取可用蛋白提取试剂盒I (Cat# P1250: Tissue/Cell Protein Extraction Kit)
适用：
(1). 溶液、血液、尿液、脑脊液、培养上清液、胞浆胞核蛋白提取液等各种体液的蛋白浓缩和提取。
(2). 原代或传代细胞悬液，可按液体方式提取总蛋白。
组成：
浓缩抽提试剂50ml。每0.5 ml浓缩试剂可处理100 µl溶液或5 x 106细胞。100次微量或10次大规模浓缩。
储存：
室温
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:08
非常感谢帮助！
我想知道不用试剂盒的方法，毕竟经费有限啊！
还请多指教，谢谢！
作者:
dotaaa
时间:
2012-9-4 13:08
细胞裂解液你可以自己配,但蛋白酶抑制剂(一般都用5种)你还是得买呀,而且不一定比买这个盒子便宜.不信你问问那5种蛋白酶抑制剂多少钱?!280够用100次不贵了,老大.
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:08
谢谢，这几种蛋白酶抑制剂我们实验室都有，现在我主要想知道提取细胞培养液的上清和提起细胞的蛋白的区别? 谢谢 ！
作者:
xingyi08
时间:
2012-9-4 13:09
我想,你提培养液上清,那这个提取试剂至少还有个浓缩的作用吧?还有或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等,提总蛋白的时候只是一点沉淀中加入裂解液.不能一样的对待的.
祝你实验顺利!
作者:
yes4
时间:
2012-9-4 13:09
请教大家，想检测细胞上清中蛋白的活性，当细胞生长至对数生长期时，先用无血清的培养基处理细胞24小时后，再用药物处理，如何提取细胞上清呢？和提取细胞的蛋白有什么区别呢？
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第一步,将细胞上清转移到10毫升的试管,离心3000转5分钟,去掉死细胞和杂质
第二步,明确你的待查蛋白含量有多高,从你的说明看来,好象是细胞处理后分泌出来的蛋白.如果高,可以直接取样裂解后,跑WESTERN.如果含量很低,一般都要求浓缩.浓缩方法有很多种.我的实验直接使用MILLIPORE的超滤管(价格,4ml的40元).上面战友提供的试剂盒,价格还是很合理的,就是不知道质量怎么样.如果质量好,我也想试一试.此外还有很多化学浓缩方法,可以搜索蛋白质技术版块.另外,我也没有加蛋白质酶抑制剂,我的蛋白也没有降解.你可以试一试,如果也能测出来,就可以剩掉蛋白质酶抑制剂的钱了.很贵的,我们实验室有用罗式公司的,象药片,很好用.
作者:
u234
时间:
2012-9-4 13:10
在药物处理的时候，使用无血清的培养液还是全培养液，是药物溶于培养液中吗？一般作用多长时间？谢谢！
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:10
你好，我的确是检测细胞处理后分泌的蛋白质的活性，主要是用酶谱法检测基质金属蛋白酶的活性，我想知道的是细胞上清，指的是用无血清的培养基处理细胞24小时后，直接吸出培养基，离心除去死细胞以及碎片后的成分就是上清吗？但是这种情况下要加多少无血清的培养基呢？我所要检测的蛋白的浓度和这关系很大，如果量多的话，那得到的上清也多，但是蛋白的浓度也许不太大，一般说来，癌细胞分泌的MMP的浓度比较大，我没有检测过浓度，所以还不确定要不要浓度样品。我想知道上清的确切的来源？非常感谢帮助！
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:11
怎么处理药物以及作用时间取决于你要做的实验，最好查权威文献支持，我们也可以多交流！
作者:
园丁##
时间:
2012-9-4 13:11
离心除去死细胞以及碎片后的成分就是上清。
显然是不能够通过蛋白定量来确定的。
最简单的方法就是严格控制你是实验条件，即细胞接种密度一致，处理药物量一致，处理的时候加的培养基也要一致。这样最后离心上清后，取等体积的上清进行实验。
另外，你可以参考文献做法。一般文献都会讲的。如果要做绝对含量，可能类似ELISA，还需要搞到他的纯化蛋白，做标准曲线。然后根据你的等体积后测量出来的值，换算成绝对含量值。
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:11
你的建议非常有道理，但是我还有些不太明白，就是你说不能通过蛋白定量来确定，但是如果不进行蛋白定量的话，那上样的时候每个孔 的蛋白的上样量不一样，跑出来的带有可比性吗？在做western的时候不是要保证每个上样孔的蛋白总量是一样的吗，那跑出来的带的大小，深浅就说明目的蛋白的含量的差异造成的。当然我暂时先不做western，先做酶谱法检测MMP的活性。我很困惑，希望能得到大家的帮助啊！
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:12
还希望大家多多帮助啊！
马上要做实验了，请大家多指导！
如果先用无血清培养基处理细胞后，再用药物干预的时候是用有血清的培养基还是用无血清的培养基呢？
作者:
qhyu
时间:
2012-9-4 13:12
其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
作者:
园丁##
时间:
2012-9-4 13:13
你的建议非常有道理，但是我还有些不太明白，就是你说不能通过蛋白定量来确定，但是如果不进行蛋白定量的话，那上样的时候每个孔 的蛋白的上样量不一样，跑出来的带有可比性吗？在做western的时候不是要保证每个上样孔的蛋白总量是一样的吗，那跑出来的带的大小，深浅就说明目的蛋白的含量的差异造成的。当然我暂时先不做western，先做酶谱法检测MMP的活性。我很困惑，希望能得到大家的帮助啊！
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因为正常无血清培养的正常细胞上清,基本是没有蛋白的.如果要蛋白定量,你的上多大体积的样才能保证与处理组相同蛋白量.因此,较为科学的方法就是等体积检测.
作者:
园丁##
时间:
2012-9-4 13:14
还希望大家多多帮助啊！
马上要做实验了，请大家多指导！
如果先用无血清培养基处理细胞后，再用药物干预的时候是用有血清的培养基还是用无血清的培养基呢？
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应该还是无血清培养基
作者:
mamamiya
时间:
2012-9-4 13:14
我想请教大家，我的细胞是杂交瘤细胞，我要提取细胞上清抗体的含量，能使用huangxb010 说的方法吗？
作者:
mamamiya
时间:
2012-9-4 13:14
其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
作者:
star#room
时间:
2012-9-4 13:15
谢谢大家的帮助！
还想请教大家上清的蛋白如何浓缩呢？具体常用的有哪些方法呢？其价格分别如何呢？有没有比较操作方便，简单价格又比较便宜的方法？（就是那种性价比好的）
再次谢谢大家了！
作者:
loli
时间:
2012-9-4 13:15
楼站友帖子的内容就是一种蛋白浓缩试剂盒,具体你可找该站友问问.
作者:
园丁##
时间:
2012-9-4 13:16
其实这个问题很简单。你收集细胞上清的目的是要测定上清中蛋白的活性。你依然可采用常规蛋白的一些方法。其中稍微改变就行了
1、收集细胞上清，可通过透析浓缩或者PEG6000沉淀浓缩，因为你的蛋白含量肯定低，所以第一步是要富集蛋白，便于纯化收集。
2、当浓缩后，就是纯化蛋白，可通过柱层析纯化，或硫酸铵沉淀纯化，以前者较好。
3、检测活性。
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你要检测含量，有ELISA就好呀，反正你的蛋白是抗体嘛。要是提取的话最好用rProteinA柱子，亲和层析效率特别高，既可富集又可纯化，经这一步后，蛋白纯度就能到90%以上。
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