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标题: [求助]尼氏染色鉴定海马神经元 [打印本页]

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:10 标题: [求助]尼氏染色鉴定海马神经元

我在培养海马神经元，镜下观察：24h贴壁良好，前3-4天细胞也可以，可是在继续培养感觉看到的细胞就越来越少，我用尼氏染色法染了几张片子，可是看不出哪些是神经元，那些不是，尼氏染色是不是只有神经元染色？3-4天以后的细胞，虽然镜下看着很少，但尼氏染色后细胞很多，几乎连成一片，是不是不是神经元了？我用或不用阿糖胞苷处理，似乎也没有很大的区别？
问题：
1、神经元尼氏染色正常情况下应是什么样子？非神经元细胞染色吗？是什么样子？
2、上述几乎连成一片的细胞，是不是不是神经元了？
希望尽快得到有经验同行的指导，以求实验能继续往下进行。多谢了！

作者: TNT 时间: 2012-9-9 10:10

尼氏染色好像鉴定神经元特异性不强，我也在鉴定神经元，最初也想用尼氏染色，但是文献上基本没有用这种方法，只是在非常古老的一本组织化学方面的书上（80年代出版）提到过，认为这是一种经典的鉴定神经元的方式。现在大部分都用免疫组化的方法鉴定，如MAP2与GFAP的双染， NSE染色， NF染色。
你有图片吗？有图片可以让大家帮你看看

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:11

好，谢谢各位战友，我这就贴上几张上来。。。

以下几张分别是在同一条件下培养相同的时间（大约14天左右）—— ，但是染出来的细胞形状、数量差别很大，显微镜下观察第二张细胞数目比较密集，数量较多，不知以下几张图片中哪张更像是神经元细胞，不知为何会出现这种差别，恳请请各位战友指点为盼，多谢！

第一张：
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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:11

第二张：

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:11

第三张：

图片附件: 59478112.snap.jpg (2012-9-9 10:11, 30.72 KB) / 该附件被下载次数 30
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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:12

第四张：

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:12

第四张上深染的又是什么？是死了的神经元细胞吗？我现在正培养的一批细胞前3天很像第一张的样子，以后就越来越像第二张的样子了。而且培养皿中几乎看不到像第二张中成片的细胞，染出片子来才能看到。
盼望得到战友们的指导，谢谢！

作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:12

尼氏染色在分色恰当时只有神经元染色，可以看到明显的空泡状核以及明显的核仁。你的第四张照片深染的细胞才是真正的神经元！给你贴张图看看。图中深染的是神经元。

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:13

多谢！
再请教一下：神经元未染色前在镜下观察也能很清楚的看到吗？我现在养着的细胞（11天的），镜下看到的很少，而且好多都是圆的没有突起，有的突起很短，生长正常的神经元不应该是这样吧！能否介绍一点这方面的经验?

作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:13

在倒置相差显微镜下观察，神经元应该看的很清楚，尤其是培养11天的，镜下可见神经元突起长，分支比较多。你所说的没有突起的细胞可能是杂细胞，比如剥膜不干净可导致成纤维细胞污染。

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:14

这说明我培养的神经元细胞几乎没有成活。能否再介绍一些成功培养神经元细胞的经验呢？

作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:14

神经元是非常娇气的细胞，对分离的条件培养基要求非常苛刻，但是一旦成功培养，可生长长达一个月。个人认为培养神经元要注意：
1 剥膜一定要干净，要在解剖镜下仔细剥干净
2 一定要用poly-L- lysine 铺板，使神经元更好的帖壁
3 使用进口的胎牛和马血清
4 培养基的PH 值很关键，我个人培养过数种不同类型的细胞，发现神经元是最脆弱的细胞，尽管其培养过程不是很复杂，所以一定要调节好试剂的PH 值，包括胰酶的酸碱度。宁可偏酸一些也不要偏碱。
5 园子里在图片仓库里贴的神经元的照片非常漂亮，神经元的立体感很强，你可看看。

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:15

那培养基和胰酶的PH是多少最合适呢？我现在用PH试纸调的是7.0左右，是否合适？

我用的种植培养基是：10％胎牛血清，10％马血清，1％双抗，1％谷氨酰胺，加入DMEM/F12 至100ml。
24h贴壁后换维持培养液：
5％马血清，1％双抗，1％谷氨酰胺，加入DMEM/F12 至100ml
胎牛血清是国产的。是否合适？

作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:15

是这样的，我们配培养液时PH 值一般都是在 7.2左右，但是液体在放置一段时间后可能变碱，这可以从颜色上看出来。
我们是在24h 后换用B27无血清培养基（Gibcol）。
国产的胎牛恐怕不太好，建议用Gibcol或者Hyclone的血清。

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:15

请再帮我看看这张照片是不是海马神经元，谢谢！

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:16

再发一张

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作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:17

很遗憾，这两张图所染的都不是神经元。
尼氏染色所染的是细胞浆内的粗面内质网和核糖体这些嗜碱性物质。神经元只有胞浆染色，核不着色，呈空泡状。你仔细看我的那张图片可以隐约看到浅染的部位，即细胞核，放大倍数后可清楚看到细胞的核仁。
而你的照片深染的却是细胞核，看起来像是成纤维细胞。肯定不是神经元了！
另外，要提醒你的是如果你要鉴定神经元，最好用NSE免疫组化法，尼氏染色特异性不强。
还有一点，当神经元长到十天左右，其突起很长而且比较多，交错形成网络，肉眼即可鉴定。

作者: is2011 时间: 2012-9-9 10:17

我也是养海马神经元的，之前养的还行，但不知为什么节后细胞一直生长不好，贴壁细胞数量少，不知什么原因？还请高手指点啊，多谢了！

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:17

我在取材时，感觉剥膜不是很干净，除了技术原因也有实验条件的原因吧， llljjj上次说的成纤维细胞污染是不是指如果剥膜不干净，成纤维细胞会长的很多，而影响神经元细胞的生长，甚至使神经元细胞死亡呢？正如我上面所照的照片及我在镜下所看到的：几乎没有神经元细胞？

作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:18

成纤维细胞生长的原因就是剥膜不干净所致。最好选择在解剖镜下剥膜，这中间存在一个技术性的问题，需要熟练。
可以加阿糖庖苷抑制细胞的分裂生长，包括神经胶质细胞和成纤维细胞。
成纤维细胞的增殖太快了，肯定会影响神经元生长的。
4月27号发的第四张照片可以看到神经元，其他的就不好说了。

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:18

以下几张照片中深染的应该是神经元吧，可是看不到空泡状的核，是染色技术造成的？我的染色方法比较简单：
1. 4%的多聚甲醛固定1h，pbs漂洗
2. 1%的甲苯胺兰染液染色15-20min
3. 95%的酒精分色
4. 37C干燥，二甲苯透明，中性树胶封片

能否介绍一下你做尼氏染色的材料和具体步骤？

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:19

20倍1-20

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:19

20倍2-20

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:20

20倍3-20

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:20

20倍4-20

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:21

20倍5-20

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:21

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:22

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:22

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作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-9 10:23

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作者: kulee 时间: 2012-9-9 10:23

所贴图中深染的细胞是神经元，但是还是杂细胞居多。
尼氏染色方法很简单，你所用的方法完全可以。要看到空泡状核，你可以控制脱色时间，时间长一点的话就可以看到空泡状核了。
祝你成功！

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