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标题: 【求助】乳鼠心肌细胞的培养问题 [打印本页]

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 15:54 标题: 【求助】乳鼠心肌细胞的培养问题

最近做心肌细胞培养，怎么都不出结果？不知是何原因？我在园中转了一圈，还是没有找到根源，请各位高手帮忙分析一下，到底哪出问题了？
我取的是出生2天的乳鼠，共12只，剪取心脏,用冷的D-HANKS漂洗两次，转入青霉素小瓶剪成1mm3小粒,然后用0.08%胰酶10ml消化，转速为60r/min,每次10分钟，吹打1分钟，DMEM培养基终止,离心1000转/分，8分钟。共4次就没有组织块了。用100目滤网过滤，收集细胞悬液，计数，加0.1mmol/L5-Brdu,以3×10的5次方接种于24孔板.
8小时后观察发现细胞没有贴壁的,而且象是死细胞,因为悬液里是一些不很透亮的东西,也不是很圆.不知到底是什么?
我又试着用胶原酶消化了一次,结果还是不行.假如说胰酶损伤细胞,那胶原酶应该没有影响啊?可为何还是什么都没有?
我去年冬天也按同样的方法,细胞长的很好,可现在怎么都不行,我所用的试剂是1月份配的,培养基在4度冰箱里,酶在-20度里,都让别的同学试过了,没有问题,可到底是什么原因呢?百思不的其解......我很着急,请各位前辈给予指导!
谢谢了!!

作者: HPLC使者 时间: 2012-9-9 15:54

消耗时候转速太快了，基本上10－20r/min就可以了，我以前也是转速太快，几次就消耗的没有组织块了，但是就是没有细胞。

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 15:55

不过我看文献上有报道用100转的啊？
以前也是这个转速啊？会不会还有其他的原因啊？你们是一直
用胰酶消化吗？

作者: HPLC使者 时间: 2012-9-9 15:55

还有其他问题，如吹打是否太过用力，离心转速600r/min就可以了，离心1－2分钟，中止消化的培养基是否加血清了，取心脏的时间长短，乳鼠是否处死再取心脏，消化时温度控制温度吗？乳鼠最好3－4天的，分离完细胞后，用台盼蓝染色看看。

作者: 阿k 时间: 2012-9-9 15:55

你遇到的情况和我刚做实验时差不多，我相你的胰酶浓度低，而且时间作用有点长，造成消化过度，我现在用0.25%的胰酶170－180rpm.5min.不用再吹打，直接吸出来,用含10％FBS的MEM,终止消化，再洗两次就可以预贴壁了，不过心脏剪的不要太小，一个心脏大概分成6－7份就可以，这样是为了让细胞一层一层消化下来，可能时间上花的长一点，但是效果很好

作者: u234 时间: 2012-9-9 15:56

可能的原因：
1.你的试剂一月份配的，放置时间太久了建议重新配。
2.磁力搅拌器转速不可太快否则容易损伤细胞。
3.终止消化时是否加了胎牛血清。
4.8小时后观察贴壁太早了吧，一般心肌细胞要24-48小时才能贴好。
个人意见仅供参考^_^

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 15:57

还有其他问题，如吹打是否太过用力，离心转速600r/min就可以了，离心1－2分钟，中止消化的培养基是否加血清了，取心脏的时间长短，乳鼠是否处死再取心脏，消化时温度控制温度吗？乳鼠最好3－4天的，分离完细胞后，用台盼蓝染色看看。

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哦，可能是我吹打太用力了。心肌细胞那么脆弱啊？消化时温度很重要吗？我们的磁力搅拌器没法控制温度。有一次我用烧杯加了水再把含有心肌的锥形瓶放进去，可总是飘，温度也控制不好，结果细胞都死了。用摇床可以吗？摇床可以控制温度和转速，但是不能用搅拌子了啊，我也没有试过，不知是否可行。离心时间太短没有细胞沉淀啊？有时还有絮状的东西。怎么回事啊？请赐教！谢谢！

作者: u234 时间: 2012-9-9 15:57

心肌细胞很脆弱，分离步骤尽量要小心，稍微有点剧烈很可能造成细胞死亡。
烧杯里的水可以少放一点，但是要不断补充热水进去，并且吸出一些水，以防水太多，锥形瓶漂起来。最好用个温度计看着水温，一般35－37度，千万别超过37度。摇床我试过，效果很差，因为是空气加热，可能液体升温很慢。
离心时间可以长一些，但是转速最好在1000r/min以下。离心下来的絮状东西，可能是吸液体时把未消化完全的组织吸出来了，这个影响不大，换液就没了。每次吹打完后，静置一分钟左右，这样组织沉下去，吸取上清就不大会把组织吸起来了。吸的时候轻一点。

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 15:57

非常感谢大家，不过我想问一下，胰酶浓度太高了不会损伤细胞吗？你的胰酶是用什么配的啊？如果组织块太大能消化下来吗？你所说的一个心脏大概分成6－7份是什么意思啊？你通常做几只乳鼠啊？还望赐教！

作者: u234 时间: 2012-9-9 15:58

胰酶一般浓度在0.1%就行了，用PBS配制，可能楼上说的方法是剪的时候组织块不用剪太小，这样可以提高消化用胰酶的浓度。一般通常每次做10只乳鼠，具体还要根据你细胞的用量定，一次做20－30只的也有。

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 15:58

心肌细胞很脆弱，分离步骤尽量要小心，稍微有点剧烈很可能造成细胞死亡。
烧杯里的水可以少放一点，但是要不断补充热水进去，并且吸出一些水，以防水太多，锥形瓶漂起来。最好用个温度计看着水温，一般35－37度，千万别超过37度。摇床我试过，效果很差，因为是空气加热，可能液体升温很慢。
离心时间可以长一些，但是转速最好在1000r/min以下。离心下来的絮状东西，可能是吸液体时把未消化完全的组织吸出来了，这个影响不大，换液就没了。每次吹打完后，静置一分钟左右，这样组织沉下去，吸取上清就不大会把组织吸起来了。吸的时候轻一点。

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谢谢！我按你的方法再试试吧。对了，你一直都是用胰酶消化吗？试过胶原酶吗？哪个效果更好呢？希望能指教。能和你联系吗？

作者: vvmmoy 时间: 2012-9-9 16:02

乳鼠心肌细胞消化都是用胰酶的，胶原酶是用来消化成年大鼠心脏的。

作者: zzzz 时间: 2012-9-9 16:03

楼上说的对，我每次做十几只，每个心脏剪成6-7 块，胰酶的浓度还可以，不会消化过度

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 16:03

非常感谢大家的帮助,今天有一个意外的惊喜与大家分享.前几天做的原代,本以为没有细胞了,放在孵育箱里没管,偶然一看没想到长的还挺好,真是奇迹啊!呵呵!托大家的福啊! 乳鼠今天也出生了,真是高兴啊!正好试着改进一下方法.

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 16:03

我按照你指点的又做了一次,可很失望啊!这次连成纤维细胞都没有.郁闷啊!
绞尽脑汁,还是什么也想不出来.
这次我温度控制在35-37度之间,0.1%的胰酶,转速20转/分,但是中间出了点问题,第一次消化完之后,组织块都团在一起了,怎么吹打都不开,我想可能是转速太低了,就调到35转/分,最终还是有一点组织团,消化5次后剩余的那些放弃了.当时我觉得消化的还不错,离心完了都能看到细胞沉淀,没有以前那些絮絮的东西.可结果还是很不妙,细胞看着象是贴壁的,圆圆的小亮点,但就是不伸展,已经三天了.我很着急啊!到底是什么原因啊?在实验室都已经半年了,到现在什么都没做出来,心里发慌.我的细胞还能培养出来吗?还望指点! 如果可以,能把你们的详细操作步骤告诉我吗?不胜感激!

作者: gmjghh 时间: 2012-9-9 16:08

关于转速的问题在消化过程中不是很严格，我们实验室没有磁力搅拌器，每次都是在37度的温箱中用手摇晃的，胰蛋白酶的浓度和你所用的厂家的酶的单位有关，不是说别人的浓度一定适合你的，具体是用胶原酶还是用胰蛋白酶还是两者和用和你自己的经济条件和实验目的有关，用胶原酶消化的细胞质量的确是比较好的，就是胶原酶比蛋白酶贵。细胞培养本来是很简单的事情。
其实细胞培养不贴壁的问题无非是三个原因：
1.所用的贴壁的器皿，比如培养瓶的干净程度，材料。处理不好的贴壁容器细胞不会贴的，只要消化的有细胞，和其他的过程无关，当然前提是酶不能完全把膜破坏的不象样；
2。所用培养基的酸碱度经长时间放置后是否重新调节，所用的培养基中是否补加了长时间放置后需要补加的成分；
3，最重要的一点是所用的血清的浓度和质量，如果血清成分特别好，如果是国产的，一定用肽牛血清，排除了以上的原因，没有理由细胞不贴壁的。我这样培养的细胞可以用来做膜片钳的！
望好好考虑以上原因，应该可以很顺利的，祝好运！

作者: gmjghh 时间: 2012-9-9 16:08

乳鼠心肌细胞消化都是用胰酶的，胶原酶是用来消化成年大鼠心脏的

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我感觉这是误导，用胶原酶消化的乳鼠心急细胞的质量比单纯胰蛋白酶消化的质量要好的多，根本没有胶原酶只用来消化成年大鼠心脏的说法。消化乳鼠心脏本来有三种方法：胰蛋白酶法，胶原酶法和EGTA法，或者三者中两两相配。

作者: orangecake 时间: 2012-9-9 16:09

关于转速的问题在消化过程中不是很严格，我们实验室没有磁力搅拌器，每次都是在37度的温箱中用手摇晃的，胰蛋白酶的浓度和你所用的厂家的酶的单位有关，不是说别人的浓度一定适合你的，具体是用胶原酶还是用胰蛋白酶还是两者和用和你自己的经济条件和实验目的有关，用胶原酶消化的细胞质量的确是比较好的，就是胶原酶比蛋白酶贵。细胞培养本来是很简单的事情。
其实细胞培养不贴壁的问题无非是三个原因：
1.所用的贴壁的器皿，比如培养瓶的干净程度，材料。处理不好的贴壁容器细胞不会贴的，只要消化的有细胞，和其他的过程无关，当然前提是酶不能完全把膜破坏的不象样；
2。所用培养基的酸碱度经长时间放置后是否重新调节，所用的培养基中是否补加了长时间放置后需要补加的成分；
3，最重要的一点是所用的血清的浓度和质量，如果血清成分特别好，如果是国产的，一定用肽牛血清，排除了以上的原因，没有理由细胞不贴壁的。我这样培养的细胞可以用来做膜片钳的！
望好好考虑以上原因，应该可以很顺利的，祝好运！

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谢谢!不过我也用过胶原酶,但是细胞没有贴壁.培养基用前我也补加了谷氨酰胺,还有什么需要加的吗?血清我是用的国内的胎牛血清,15%的.膜被破坏了是什么样子啊?是细胞破碎吗?胶原酶也会损伤细胞吗?

作者: yaya0127 时间: 2012-10-12 16:34 标题: 求助

我最近刚开始养乳鼠心肌细胞，想请教一下高手们就是乳鼠心肌细胞消化可以用CO2培养箱吗，还有就是在消化过程中摇晃是不是很重要，我们实验室由于比较匮乏，我都是把它直接放在培养箱中消化10分钟左右拿出来，中间没有摇晃，做了几次老是没有细胞，心中很郁闷，不知道什么原因，还有用一次性的培养瓶培养是否需要铺板，希望园内的前辈们能给我帮助，心中很急，谢谢大家。

作者: yaya0127 时间: 2012-10-12 17:38 标题: 回复 #2 HPLC使者的帖子

你好，看到你培养的细胞很成功了，心里非常羡慕，我最近做了几次心肌细胞培养，可都看不到细胞，也不知道什么原因，想请教您，消化的时候是在无菌环境中还是一般的环镜中，我们实验室资源有限，没有磁力搅拌器什么的，所以我是把它放在培养箱里消化的，中间也没摇晃过，从放进去到拿出来在加上处理差不多得十多分钟，消化过程中是不是摇晃很重要啊？消化后的上清液我最后一起离心的，中间也没有放在冰台上操作，离心的最后离心出的东西很少，不知道什么原因，心里很着急，希望您能够提点建议，非常感谢。

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