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标题: 【讨论帖】骨骼肌卫星细胞培养 [打印本页]

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 12:53 标题: 【讨论帖】骨骼肌卫星细胞培养

骨骼肌卫星细胞培养互助小组成立了，请支持！
由于课题关系要养骨骼肌卫星细胞.

骨骼肌组织中的成肌细胞主要以骨骼肌卫星细胞的形式出现。骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞，其被激活后，与成肌细胞一样具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。离体培养肌卫星细胞是研究肌细胞生长发育规律、了解肌细胞形态结构变化以及进行肌肉生长发育相关基因功能研究的重要手段。骨骼肌卫星细胞最早从大鼠骨骼肌中分离出来，如今在人、鸡、羊、牛及猪等物种上都已成功分离出骨骼肌卫星细胞，并进行体外培养。

我是采用胶原酶消化法，从肌肉组织中分离骨骼肌卫星细胞。我已经用小鼠试了一下，结果不好。应该是我的技术不过关，而且采取的小鼠骨骼肌样太少了。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 12:54

我想做骨骼肌卫星细胞培养的肯定还有其他的战友，在此开辟一个小空间，希望大家能构互相交流，互惠互利，一起漂亮顺利的完成试验！
谢谢！！

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2697533&sty=1')

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 12:54

提供大家一篇好的文章
关于骨骼肌卫星细胞的。
需要的战友请跟贴！

Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology

J Appl Physiol 91: 534–551, 2001.
THOMAS J. HAWKE1 AND DANIEL J. GARRY

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 12:56

以下是我个人参照相关文献所做的培养骨骼肌卫星细胞的步骤和经验，仅供参考啊：
SD大鼠，麻醉后在无菌条件下取大腿肌组织，在培养皿内用Hank’s液冲洗血液3－4次，加入适量的青霉素和链霉素预防污染，尽可能去除脂肪、肌腱、肌膜等结缔组织。冲洗后将组织块放入已消毒的青霉素小瓶内，剪成1mm3或更小的碎块，然后移入离心管中，Hank’s液反复吹打3次，每次静置1分钟后，均弃去上清液体及漂浮组织。向组织块中加入0.1％Ⅰ型胶原酶，约组织块的5倍，在37℃下消化60分钟（其间摇晃数次），弃去上清，再用0.25％的胰蛋白酶，37℃下消化30分钟（其间摇晃数次）后，加入生长培养基（DMEM/F12，20％胎牛血清，1％青霉素－链霉素）终止消化，反复吹打，依次滤过100、200和400目的不锈钢网，滤液收集后，离心（1000rpm）10分钟，弃上清，细胞团块用含生长培养基重新悬浮。
红细胞不贴壁，随换液而去除；为减少成纤维细胞的污染，通过差速贴壁法进行纯化：成纤维细胞贴壁速度快，1小时后就可贴壁，而骨骼肌卫星细胞1小时尚未开始贴壁。因此，培养1小时后吸出培养基，其中主要为没有贴壁的骨骼肌卫星细胞。
将悬液接种于培养瓶中，37℃5％CO2孵箱中孵育1小时，弃去培养瓶，细胞经台盼兰染色计数后种植于一次性培养瓶中，37℃5％CO2孵箱中培养。

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 12:56

由于骨骼肌卫星细胞位于肌纤维的肌膜与基底膜之间,细胞连接紧密,使其能抵抗一般消化酶的作用。胶原酶能够很好地分离单根的肌纤维,起到分离肌束的作用，但不能分离肌束上的卫星细胞，而胰蛋白酶和链霉蛋白酶才能使骨骼肌卫星细胞由基底膜与肌膜之间释放出来。【ROSENBLATT.JD,LUNT.A,ARRY.DJ. satellite cells from living single muscle fibre explants】

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 12:57

刚分离出来的骨骼肌呈圆形，折光性较强，首次换液可在三天后进行，可见到有梭形或纺锤形的细胞，随培养时间的延长，细胞的生长有一定的方向性，部分区域并可有肌管形成。
另外还可以用组织块法培养，约一周可见组织块周围有梭形的细胞爬出，但只是部分组织块周围有细胞。
给大家提供几篇英文的文章：
1 Development of Approaches to Improve Cell Survival in Myoblast Transfer Therapy
2 Primary Mouse Myoblast Purification, Characterization, and Transplantation for Cell-mediated Gene Therapy
3 Satellite cell proliferation and differentiation during postnatal growth of porcine skeletal muscle
太大了传不上，有需要的pm我

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 12:57

谢谢楼上战友提供宝贵的试验经验！
我有一个问题想问一下：我200筛过滤后，接种培养，但是到我换液时培养基里面很混浊，象有一成白沙（或絮状吧）铺在上面，待我第二次换液时还是有，而且我发现细胞浓度很低（我分离了3天了，细胞浓度很低）！

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 12:58

我用150目筛网过滤接种培养，培养基里面也是混浊的，显微镜下观察，主要都是一些破碎的肌纤维碎片，一开始我也害怕，还以为是被细菌给污染了呢，不过它们好像不贴壁啊，换液就能去除大部分的。
细胞浓度低可能有一些原因吧：动物的年龄、所取组织块的大小、组织块尽可能的剪碎、消化时酶的用量、消化的时间温度等等，还有与培养液的成分是否有关，许多文献提到了鸡胚提取液，但我一直没有买到，不知道哪里有买的

作者: any333 时间: 2012-9-10 12:58

求助：
我在分离肌卫星细胞时碰到的主要问题：（1）肌肉碎屑太多（2）细胞数量少（3）对肌卫星细胞形态还认识不清（第一次做），与其他杂质、细胞分不清，那位前辈能发几张原代培养未染色图片吗。（4）血细胞怎样清除。
谢谢！

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 12:59

对啊
希望高手先发几张图片过来！

战友写道：1）“我用150目筛网过滤接种培养，培养基里面也是混浊的，显微镜下观察，主要都是一些破碎的肌纤维碎片，一开始我也害怕，还以为是被细菌给污染了呢，不过它们好像不贴壁啊，换液就能去除大部分的“”-----可是等我第2次或者第3次换液的时候，里面还是有混浊，即使我换液的时候洗得很干净！
2）“许多文献提到了鸡胚提取液，但我一直没有买到，不知道哪里有买的 ”------------是啊，我也一直没有买到鸡胚提取液，打算自己做，没办法！

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 12:59

刚分离出来的骨骼肌呈圆形，折光性较强，首次换液可在三天后进行--------------------3天？我分离后要是等3天后换液，我的培养瓶里面就会铺上一成厚厚的絮状沉淀！而且培养基就会变成很黄的颜色！

作者: ritou1985 时间: 2012-9-10 13:00

最近一直在看文献，发现不管中文还是英文文献，在骨骼肌细胞的用词上往往给人一种混淆的感觉。例如中文：成肌细胞和肌卫星细胞是否是同一概念，英文中myoblast与satellite cell是否为同一概念，myogenic cell、muscle derived cell等也是经常使用的单词，具体含义是什么，我觉得有必要予以探讨。

已查到实验室常用大鼠成肌细胞株为L6细胞，其来源、细胞特性、培养特性如何，体内注射后是否能逃避宿主的免疫排斥，能否长期存活？

同时希望希望战友在骨骼肌卫星细胞原代分离、培养的细节方面给予具体的指导。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-10 13:00

我分离培养卫星细胞的方法如下，愿与大家共同学习。
取3日龄SD大鼠，无菌条件下取四肢骨骼肌组织，用Hanks液冲洗血液，剪碎后加入0.5%胶原酶II 4mL,0.1%透明质酸酶4mL，37℃消化20 min。用吸管吹打，200目尼龙网过滤组织碎片，1 000 r/min离心清洗3次，去上清。加入1%链酶蛋白酶（pronase）37℃消化20min以释放卫星细胞，加入带血清的M199终止消化。在离心管中加入2mL 60% Percoll，2mL 20% Percoll，缓慢加入2mL细胞液，800g 离心20min，取60% Percoll与20% Percoll分界面处的细胞，用无血清培养基1 000 r/min离心清洗3次，记数，接种于培养瓶中37℃，5% CO2 培养。细胞平均72h传代一次。

作者: summerxx 时间: 2012-9-10 13:01

成肌细胞株为L6细胞,请问哪里有卖的？

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:01

:你的细胞会不会是被污染了啊，我没碰到过这种情况，经验不够，还是请高手指点一下吧．
血细胞也是不贴壁的，换液时也能去除啊
我前两天刚照了一下照片，但不小心给曝光了，下次再照吧，有机会再传上来

作者: summerxx 时间: 2012-9-10 13:02

发一张肌卫星细胞HE染色照片

图片附件: 97135906.snap.jpg (2012-9-10 13:02, 23.37 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13799

作者: summerxx 时间: 2012-9-10 13:02

再传一张分化融合为肌管的照片

图片附件: 39428550.snap.jpg (2012-9-10 13:02, 27.25 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13800

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:03

你的细胞会不会是被污染了啊，我没碰到过这种情况，经验不够，还是请高手指点一下吧．
血细胞也是不贴壁的，换液时也能去除啊
我前两天刚照了一下照片，但不小心给曝光了，下次再照吧，有机会再传上来

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是啊，我也是认为被污染了！
我发现养原代很烦啊！我实验一直进展不顺利！

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:04

成肌细胞、肌卫星细胞和肌肉干细胞
成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞。心肌、平滑肌及骨骼肌在胚胎发育中，都经历了由间充质细胞分化为成肌细胞，再分化为成熟肌细胞的过程。一般认为，成熟个体的心肌和平滑肌组织不含成肌细胞，而骨骼肌组织中成肌细胞是以肌卫星细胞的形式存在。肌卫星细胞位于肌纤维的肌膜与基底膜之间。一旦骨骼肌受损，卫星细胞就会被激活，大量分裂、增殖，相互融合形成再生肌纤维。
1. 骨骼肌组织中成肌细胞是以肌卫星细胞的形式存在
2. 正常是参与骨骼肌损伤修复的成肌细胞就是卫星细胞
3. 有一类干细胞为单能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。
4. 根据损伤骨骼肌激活肌卫星细胞的原理,采取刺激成年大鼠及猴骨骼肌的方法,将骨骼肌卫星细胞激活为成肌细胞
5. 正常情况下，骨骼肌卫星细胞具有一定分裂、增殖能力，卫星细胞的数目不会随时间增加而增加。因为分裂产生的成肌细胞会融合入邻近的肌纤维中，使肌纤维细胞核增加，可达数百个，同时使肌纤维增粗、变长，完成肌纤维的发育
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以上都是列举的文献中的知识点，我想请问大家一个小问题：
成肌细胞、肌卫星细胞到底是什么关系？从1.2.3可以看出其实肌卫星细胞就是成肌细胞。但是4.5却可以说成肌细胞是肌卫星细胞分化来的。而且我在外文相关网站和文献上看到肌卫星细胞可以分化成成肌细胞（有图看到成肌细胞和肌卫星细胞的大小形状不一样）。但是亦有人说成肌细胞＝肌卫星细胞。是不是成肌细胞是肌卫星细胞在某种情况增殖的一个阶段性产物？有研究者是培养成肌细胞，有的是肌卫星细胞？
哈，小弟对细胞知识了解不多，还望各位战友赐教！

好像肌卫星细胞就是成年期的成肌细胞，是不是啊？
我想肯定一下

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:04

询问大家一些信息：
大家培养细胞时用的国产的离心管等一些小东西是那家公司的？
还有细胞筛我找了很多公司都没有找到啊～！

作者: 阿司匹林 时间: 2012-9-10 13:05

我的师兄的硕士毕业论文是骨骼肌卫星细胞的离体培养及其调控的研究，不过我们是搞动物育种的，实验动物不是鼠，不知合适不合适。

作者: 阿司匹林 时间: 2012-9-10 13:06

楼主。请问你在哪，如果可能的话，最好能把我师兄的毕业论文全文给你。因为会比较详细，应该会有你想要的资料，

作者: 阿司匹林 时间: 2012-9-10 13:06

楼主，骨骼肌卫星细胞的原代培养就是不好养，而且也比较麻烦，我也是养了好长时间才稍有成果的。多参考一下文献，从各个地方找原因，能解决的尽量解决。
细胞筛上海生工有售，离心管有什么特殊要求吗？很多公司都有售啊

作者: tangxin_80 时间: 2012-9-10 13:07

嘿嘿,我养的细胞传了3代然后细菌污染了啊,现在发现大量的亮点,应该是细菌啊,昨天晚上我在高倍镜下发现有细菌移动呢!我现在正在补救呢!看来是挂了啊.请问，细胞筛上海生工有售?都多大的啊?不会很大吧,直径多大呢?多高啊?我上次买了几个足可以拿来蒸包子啊,你说我怎么用啊,所以就退了啊!我的细胞照了一点照片啊,可是还没有拿回来啊,而且没有染色啊,还是楼上群有的HE染色的图片效果好啊,哦照的不好啊!改天照好了发一点上来!想问问群友的HE是自己配的还是买的啊?那个公司有成品啊?多谢多谢啊@!

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:07

战友，请问你在哪，如果可能的话，最好能把我师兄的毕业论文全文给你。因为会比较详细，应该会有你想要的资料，

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---------这个“师兄”做的是猪的骨骼肌培养！
我查了很多文献，发现做不同的物种还是有很大差别的！
但是我按这个“师兄” 的方法做猪的骨骼肌培养，效果不好，我做了2次了，都失败了。
但是 flag hebo 按照老鼠的方法来分离猪的骨骼肌相反还取得了一定的结果！
这我就奇怪了，做老鼠的和做猪的从一些试剂到方法步骤有很大的不同啊！

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:08

这我就奇怪了，做老鼠的和做猪的方法步骤有很大的不同啊！
而且用的胶原酶都不一样！

要是没有一个可靠的方法，到时候分离出来的细胞是不是骨骼肌卫星细胞都很难说啊？
如果细胞都不能确定还谈何后续研究啊？
真是郁闷！

作者: lixi559 时间: 2012-9-10 13:08

"要是没有一个可靠的方法，到时候分离出来的细胞是不是骨骼肌卫星细胞都很难说啊？
如果细胞都不能确定还谈何后续研究啊？"

啊校说得很对啊!我下一步打算做鉴定啊!现在在联系抗体呢!

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:09

看样子还是要弄一下HE染色！

作者: lixi559 时间: 2012-9-10 13:09 标题: 回复 #28 气泡的帖子

是的啊!我想买点配好的he哈!你知道那里卖的有啊?

作者: wood533 时间: 2012-9-10 13:09

我们试验也要求用到骨骼肌细胞，最好是人的，但是我问了好多地方都没有。有的地方卖的还太贵，要4000多。不知道各位大侠能不能帮帮忙啊。实在不行有大鼠的也行。拜托了。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:10

你可以到万方数据库中下载
输入骨骼肌卫星细胞就可以了

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我们试验也要求用到骨骼肌细胞，最好是人的，但是我问了好多地方都没有。有的地方卖的还太贵，要4000多。不知道各位大侠能不能帮帮忙啊。实在不行有大鼠的也行。拜托了。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:12

你要骨骼肌细胞，还是卫星细胞？成熟肌细胞是终末分化细胞，只能原代培养，没有细胞系的！
卫星细胞倒是有细胞系，如小鼠的C2C12，人的应该也有，你到ATCC去查一下就知道了！

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:12

不同的动物方法好像是有点不大一样，我也没有太多的经验。分离出来的细胞是不是骨骼肌细胞可以做一下免疫组化来鉴定的嘛，发几张我照的照片跟大家一起学习一下。欢迎大家提出意见
这是组织块法培养出来的

图片附件: 60629238.snap.jpg (2012-9-10 13:12, 20.35 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13801

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:13

再来一张

图片附件: 50643028.snap.jpg (2012-9-10 13:13, 15.58 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13802

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:13

消化法的

图片附件: 38808339.snap.jpg (2012-9-10 13:13, 21.09 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13803

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:14

再来一张

图片附件: 38808339.snap.jpg (2012-9-10 13:14, 21.09 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13804

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:14

又一张

图片附件: 15807936.snap.jpg (2012-9-10 13:14, 33.24 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13805

作者: lixi559 时间: 2012-9-10 13:15

楼上的,你的细胞没有污染吧?那些黑点点是死细胞吗?

你说的"免疫组化来鉴定"我恨郁闷啊,怎么鉴定啊,偶么的抗体啊,郁闷之极啊!只有鼠的啊,杂拌捏?

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:16

细胞没有被污染，那些黑点点有些是显微镜的杂质，没办法，只有这条件，呵呵。细胞是没有染色的，那些是细胞核。

鉴定细胞可以用结蛋白（desmin）免疫细胞化学法，也可用a横纹肌肌动蛋白，myosin等，需要买相应的抗体和试剂盒

作者: zwsyrt 时间: 2012-9-10 13:16

多谢了，气泡。我打听到湖南一家卖骨骼肌细胞，来源是人，800每株。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:18

不客气！

我也准备做结蛋白（desmin）免疫细胞化学染色（ABC法吧？）
到时候在请教！

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:18

最近我又做了一次
发现纯化是不是很难啊?
我头天晚上接的种,第2天换的液
结果我发现长满了成纤维细胞!
我差速了50分钟
明天再看结果! 希望ing.........

作者: cocacola 时间: 2012-9-10 13:19

看来你的细胞的数量还是很多的呀，第二天就长满了，但你怎么确定那些就是成纤维细胞呢
有文献做过差速贴壁18个小时的，还有时间更长的，那样会更纯一些。【Development of Approaches to Improve Cell Survival in Myoblast Transfer Therapy 。Zhuqing Qu等1998年】
你用的是什么培养基呢，建议你用F-10，文献上讲在这种培养基里成肌细胞生长占优势，成纤维细胞不占优势【Primary Mouse Myoblast Purification Characterization and Transplantation for Cell-mediated Gene Therapy Thomas A.Rando，1994】
再还有一个方法：不要管它，让它长去吧，消化传代的时候再差速贴壁一下，效果应该会好些。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:19

因为我不确定接种的密度，只是凭自己的一些感觉接的种。
而且我怕接种太多之后弟二天培养液变浑浊（我以前就有这种现象），里面有很多杂细胞和死细胞，组织碎片什么的。
头天晚上接的种，我第二天来看时，还是有一些浑浊（不是污染），于是我换了液（我想这会损失很多的卫星细胞吧？），张到2－3天基本就长满了，我怎么确定那些就是成纤维细胞呢？因为我们这里有老鼠的成纤维细胞系，我看过其细胞形态什么的跟我的一样。当然2－3天张满的细胞里面肯定有一部分是卫星细胞。于是我就用消化传代差速贴壁法。

我差速贴壁用的是1个小时，不知道太长还是太短（1个小时后看成纤维细胞很多都贴壁了）。
培养基我用的是F-12（我分离的方法是参考“猪骨骼肌卫星细胞的离体培养及其调控的研究”上的）
我培养基里面没有鸡胚提取物，所以可能卫星细胞贴壁很慢（因为即使过夜培养，里面还是有很多择光性很强的小亮点（应该是细胞吧）存在，所以我觉得纯化可能不大好做）。

而我有一个同学他分离后第一次接种就不管他了（他3天都不换液），然后用2小时差速来纯化细胞。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:20

最近一直在看文献，发现不管中文还是英文文献，在骨骼肌细胞的用词上往往给人一种混淆的感觉。例如中文：成肌细胞和肌卫星细胞是否是同一概念，英文中myoblast与satellite cell是否为同一概念，myogenic cell、muscle derived cell等也是经常使用的单词，具体含义是什么，我觉得有必要予以探讨。

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是啊，我也有同感！其实很早以前我也就这个问题发过贴子了：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2697533&sty=1')

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:20

成纤维细胞
大家可以当作是与骨骼肌细胞的对照了
还比较典型吧

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-10 13:21

我在培养猪的成肌细胞，那位有经验，交流一下。
用哪种酶消化好，时间多长。是否必须添加鸡胚提取液。

作者: 气泡 时间: 2012-9-10 13:21

鸡胚提取液最好是加了
经验吧
不过我一直都没有买到！
打算自己做了

作者: shenkunjie 时间: 2012-9-10 13:22

我想请问各位高手，我的细胞是L6。它在ATCC上面好象是称为myoblasts,如果用这种细胞作为转染靶细胞，是否需要让它培养成myotube才可以转染呀（我是要模仿离体骨骼肌的一些特征）。但是myoblasts和myotube是什么形态我也不知道。在由myoblasts变成myotube时候需要加入刺激剂吗还是直接用普通培养基就可以了？

作者: ququer787 时间: 2012-9-10 13:23

非常感谢！我最近也碰上了个大问题，做了好几次都不成功，消化时间不好掌握，请各位兄台帮帮忙。小弟感激不尽！

作者: star#room 时间: 2012-9-10 13:24

Down 了一篇好东东，希望对大家有用。

Chapter 1: C. Rehfeldt, I. Fiedler, and N.C. Stickland. Number and size of muscle fibres in relation to meat production. In: Muscle Development of Livestock Animals - Physiology, Genetics, and Meat Quality (Editors, M.F.W. te Pas, M.E. Everts, and H.P. Haagsman). CABI publishers, Wallingford, Oxfordshire, UK, 2004.

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-10 13:24

各位好!我刚刚要开始培养骨骼肌细胞,请多多指教.
请问percoll哪个厂家有卖啊?我定了一个厂家,她们给我拿的淋巴细胞分离液.二者不是一回事吧?还有鸡胚提取液,哪里有卖呢?谢谢!!

作者: TAT 时间: 2012-9-10 13:25

大家好，辛苦了
我也做骨骼肌卫星细胞
想请教以下：
各位用的消化酶的用量具体是多少？

作者: 49888 时间: 2012-9-10 13:25

我在跟着师姐培养兔骨骼肌卫星细胞,她是采用的组织块法,不用酶消化,直接接种到一次性培养瓶中,大约5-6天开始有卫星细胞从部分组织块周围长出,但量很少,12天左右长出细胞的组织块周围已经有大量的细胞,非常密集,同一方向排列,但没有长出细胞的组织块周围就一片空白,如果这样的话,应该什么时候传代呢,这样下去是不可能扑满瓶底的啊,而且我们的细胞是用于心肌移植的,一定要传代才能进一步纯化和增加数量,请高手指教,谢谢

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-10 13:25

我也做L6细胞,但是诱导比较难,有的能诱导,有的就不好诱导.不是很稳定.
做传代是一定不能让细胞长的过密了,不能超过70%
不知道这次从上海细胞库买的L6会怎样.难啊,老板又叫我做原代,看起来更不容易啊

作者: 小螺号 时间: 2012-9-10 13:26

骨骼肌卫星细胞培养互助小组成立了，请支持！
由于课题关系要养骨骼肌卫星细胞.

骨骼肌组织中的成肌细胞主要以骨骼肌卫星细胞的形式出现。骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞，其被激活后，与成肌细胞一样具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。离体培养肌卫星细胞是研究肌细胞生长发育规律、了解肌细胞形态结构变化以及进行肌肉生长发育相关基因功能研究的重要手段。骨骼肌卫星细胞最早从大鼠骨骼肌中分离出来，如今在人、鸡、羊、牛及猪等物种上都已成功分离出骨骼肌卫星细胞，并进行体外培养。

我是采用胶原酶消化法，从肌肉组织中分离骨骼肌卫星细胞。我已经用小鼠试了一下，结果不好。应该是我的技术不过关，而且采取的小鼠骨骼肌样太少了。

作者: 小螺号 时间: 2012-9-10 13:26

各位楼上的同志，我最近也是培养SD大鼠卫星细胞，但是开始比较郁闷。

我使用的生长培养基是F10、20%的胎牛血清、1％鸡胚提取液、1％双抗；在换生长培养基之后发现细胞死的较多，有较多的细胞在帖壁后仍然死去。各位是否知道原因？

我开始配制F10时，调好了PH值在7.2左右，然后滤膜过滤除菌。第一次培养当我加进去以后，细胞全死了，我测培养基PH值，竟然达到了8左右。细胞肯定会死去。第二次培养，我加无菌盐酸将生长培养基的PH调到7.3左右，这次细胞没有像上次那样死的那么快，但是死的较多。

是不是F10的营养不如DMEM丰富，而使细胞较多的死亡？

很着急等待！

作者: one 时间: 2012-9-10 13:26

大家都用胶原铺板么？听说做原代都要用的啊

作者: one 时间: 2012-9-10 13:27

大家在取肌肉组织的时候，有什么心得体会？如果取的组织中不是很纯，那么杂细胞是不是很容易就疯长起来，而我们要得细胞就长不起来了？我同学是用解剖镜下操作的。
我做原代的时候总是容易出现污染，怎么办啊，大家有没有好的建议？

作者: 小螺号 时间: 2012-9-10 13:27

你解剖的时候小心一点，剪刀一定要注意消毒，象放入酒精中一会，然后用火烧，所以解剖的时候可以在旁边放一个酒精灯。另外大鼠你可以直接放入酒精中消毒2分钟左右，主要是防止鼠毛沾染，在解剖肌肉的时候也需要特别注意鼠毛的沾染。解剖下来的肌肉用无菌PBS充分冲洗。总之一切步骤你都要考虑，因为它们都会引起污染。我开始做的时候也是经常污染，现在基本可以避免。
祝你好运！

作者: zmf123456 时间: 2013-1-4 16:35

我也要猪培养骨骼肌卫星细胞，搜到这个地方，来学习一下，大家都还在做吧？

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