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标题: 【讨论帖】骨髓间质细胞培养互助 [打印本页]

作者: 铜雀 时间: 2012-9-12 12:03 标题: 【讨论帖】骨髓间质细胞培养互助

骨髓间质细胞越来越受到人们的重视，希望大家能互相帮助，共同进步

作者: eric930 时间: 2012-9-12 12:04

骨髓间质细胞和骨髓基质干细胞BMSC是一回事么?
如果是，我也算一个。多交流啊，大家！

作者: www.1 时间: 2012-9-12 12:05

我有个问题,骨髓间质细胞向成骨细胞诱导时,要加维生素C,但是Vc在培养液的PH值好象是很不稳定的,需要每天加入吗?

作者: 铜雀 时间: 2012-9-12 12:05

不论骨髓间质还是基质都是从其来源来定义的，对于它的真正定性到目前为止还没有确切的结论，它们只是对骨髓中除了造血干细胞外的未分化的细胞的一种统称

作者: yysr238 时间: 2012-9-12 12:06

有人知道Vc在培养液中稳定性的问题吗？

作者: S6044 时间: 2012-9-12 12:06

维生素C可通过增加I型胶原转录因子的半衰期而最终增加I型胶原mRNA的含量，促进I型胶原的表达. 是骨髓间质干细胞的诱导剂之一.

在具体操作过程中，我一般是配好相应的浓缩液。
在给细胞加培基的时候同时按比例加入。效果还是比较好的。

作者: TAT 时间: 2012-9-12 12:07

楼上，你的Vc浓缩液是配成多少浓度的？以怎样一个比例加入培养液中？

作者: 铜雀 时间: 2012-9-12 12:07

请问各位在培养bmsc时用的培养瓶是塑料的还是玻璃的，在哪种上效果比较好一些？还是没有差别？

作者: misswu61 时间: 2012-9-12 12:07

我用的是进口的corning塑料瓶，效果超好，一分价钱一分货，国产的玻璃瓶不好用，实在不行用下列办法改进后也能凑合，多养几次细胞后，瓶子别洗，瓶子的底部会附着很多细胞生长时分泌的生长因子，极大的促进细胞生长，美．．．．就一个字了，让你都来不及就张满了．

作者: ququer787 时间: 2012-9-12 12:08

请问各位在培养bmsc时用的培养瓶是塑料的还是玻璃的，在哪种上效果比较好一些？还是没有差别？

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塑料的或玻璃的培养瓶差别不是很大，无论原代还是传代。只不过塑料的在拍照时效果好一点，它的底很平嘛。

作者: u234 时间: 2012-9-12 12:08

我用的是进口的corning塑料瓶，效果超好，一分价钱一分货，国产的玻璃瓶不好用，实在不行用下列办法改进后也能凑合，多养几次细胞后，瓶子别洗，瓶子的底部会附着很多细胞生长时分泌的生长因子，极大的促进细胞生长，美．．．．就一个字了，让你都来不及就张满了

不洗瓶，不会污染吗？

作者: 铜雀 时间: 2012-9-12 12:09

请问各位在原代培养骨髓间质细胞时第一次换液在何时？

作者: kuaizige 时间: 2012-9-12 12:09

QUOTE:

原帖由铜雀于 2012-9-12 12:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问各位在原代培养骨髓间质细胞时第一次换液在何时？

24h，此时多数细胞已经贴壁

作者: bluelake 时间: 2012-9-12 12:10

请问各位在原代培养骨髓间质细胞时第一次换液在何时？

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有的24-48小时就换液，除去未贴壁、贴得不牢的杂细胞。我们师姐师兄都是第三天换的液。

作者: daod 时间: 2012-9-12 12:10

我也准备培养骨髓间质细胞，并且准备用两种细胞共培养的方法诱导破骨细胞生成。但是有人说共培养方法很难，有那一位前辈知道共培养技术的，请多多赐教！另外，我想请问一下，不同种属来源的细胞能否进行共培养，是否存在细胞表面抗原相互排异的问题。

作者: zsxan1990 时间: 2012-9-12 12:10

我也在养骨髓基质细胞，你们觉得这种细胞原代和传代培养时形态改变大吗？原代培养时一般成梭形，像成纤维细胞，但传代后，细胞伸展开，体形变得较大，生长速度也减慢，这是正常现象吗？

作者: moonlight45 时间: 2012-9-12 12:11

各位前辈，我也在养骨髓基质干细胞，希望多多指教。请问加入还要什么程序吗

作者: okhaha 时间: 2012-9-12 12:11

我用的是进口的corning塑料瓶，效果超好，一分价钱一分货，国产的玻璃瓶不好用，实在不行用下列办法改进后也能凑合，多养几次细胞后，瓶子别洗，瓶子的底部会附着很多细胞生长时分泌的生长因子，极大的促进细胞生长，美．．．．就一个字了，让你都来不及就张满了

不洗瓶，不会污染吗？

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指得是不再泡酸，用trypsin一涮，接着养同类细胞。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-12 12:12

有人会用骨髓间充质细胞诱导成血管内皮吗，兄弟求帮助，有的发我的信箱，zz123p2sohu.com。谢谢

作者: hyuu 时间: 2012-9-12 12:12

我取的是大鼠MSC, 原代在48－72小时首次换液，一般来讲，在这段时间能不挪动细胞就不挪动，其实也不必担心不换液会影响生长，因为此时细胞量很少，培养基的营养足以支撑72小时，甚至有人认为，原代里混有的红细胞有利于干细胞的增值。
当然，我曾经在群里看到有人发的帖，说一般大部分MSC在6－8小时就已经贴壁了，他认为在此时换液最好，因为混有的成纤维细胞还没贴，此时换液可以去掉大部分成纤维细胞，但我没试过，没敢冒那个险，因为我需要细胞增值5代才用，在传5代后，细胞量不但大大增多，而且可以达到95％以上的纯度。

作者: is2011 时间: 2012-9-12 12:13

请教哪位仁兄能够提供给小弟pittenger等1999年发表的关于培养间充质干细胞的文章？我在pubmed和ovid上都查不到原文，很急！！谢谢！

作者: 阿敏 时间: 2012-9-12 12:13

骨髓间质细胞、骨髓间充质干、细胞骨髓基质细胞这三种细胞到底怎么定义？

作者: c86v 时间: 2012-9-12 12:14

我也在养骨髓基质细胞，你们觉得这种细胞原代和传代培养时形态改变大吗？原代培养时一般成梭形，像成纤维细胞，但传代后，细胞伸展开，体形变得较大，生长速度也减慢，这是正常现象吗？

我猜你养的是大鼠的BMSC吧，我养的时候也遇到这个问题，可能与原代培养时BMSC较少，换液几次后没有达到汇合就传代有关，不过等养到第3代以后会好一些。另外与培养基也有关系：用胎牛血清和低糖DMEM效果要比小牛血清高糖的DMEM好。兔子和犬的细胞就很规整，基本一直是梭形的，漩涡状编织状排列。

作者: tie8 时间: 2012-9-12 12:14

骨髓间质细胞、骨髓间充质干、细胞骨髓基质细胞这三种细胞到底怎么定义？

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根據我所了解這三個名稱都是蔣同一種細胞.只是英文翻譯成中文上的差異.
有錯請訂正.....

作者: tie8 时间: 2012-9-12 12:15

我用的是进口的corning塑料瓶，效果超好，一分价钱一分货，国产的玻璃瓶不好用，实在不行用下列办法改进后也能凑合，多养几次细胞后，瓶子别洗，瓶子的底部会附着很多细胞生长时分泌的生长因子，极大的促进细胞生长，美．．．．就一个字了，让你都来不及就张满了．

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這不是錢的問題.是骨髓間質幹細胞對塑膠表面有貼附的特性.所以玻璃瓶的效果會比較差.......

作者: dotaaa 时间: 2012-9-12 12:15

我也在养骨髓基质细胞，你们觉得这种细胞原代和传代培养时形态改变大吗？原代培养时一般成梭形，像成纤维细胞，但传代后，细胞伸展开，体形变得较大，生长速度也减慢，这是正常现象吗？

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我认为传代培养后其成纤维形的特征更明显，有时候会成旋涡状
细胞体积变大，伸展开可能是因为传代的时候密度偏低造成的

作者: tie8 时间: 2012-9-12 12:16

请教有养过小鼠的MSC的前辈吗？我养第一次用的是全骨髓培养，看得介绍说要多贴几天，我就原代5天换液贴的倒是不少不过什么样的都有！细胞很杂，我看都快满了，就准备传代可是怎么也消化不下来！吹打后下来了些，可是贴壁的和MSC的形态差太远了我就扔了。我想可能是贴壁时间太长杂细胞太多的缘故。第二次，做的2瓶一个是24小时头次换液，一个是48小时头次换液，杂细胞少了很多形态也不错特别是24小时的，有好多梭形的成一条线一样生长得，可是今天一消化还是下不来啊！有没有遇见过这种情况的前辈啊！
注：胰酶没问题（同时消化过别的细胞），培养用低糖DEME10%FBS除青连霉素，谷氨酰胺，不加其它成分。

作者: 8s5g 时间: 2012-9-12 12:16

我想请教一个问题，传代时加入胰酶后，在镜下看到细胞开始收缩变圆就加入培养液终止，还是等到大部分的细胞都变圆了呢？昨天我在传代时是见多数细胞变圆脱落后加的，时间也就在三到五分吧。但是今天看到细胞中有空泡出现，是不是消化时间久了？
请各位前辈指教了,谢谢

作者: zzzz 时间: 2012-9-12 12:17

我想请教一个问题，传代时加入胰酶后，在镜下看到细胞开始收缩变圆就加入培养液终止，还是等到大部分的细胞都变圆了呢？昨天我在传代时是见多数细胞变圆脱落后加的，时间也就在三到五分吧。但是今天看到细胞中有空泡出现，是不是消化时间久了？
请各位前辈指教了,谢谢

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个人意见：估计不是，3-5分钟不长，原因可能是你把死细胞也消化下来了吧。看看空泡贴壁吗？不贴的话下次换液洗掉就没事了。

作者: 8s5g 时间: 2012-9-12 12:17

那些含空泡状的细胞贴壁，是第一次传代，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，发张照片，请各位帮忙分析一下，谢谢。

作者: xyw5 时间: 2012-9-12 12:17

我也准备培养骨髓间质细胞，并且准备用两种细胞共培养的方法诱导破骨细胞生成。但是有人说共培养方法很难，有那一位前辈知道共培养技术的，请多多赐教！另外，我想请问一下，不同种属来源的细胞能否进行共培养，是否存在细胞表面抗原相互排异的问题。

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当然不会，在体外没有免疫系统的参与，怎么会有排异？兄弟真是多虑

作者: xyw5 时间: 2012-9-12 12:18

请教有养过小鼠的MSC的前辈吗？我养第一次用的是全骨髓培养，看得介绍说要多贴几天，我就原代5天换液贴的倒是不少不过什么样的都有！细胞很杂，我看都快满了，就准备传代可是怎么也消化不下来！吹打后下来了些，可是贴壁的和MSC的形态差太远了我就扔了。我想可能是贴壁时间太长杂细胞太多的缘故。第二次，做的2瓶一个是24小时头次换液，一个是48小时头次换液，杂细胞少了很多形态也不错特别是24小时的，有好多梭形的成一条线一样生长得，可是今天一消化还是下不来啊！有没有遇见过这种情况的前辈啊！
注：胰酶没问题（同时消化过别的细胞），培养用低糖DEME10%FBS除青连霉素，谷氨酰胺，不加其它成分。

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MSC贴壁能力超强，不容易消化，建议：
1、消化前用无血清培养液或PBS冲洗两遍以去除血清；
2、0。25%胰酶37度作用5-10分钟，如还不行可适当增加胰酶浓度或重新配制新鲜胰酶（胰酶配好后时间长了消化能力会下降）。

作者: ROSE李 时间: 2012-9-12 12:19

请教，如果我要鉴定小鼠msc的表型，我买了cd14，cd34，cd31，MHCI，cd105，能说明问题吗？

作者: hyuu 时间: 2012-9-12 12:20

请问各位在原代培养骨髓间质细胞时第一次换液在何时？

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我做的是SD大鼠的msc,一般5天换半液，如果长的好可以换全液，原代不是很容易贴壁，前三天最好不动，而后观察再换液

作者: hyuu 时间: 2012-9-12 12:20

请教，如果我要鉴定小鼠msc的表型，我买了cd14，cd34，cd31，MHCI，cd105，能说明问题吗？

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我们实验室用的是cd44,cd45这俩个指标比较好

作者: hyuu 时间: 2012-9-12 12:20

我也在养骨髓基质细胞，你们觉得这种细胞原代和传代培养时形态改变大吗？原代培养时一般成梭形，像成纤维细胞，但传代后，细胞伸展开，体形变得较大，生长速度也减慢，这是正常现象吗？

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这种有可能是营养太少了。应该用10%的胎牛血清

作者: mamamiya 时间: 2012-9-12 12:21

我做的是小鼠的MSC，把骨髓冲洗出来后直接用全血培养。试过贴壁3天和5天后第一次换液。换液后发现那些梭形贴壁细胞居然大部分都变圆了，这是怎么回事？然后放个两三天后又有梭形细胞长出来，而且是形成克隆样的大小不等的团块。有的团块细胞密度很大，我就用胰酶消化想将其吹散，没想到第二天我的细胞又变圆了，只剩极少数还是梭形。这几天我都没敢去碰它，而且酶消化绝对没有过，当时只有大约30％的细胞被我吹打下来。这些细胞怎么一碰它就变圆？狂郁闷中！请求各位大侠相助！

作者: owanaka 时间: 2012-9-12 12:21

我做的是小鼠的MSC，把骨髓冲洗出来后直接用全血培养。试过贴壁3天和5天后第一次换液。换液后发现那些梭形贴壁细胞居然大部分都变圆了，这是怎么回事？然后放个两三天后又有梭形细胞长出来，而且是形成克隆样的大小不等的团块。有的团块细胞密度很大，我就用胰酶消化想将其吹散，没想到第二天我的细胞又变圆了，只剩极少数还是梭形。这几天我都没敢去碰它，而且酶消化绝对没有过，当时只有大约30％的细胞被我吹打下来。这些细胞怎么一碰它就变圆？狂郁闷中！请求各位大侠相助！

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1、看看你的培养液配制有没有问题。
2、试试24小时后换液，可以去除很多杂细胞。
3、MSC很易贴壁，这时须注意胰酶活性，有没有在4度冰箱放置过久，或反复冻融影响活性，注意用胰酶前用PBS冲洗细胞两遍，胰酶消化停止时掌握好时机，不要过早，一般3-5分钟，看到细胞变圆及要脱落再加培养液终止。若胰酶消化不好，再吹打效果都不佳。
4、我没懂你说的全血培养。

作者: any333 时间: 2012-9-12 12:22

我也在养骨髓基质细胞，你们觉得这种细胞原代和传代培养时形态改变大吗？原代培养时一般成梭形，像成纤维细胞，但传代后，细胞伸展开，体形变得较大，生长速度也减慢，这是正常现象吗？

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可能传代后细胞密度降低

作者: pengke1983 时间: 2012-9-12 12:22

我现在又做了几瓶，准备再试试。
另外，我说的全血培养是指骨髓从鼠股骨中冲洗出来后没有加淋巴细胞分离液离心，直接将所有冲洗出的细胞加血清培养。

作者: 铜雀 时间: 2012-9-12 12:23

我做过狗、兔、大鼠的骨髓间质细胞培养，体会各种动物的骨髓间质细胞培养的活性不一样，且和动物年龄有关，因此胰酶的消化时间也应与之相适应，sd大鼠骨髓间质细胞传代时胰酶消化时间应短些，三分钟足够，且不要加EDTA，如果消化后的细胞成团或量少，可离心后再分瓶，效果可能更好。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-12 12:23

我来加一下，文献上换液是在3天，我自己的经验是24H后，

作者: TNT 时间: 2012-9-12 12:23

stromal的英文释义是“间充质”，叫基质干细胞的都是中国人发的中文文章，非常不严谨。请看老外的英文文章有谁称“骨髓基质干细胞”的，你不可能找到。中文文章很多写的是marrow matrix stem cells（MSCs），其实我觉得国际上通用的MSCs指的是marrow stromal cells（MSCs），老外连中间的stem都省去了，只注明间充质细胞的来源。中国人喜欢搞什么多向分化，其实分来分去都是同一胚层细胞的分化，那这个“干”细胞的“stem”应该称不上，充其量是某某前体细胞或者什么祖细胞而已。

作者: TNT 时间: 2012-9-12 12:24

M SC 体外培养的研究已进行30 余年, 取得了很大的进展, 但由于其本身的研究还不系统全面, 仍处于探索阶段, 有些问题亟待解决。(1)M SC 培养过程中的异质性, 影响了干细胞分离纯化的效果。如何有效地获得大量同质性的M SC, 有待于对其细胞学特点和异质细胞群中各类细胞标志物的进一步研究。( 2) 对M SC 在细胞工程和组织工程方面的利用研究, 都希望得到大量的未分化干细胞成分。理论上讲, 在体外设法诱导或用外源基因导入等技术, 可使干细胞实行对称性有丝分裂, 无限扩增而不分化,但其结果是细胞形态和生理可能发生改变[ 14 ]。条件生化基因的引入或许会克服这一困难。1998 年,H icok[ 23 ]将SV 40 的变异型温敏基因t sA 58导入M SC, 形成了细胞的条件永生化, 即在34℃环境下, 细胞能持续增殖, 分化受到抑制; 在39. 5℃环境下, 细胞增殖减慢, 出现分化, 且在不同的诱导条件下, 或表达成骨标记, 或表达成脂标记。但是, 长期培养发现这些细胞并不能保留其分化能力, 可能是细胞生化的逆转受到了抑制。如何避免扩增的干细胞朝多方向分化, 仍有待于研究。( 3) 基因转染的M SC 的培养为我们获取纯的干细胞提供了新的空间, 但转染的外源基因是否会影响M SC 的分化潜能, 纯化后的M SC 长期传代能力如何, 目前尚存争议。Kitano [ 12 ]在实验中发现原代培养的细胞分化潜能下降、传代培养所形成的克隆数减少。而O reffo [ 15 ]在体外长期培养(> 9 月) 基因转染的M SC, 发现其仍具有良好的分化潜能, 注入鼠皮下后, 可在骨组织中检测到含有标记基因的M SC, 并最终分化为成骨细胞。另外, 如何提高基因转染效率也是一个长期困绕人们的问题。尽管如此, 由于M SC 具有公认的多向分化性,被认为是一种理想的细胞治疗和基因治疗的靶细胞, 相信随着研究的进一步深入, 一定会为其临床应用带来新的前景。

作者: TNT 时间: 2012-9-12 12:24

骨髓组织除含有造血干细胞以外, 还含有骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC)。早期分离培养时, 发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit fibroblastic, CFU-F ) ”或“骨髓基质成纤维细胞(marrow strom alfibroblasts,M SF) ”。随着研究的深入, 人们发现其对骨髓血系细胞起支持诱导作用,又因其来自于骨髓基质, 因而称其为“骨髓基质细胞(bonem arrow st rom al cells,BM SCs) ”。近来因其在不同的诱导条件下, 具有向中胚层组织细胞分化的能力, 如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等分化的能力, 又称其为“间充质干细胞”、“间充质祖细胞(mesenchymal p rogenitor cells) ”或“骨源性干细胞(osteogenic stem cells) ”

作者: TNT 时间: 2012-9-12 12:24

MSCs的表型不均一，分别具有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点。目前，MSCs鉴定的方法都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为MSCs，尚无直接方法可鉴定得到MSCs，它对SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124等都呈阳性反应，而CD1a、CD31、CD34、CD14、CD45、CD56、ESA则为阴性[1,12]。由于在骨髓贴壁细胞中最常见的为成纤维细胞及造血细胞，因此实验中一般选择这些细胞具有代表性的抗原进行检测。

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