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标题: 【讨论帖】人类各部位肿瘤细胞培养 [打印本页]

作者: ffooll 时间: 2012-9-15 13:14 标题: 【讨论帖】人类各部位肿瘤细胞培养

拜托各位大虾，因我要开展肿瘤药物敏感检测，

请指教人体手术下来的肿瘤组织，各种部位肿瘤细胞培养的方法有何不同？

谢谢！最好有一些步骤指导特定部位肿瘤细胞的培养。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:14

假如没有必要非得自己建立肿瘤细胞系的话，可以考虑国际共用的细胞系，这样实验结果也比较容易公认一些。
不同肿瘤细胞原代培养的方法是不同的，贴壁的或者悬浮的，请说清楚点要求。

作者: ffooll 时间: 2012-9-15 13:15

谢谢关注，
我目的是用医院的新鲜肿瘤标本去做药物敏感检测，投入临床应用。
这些新鲜标本包括脑胶质瘤、甲状腺癌、乳线癌、肺癌、胃癌、肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌等等一系列人体恶性肿瘤。
我知道这些不同类型肿瘤原代培养方法肯定有不同，就是不明确哪些肿瘤该用什么办法培养。
期待有所答案。

再次感谢！

作者: www.1 时间: 2012-9-15 13:15

我记得以前看过关于心肌细胞培养的文献，早期的心肌细胞体外培养方法多是采用体外灌流（含消化液）取出活的心肌细胞，然后体外培养，用于实验。
我觉得你的实验可以借鉴以上的方法。
先取得肿瘤标本，然后采用消化（或者匀浆等）的办法，获得活的肿瘤单细胞，然后进行体外培养。培养以后可以用于实验的。
至于去除培养中污染的细胞，不同的肿瘤组织，污染的细胞也不同，可能大多是成纤维细胞。你可以采用差速贴壁纯化的方法，去除成纤维细胞等等，获得纯度较高的肿瘤细胞。
另外关于药敏检测指标，可以先用MTT，有了眉目以后，再作流氏、Westhern等。
以上方法仅供参考

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:16

谢谢关注，
我目的是用医院的新鲜肿瘤标本去做药物敏感检测，投入临床应用。
这些新鲜标本包括脑胶质瘤、甲状腺癌、乳线癌、肺癌、胃癌、肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌等等一系列人体恶性肿瘤。
我知道这些不同类型肿瘤原代培养方法肯定有不同，就是不明确哪些肿瘤该用什么办法培养。
期待有所答案。

再次感谢！

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别客气，互相学习。尤其，在肿瘤领域，我还是个新手。
想知道，你这么的做法是否有文献报道。
细胞培养出来肯定是没有问题，只是想知道这样的做法是否可行？我和victoh 主任讨论了一下。如果可以的话，请提供一下相关文献，把文章题目(最好有外文的)列出给我就好。

作者: u234 时间: 2012-9-15 13:16

网络搜索“ATP-TCA”，就可获得所有的文献，作为肿瘤体外药敏检测，国内外不少已经用于临床多年。但其关键还是在于肿瘤细胞的培养。

文献中对于肿瘤细胞的培养，仅局限于某一种或几种肿瘤，也不见详尽。比如肝癌、乳腺癌，胃肠道癌等有所报道，至于皮肤鳞癌、甲状腺癌、肺癌、脑肿瘤等未见中文字样的具体过程。

不知道斑竹及众位高手是否可以不吝赐教？

谢谢。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:17

深叹学海无涯，希望以后多参与到本版的讨论中来。

青衫建议的方案是：
　　肿瘤单细胞悬液制备：先将新鲜瘤组织剪碎成大小1mm3的碎块，然后加入胶原酶(I型或者II型)消化2-3小时，如果用胰酶，需要考虑中间分次消化，以防消化过度。0.1%胶原酶消化也可以分次消化(30min一次)，这样细胞的活力会好些。
如果用胰酶的话，分次消化，用0.1%左右的胰酶，10-15min消化一次，消化一次，取消化下来的悬浮细胞，用含血清的培养液中和胰酶，离心并用培养液重悬细胞，放置于4度保存，待消化完全后，将消化后的细胞悬液通过160-200目的筛网，即得单细胞悬液。然后，接种到培养瓶中，贴壁1.5h后，除去贴壁细胞(主要是成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞之类的)，就可以得到比较纯的肿瘤细胞，台盼蓝染色计数，然后进行后面的实验。
后面的实验，可以根据你的需要来进行了。

作者: hyuu 时间: 2012-9-15 13:17

我们也学了一招。

另外还请高手们继续解答楼主的问题，尤其是各种肿瘤细胞的原代分离、纯化，并请将方案加到下面的原代细胞培养帖子里:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1942997&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:18

谢谢斑竹给我的这些信息，其中有我知晓和一些暂不清晰的概念。

但我最想知道的是：细胞培养过程大致相同（分贴壁、悬浮两类），但各种类型肿瘤细胞都有其特性，比如乳腺癌、肠癌、甲状腺癌、脑胶质瘤等是否都属于贴壁型的培养方式呢？假如各种恶性实体肿瘤都属于贴壁型的，那是否在培养中有何不同、特定位置的肿瘤在培养中是否有一些具体不同点?

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:18

谢谢斑竹给我的这些信息，其中有我知晓和一些暂不清晰的概念。

但我最想知道的是：细胞培养过程大致相同（分贴壁、悬浮两类），但各种类型肿瘤细胞都有其特性，比如乳腺癌、肠癌、甲状腺癌、脑胶质瘤等是否
都属于贴壁型的培养方式呢？

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你列举的那些细胞株均为贴壁的，一般实体瘤的肿瘤细胞都是可以贴壁的，而且贴壁时间都长于成纤维细胞和内皮细胞(因此可以差速贴壁纯化)，可能血管瘤的细胞除外(具体不太清楚，因为它是内皮来源的)，而腹水瘤和白血病肿瘤细胞往往都是悬浮的。
一般来说，选用肿瘤细胞大众型适合的RPMI1640＋10%小牛血清(或新生牛血清，建议用进口的Hyclone或Gibco)＋双抗就普遍适合了。
选取肿瘤的时候，坏死的和中间的部分最好不要，这个我想你也应该知道的。另外，细胞在消化的时候，同一批次的实验最好采用同一份肿瘤，消化下来的细胞随机混合均匀后，再分成各个组，所以不存在位置不同或者取材不同的个体差异了。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:19

乳腺癌、肠癌、脑胶质瘤我都养过这些细胞株，均可用RPMI1640养的，

甲状腺癌没有养过，我查一下看看。

经考证，我所查到的甲状腺癌细胞株都是贴壁生长的，文献上是用的DMEM培养的。

以上这些细胞株，也可以用DMEM高糖培养基培养的。

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:19

那好，我就现按照所有实体肿瘤(血液系统肿瘤除外）均用贴壁处理，有问题我再来请教，我还会来看看是否有其他战友是否提供宝贵心得、经验。

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:20

目前我按照仪器公司推荐、一些文献所提及的CAM培养基，但价格很贵，我会在实际运用一段时间以后比较不同培养基的质效。
乳腺癌细胞，公司未提，看到北京一家医院开发出什么培养基，专用的，说是效果很好，不知价格如何，以后我会尝试一下。

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:20

忘记还有骨肿瘤（骨肉瘤），不知道属于哪个类型的，用哪种培养基了。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:20

目前我按照仪器公司推荐、一些文献所提及的CAM培养基，但价格很贵，我会在实际运用一段时间以后比较不同培养基的质效。
乳腺癌细胞，公司未提，看到北京一家医院开发出什么培养基，专用的，说是效果很好，不知价格如何，以后我会尝试一下。

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骨肉瘤细胞株一般都是贴壁的。也是用RPMI1640培养的。

那些公司和文献推荐的都是别人的细胞株的适用培养基，一般(是一般，并非全部)来说是最佳培养基配方；但是，你做的毕竟是新鲜肿瘤组织的原代培养，不一样的。你的细胞养得好不好，一方面取决于你的培养液、培养操作手法，另外很大一方面取决于你取材的肿瘤细胞的恶性度、体内生长状态。我认为你没有必要采用那么多各种各样的培养液，只要用RMPI1640或DMEM高糖就可以了。我个人推荐用RPMI1640，一家之言。

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:21

谢谢！我会记住您给我的绝对宝贵信息，有您这番话，我心中终于有底啦。

随着实验的开展，以后还要麻烦斑竹，谢谢！

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:21

我会在实际工作中，将所做心得及时交楼与本版块。

建议斑竹将精华链接中特设“人类各部位肿瘤细胞培养”专项，以便同一战壕战友能方便交楼。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-15 13:22

我会在实际工作中，将所做心得及时交楼与本版块。

建议斑竹将精华链接中特设“人类各部位肿瘤细胞培养”专项，以便同一战壕战友能方便交楼。

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好的，谢谢！已经链接。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/2293780')

作者: rxcc33 时间: 2012-9-15 13:23

我单位为ATP-TCA技术研究的权威单位,研究该技术已经5年了,光培养基的优化和筛选就花了1年半的时间,共计完成各部位肿瘤组织培养500多例.临床实用的技术不是搞研究那么简单的,包括各种条件的优化.就上文提及的培养条件而言,成功率恐怕连30%都不到.

作者: rxcc33 时间: 2012-9-15 13:23

我本人就是医科院肿瘤医院的,ATP-TCA技术就是我的研究生课题,后来又进行了两年的临床应用和相关探讨,共发表文章8篇.在建立该技术其间,经历的困难重重,主要是如何提高培养的成功率的问题.如果各研究单位或医院有兴趣可以和我联系,eastwoodfu@yahoo.com.cn或020-89289416.

作者: rxcc33 时间: 2012-9-15 13:23

老兄,引用我的综述怎么把我的姓名给漏了?记得补充一下.照你的建议,用双抗养消化道细胞八成不会有结果,就看长细菌和霉菌的好戏吧.

作者: rxcc33 时间: 2012-9-15 13:24

大连医学院的文章简直就是胡编乱造,乳腺癌是出了名的纤维化,脂肪多,区区0.05%的胶原酶30分钟就行?真是夸张.小牛血清就能培养?呵呵,80%的标本可以拿到100万细胞?我看是红细胞和白细胞还差不多.

作者: avi317 时间: 2012-9-15 13:24

唉，我也为了做流式在考虑怎么消化细胞。我的标本是种在裸鼠背上的卵巢癌，医院只有明天和后天下午做流式，不知道明天是否来得及切下来并且消化并且染色……

作者: yes4 时间: 2012-9-15 13:25

谁能高诉我胰岛细胞到底贴不贴壁，请指导一下养胰岛细胞的方法吧！我就要完蛋了。

作者: 3648755 时间: 2012-9-15 13:25

我需要子宫内膜癌的雌激素敏感型的细胞系，请问谁能帮我找到啊？？多谢啦。
另外我还想知道该系肿瘤细胞的培养方法。能有书面指导最好。因为下阶段我还要做转染，现在我连细胞系还没有呢。

作者: XYZQ 时间: 2012-9-15 13:25

用双抗养消化道细胞八成不会有结果,就看长细菌和霉菌的好戏吧.

请教各位大侠，那该怎么正确操作呢？

作者: ququer787 时间: 2012-9-15 13:26

求助!!
大家好,我是一名细胞培养的新手,在前一个月内我养过肾癌7860细胞,白血病K562细胞,我现在急需要开始我的课题的前列腺癌LNCAP细胞株,上海细胞库暂时也没有,有哪位兄弟能提供细胞或该细胞株的来源,我愿意购买!!并希望兄弟能知道我该细胞的培养方法及注意事项.我看过一些国内外的文献,报道不太一致.
谢谢各位多多关照!

作者: bananapeople 时间: 2012-9-15 13:26

有没有哪位养过原代胰岛B细胞瘤组织中的B细胞啊？非常希望有人指点！急！

作者: wood533 时间: 2012-9-15 13:27

我从《肿瘤》2000年某期看到过一篇文章，对比了MTT和ATP法，竟然有些MTT法测出是抑制的，ATP法显示的是刺激（负的抑制率）。这是为什么？作者说是细胞长得快，M0组的营养都被消耗了，所以M0低了。在二法结果矛盾时那个结果对呢？
最近我有个朋友正化疗。他挺信体外药敏的预测的（从网上看到的），但大夫不信。各位认为体外药敏能预测疗效吗？

作者: rxcc33 时间: 2012-9-15 13:27

很多文章发表的都是垃圾，明眼人一看就知道其中错误颇多，实际上的药物敏感性测试技术是一个复杂的技术，其中技术因素很多，很多地方实际上是自己没看懂文章，乱做一通，然后发表一些莫名其妙的结果，还把其它正规的研究给搞乱了。我们医院的医师原来也是半信半疑的态度，后来免费做得多了，结果上面也比较和临床疗效吻合，后来他们得积极性就高了，内科已经有很多二线化疗无效的患者取淋巴结和胸腹水检测后用药，取得较好疗效。因此，即使同一种技术，也有做的好的和做得不好的，主要看技术水平和经验。

作者: TAT 时间: 2012-9-15 13:27

请教ETFR cell怎么养呀?

作者: is2011 时间: 2012-9-15 13:33

肺癌细胞株用RPMI1640养，贴壁生长

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-15 13:33

我在上海中科院细胞库买了小鼠肥大细胞株P815，回来后换自己配置的培养基和血清（1640＋10℅的新生小牛血清＋双抗），两天后细胞的状态很差，很多聚集成团，并且有细胞碎片，在高倍镜下可见很小的游动的悬浮物，体积小于细白碎片。那位大侠赐教，是否是污染了，还是我得培养基有问题？培养基做过无菌试验，未污染。盼回音

作者: rxcc33 时间: 2012-9-15 13:34

细胞碎片？细胞内分泌物，不太象，血清沉淀，有可能。还有就是其它污染物，常规无菌培养培养基不能培养成功的，如黑胶虫。

作者: baidukk 时间: 2012-9-15 13:34

如果真是黑胶虫污染,我该怎么办?大虾,谢谢

作者: KGZ564 时间: 2012-9-15 13:34

求助 ! 江湖救济!我是培养细胞的新手.请各位高人知点一下.我复苏的肿瘤细胞总是状态不好是不是和手法有关应该怎样操作呢?我自己前天才冻的复苏后尽然不贴璧.郁闷啊!请大家帮帮忙,告诉我正确的方法好吗 ?还有就是由于不小心将细胞姨酶消过了,状态奇差有什么补救办法吗?帮帮小妹我吧!
十分感激!

作者: KGZ564 时间: 2012-9-15 13:35

我养的是下口腔腺癌细胞

作者: lagua123 时间: 2012-9-15 13:35

，想问问你的流式做的结果如何？我是一个即将要做卵巢癌原代细胞培养的菜鸟，听说原代很难培养，你有没有什么心得体会，望不吝赐教。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-15 13:36 标题: 回复 #38 lagua123 的帖子

你可以适当提高血清浓度或血清品质，如果原来用的是8%的，可以提高到10-12%，如果原来是用小牛血清，可以换用胎牛血清来抢救细胞，一次重新培养如果达不到要求，可以多传几次
给你提供一些冻存和复苏的信息:

细胞的冻存与复苏

为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(－70℃~－196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

一、细胞的冻存为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。

有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：
◆包含10％甘油的完全培养基，
◆包含10％二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，
◆50％细胞条件培养基和50％含有10％甘油的新鲜培养基，或
◆50％细胞条件培养基和50％含有10％二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：
◆50％细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或
◆包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-15 13:36 标题: 回复 #38 lagua123 的帖子

1.悬浮细胞
●计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
●以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×107在无血清培养基中，再次悬浮细胞。
●分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

2.贴壁细胞
●使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。
●在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。
●以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
●以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。
●分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
●细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。

二、冻存细胞的复苏冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。

1.直接铺板方法
●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。
●培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。
2.离心方法
●取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
●以大约80x g离心2到3分钟。
●弃去上清。
●在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
●细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-15 13:37 标题: 回复 #38 lagua123 的帖子

另外我查到的关于胰酶的资料，希望对你有帮助
胰酶作用及溶解的最佳PH是8-9，配制时应将液体调至PH8左右，充分溶解，过滤除菌。过滤后再调至PH7.5，也可不调。有条件的话可以买配制好的胰酶。胰酶会被血清中的蛋白等物质，以及Ca,Mg离子灭活，常温下降解很快，因此注意使用环境和，保存条件。
注意事项：
在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。
胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1.贴壁细胞的消化：
吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。
加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。不同的细胞消化时间有所不同。
显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。
如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
2.组织的消化：
不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-15 13:37

我在上海中科院细胞库买了小鼠肥大细胞株P815，回来后换自己配置的培养基和血清（1640＋10℅的新生小牛血清＋双抗），两天后细胞的状态很差，很多聚集成团，并且有细胞碎片，在高倍镜下可见很小的游动的悬浮物，体积小于细白碎片。那位大侠赐教，是否是污染了，还是我得培养基有问题？培养基做过无菌试验，未污染。盼回音

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首先，你用的是新生小牛血清，胎牛血清要比小牛血清的营养成分丰富，建议用胎牛血清。其次，血清的品质对细胞非常重要，建议用进口血清，本人的经验是国产血清容易出现你说的”很小的游动的悬浮物”，本人同时用国产血清和进口血清培养不同的细胞株，进口血清没有出现过”很小的游动的悬浮物”，国产血清在细胞状态不好时就出现。再有就是细胞在换培养基时要有一个适应阶段，尤其是你同时换了1640和血清，所以它更不容易适应。细胞复苏时建议用与冻存相同的血清和培养基，否则细胞很难适应。

作者: eric930 时间: 2012-9-15 13:37

同意楼上的意见，以前我使用国产的血清也出现过”很小的游动的悬浮物”，最后细胞全部死亡。我们实验室老师分析是两种可能：一是血清没有灭活所引起的支援体污染，一是黑胶虫污染。不管是何种污染，最后换了Gibcol的血清，这种情况就再没有出现过。

作者: skytree 时间: 2012-9-15 13:38

大家好，我急需ＬＡ－７９５肺腺癌细胞株，体外细胞培养用的，有谁知道那里有呀，联系方式是什么？另外我还想知道培养方法，能提供我吗？
十分感谢。
　　　　　　　　　　　　急急急！！

作者: kulee 时间: 2012-9-15 13:38

请告知人肝癌细胞的培养方法，谢谢！

作者: nn255 时间: 2012-9-15 13:38

有人养过ＭＭＣＨ－９７（人高潜能转移肝癌细胞株）吗？
谢谢

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