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标题: 【求助】瞬时转染293T，LIPOFECTAMIN2000效率... [打印本页]

作者: vcve 时间: 2012-9-15 14:00 标题: 【求助】瞬时转染293T，LIPOFECTAMIN2000效率...

我想瞬时转染293T细胞，做WESTERN，不知道lipofectamine2000效率高，还是Ca（PO4）3转的高？
有哪位大侠有经验？谢谢

作者: misswu61 时间: 2012-9-15 14:00

在细胞系中，293细胞是很好转染的一种，我们用lipofectamine2000转过，效率很高，而且条件很容易掌握；而用磷酸钙的话，转染效率虽然也很好，但是条件很难掌握的，特别是PH值，是直接影响DNA-磷酸钙复合物形成的因素。所以建议你如果有现成的lipofectamine2000，就用它了。

作者: vcve 时间: 2012-9-15 14:01

还想问一下，你用LIPOFECTAMINE2000转293T细胞，用几孔板转的，DNA和LIPOFECTAMINE是什么比例？谢谢。

作者: HP007 时间: 2012-9-15 14:01

我也用过LIPOFECTAMIN2000转染293细胞，效果很好，我转染的六孔板，每个孔1ugDNA，DNA和LIPOFECTAMIN2000比例是1ugDNA:2ulLIPOFECTAMIN2000，希望你能成功

作者: xingyi08 时间: 2012-9-15 14:01

我想问问，按照LIPOFECTAMIN2000说明书上，六孔板应该加入10ul，怎么加了2ul就行呢？不太明白，能解释么？谢谢！

作者: zsxan1990 时间: 2012-9-15 14:01

我转的每个孔1ugDNA，你也可以转的量大一点，比例就是1ugDNA:2ulLIPOFECTAMIN2000，可以做一个梯度，比如0.5ug,1ug,2ug,3ugDNA等，我做的结果是转的量太大了对细胞毒性大，所以选择了转1ugDNA

作者: vcve 时间: 2012-9-15 14:02

然后你做WESTERN了吗？成功了吗？我想做这个瞬时转染就是想做WESTERN，可总担心6孔里转的细胞不够做的，6孔里的细胞转完后，你是直接加LOADING BUFFER把293细胞吹下来的吗？加多少ul合适？全部上样吗？谢谢
问题好象就是没完没了了。呵呵。

作者: owanaka 时间: 2012-9-15 14:02

６孔板一个孔的细胞用来做Ｗestern足够了，你可以先把细胞裂解液约１００ul加入细胞表面，室温作用１５分钟，吹打后转入离心管，注意不要吹起气泡．离心后取上清，进行定量，然后加入上样缓冲液沸水中煮５分钟后转入冰浴，即可上样电泳．

作者: S6044 时间: 2012-9-15 14:02

对于2楼的说法，本人持保留意见。我曾经用LIPO2000转染293t，效率也很高的，但是他的细胞毒性却是不可避免的。而磷酸钙转染对于293t细胞来说，简直如同催化剂一样，转染效率奇高，我按照2、3版分子克隆上的方法都是如此，而且他又一个任何方法都不能比拟的优点，就是很便宜，除了有点浪费质粒。附上我做的磷酸钙转染图片，绿色的为转染后表达的pegfp,仅供参考。

图片附件: 53357239.jpg (2012-9-15 14:03, 40.04 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13851

作者: youyou99 时间: 2012-9-15 14:04

用用LIPOFECTAMINE2000转染时，DNA和LIPOFECTAMINE的比例就按照其protocol上面的比例先做，通常都是很好的，如果觉得转染效率不高的话，可以改变细胞接种密度，DNA和LIPOFECTAMINE的比例等条件，Good Luck！

作者: vcve 时间: 2012-9-15 14:04

请问,你DNA和cacl2的比例是多少?用磷酸钙转染几孔的?用了多少ug质粒?谢谢.图片好漂亮!

作者: summerxx 时间: 2012-9-15 14:05

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2012-9-15 14:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问,你DNA和cacl2的比例是多少?用磷酸钙转染几孔的?用了多少ug质粒?谢谢.图片好漂亮!

谢谢，我是完全按照分子克隆的protocol做的。我为了节省质粒，就用的60mm的平皿，因为蛋白表达量非常之高，而且细胞疯长，所以也就够用的。比例是10ug dna和31ul 2M CaCl2。要是做蛋白检测，作6孔板也是足够的。

作者: vcve 时间: 2012-9-15 14:05

钙转的时候,我配的HBS没有调PH,有影响吗?

作者: xingyi08 时间: 2012-9-15 14:05

我也准备做293T的瞬时转染,想先请教各位高手一个问题:你们用的质粒如果是自己提取的话,还需要纯化和精确定量吗?用的什么方法?谢谢!

作者: qhyu 时间: 2012-9-15 14:06

照片很漂亮，如果能把试验的具体详细信息告知就更好了！
我目前也在做磷酸钙转染，效率就很低，几乎观察不到！
希望加强交流，您的质粒在每孔中加多少？以六孔板为例.
谢谢！！

作者: cxw0000 时间: 2023-2-23 14:26

请问楼主转染的时候293T的密度是多少?有没有图片呀，最近在用lipo3000转染293T，但是一直把握不好细胞密度，转染效率很低

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