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标题: 【求助】HUVEC原代培养5次了都不贴壁呀？ [打印本页]

作者: any333 时间: 2012-9-15 15:11 标题: 【求助】HUVEC原代培养5次了都不贴壁呀？

各位战友：我分离HUVEC5次了，每次都是24小时后细胞团都不贴壁，就算有很少的贴壁，也不增值，后就全部裂解。我用胶原酶消化25min，用的不是进口血清，是Hyclone合资兰州民海的类标准胎牛血清，没加任何生长因子，用的是含20%FCS的M199，。我猜想是不是血清和没加生长因子的原因，但是有很多文献上也是这样的，我想问一下，有没有人和我一样条件下培养出来呀？急呀

作者: zhenxin 时间: 2012-9-15 15:12

我在做HUVEC培养，和你的条件不一样，不知你用的胶原酶多大，但消化时间25分钟，时间太长了，消化过度，细胞也不能贴壁的！我用的0.2%胶原酶，一般8-10分钟。另外我觉得还是需要加入生长因子，否则贴壁不好，细胞也不能很好的增殖！

作者: qqq111 时间: 2012-9-15 15:13

0.1%的胶原酶，我以前也消化10min ，但是也不贴壁

作者: daod 时间: 2012-9-15 15:15

应该在培养瓶/皿上先用明胶或其他基质处理后，再接种细胞。一般都能贴壁。传代细胞也一样。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-15 15:15

细胞不贴壁我认为原因主要有：脐带本身不新鲜；消化时间过长；培养液的PH值是否处于最佳状态？；培养瓶是否合适？我做HUVEC已经五年了，由于经费所限，我都用0.25%的胰酶消化10min，共消化两次，用RPMI1640，杭州四季清的小牛血清，细胞贴壁也很好。建议你将培养液重新配置，加血清后PH在7.0左右即可。用COSTAR的塑料瓶子，应该没有什么问题的。胶原酶对细胞的伤害极小，不必考虑它的因素。HUVEC很娇贵，建议你把细胞浓度调得大一点，细胞容易成活。一般4小时细胞可以完全贴壁。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-15 15:16

再补充一点，不加生长因子也可以！！

作者: any333 时间: 2012-9-15 15:17

谢谢各位战友，用胰酶消化两次能讲详细点吗，还有加血清后7.0的PH值如何测呀？用PH计测不就污染了吗，用试纸不准呀？要是过滤前测，滤后也不准呀？无用的书生战友能讲详细点吗？拜托了

作者: orangecake 时间: 2012-9-15 15:18

我是用0.25%的胰酶消化15min，细胞四小时内可贴壁。我认为“无用的书生 ”战友说的很有道理，脐带本身可能有问题，脐带取下后最好6小时内做完。还有如果混杂的红细胞多贴壁效果差。加血清后PH值测定可以吸出少量用PH计测不就OK。

作者: lagua123 时间: 2012-9-15 15:18

楼上的女生说得测PH值的方法可取。我的方法是：脐带灌洗后，迅速注入在培养箱中预热0.5~1h的胰酶，密闭放入培养箱约15min,取出后，轻揉脐带数次，注入含血清的培养液中止消化，收集消化液。然后将胰酶注入，弃去不要，以中和血清。再重新将胰酶注入，迅速注入胰酶，密闭放入培养箱约15min。依照第一次的方法收集消化液。将两次消化液混合，离心，调整细胞密度接种即可。混杂的红细胞多不必担心，在倒置显微镜下观察细胞贴壁后，换液弃去就可以了。
个人的一点小经验！呵呵。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-9-15 15:21

可选用M-200-500和S-003-10培养基培养HUVEC细胞试试看。

作者: any333 时间: 2012-9-15 15:23

细胞不贴壁我认为原因主要有：脐带本身不新鲜；消化时间过长；培养液的PH值是否处于最佳状态？；培养瓶是否合适？我做HUVEC已经五年了，由于经费所限，我都用0.25%的胰酶消化10min，共消化两次，用RPMI1640，杭州四季清的小牛血清，细胞贴壁也很好。建议你将培养液重新配置，加血清后PH在7.0左右即可。用COSTAR的塑料瓶子，应该没有什么问题的。胶原酶对细胞的伤害极小，不必考虑它的因素。HUVEC很娇贵，建议你把细胞浓度调得大一点，细胞容易成活。一般4小时细胞可以完全贴壁。

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感谢你的帮助，你用杭州四季青的小牛血清培养，在不加生长因子情况下细胞贴壁如何呢？我又作了次对照实验，问题出在血清上，所以我打算换换血清

作者: baidukk 时间: 2012-9-15 15:24

不加细胞因子也可以的，我用杭州四季青的小牛培养，细胞贴壁很好！！不行的活用GIBICO的小牛血清，也不错。血清也是一个重要因素！

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