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标题: 【讨论.精华帖.】细胞培养专区 [打印本页]

作者: xingyi08 时间: 2012-9-16 10:25 标题: 【讨论.精华帖.】细胞培养专区

293细胞很难养，谁能说说经验吗？还有C2C12细胞？

作者: tuuu2 时间: 2012-9-16 10:26

293细胞的培养：
我当时使用最好的条件，如GIBCO的胎牛血清和Corning的培养瓶（至少某些国产的玻璃瓶不行），而且要使用DMEM培养基。还有细胞的代次很重要，代次太高（如50代以上）则容易脱落且反式提供E1区功能的能力降低，总之对腺病毒的生长不利。细胞状态太老或细胞生长太慢或胰酶消化过度也不利于培养，容易导致细胞脱落。
以上是我个人的一些观点，不一定说到了点子上，仅供参考。
C2C12细胞我没有养过。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-16 10:26

我以前曾用小培养瓶养过，效果不好，易脱落；后来换用中培养瓶，效果好一些，但不知道为什么。293愿意住大屋？

作者: 2541 时间: 2012-9-16 10:26

293细胞生长太满容易脱落，塑料瓶似乎比玻璃瓶好，主要是有些玻璃瓶处理的不干净，如泡酸处理不彻底或泡酸后未洗净，塑料瓶特殊处理的内表面对细胞的贴壁和生长有利。

作者: 一叶 时间: 2012-9-16 10:27

以下是我在cuturl('www.biooo.com')的贴子，也许对大家有用。

我现在的方向其实是生物医用材料，我对一次性生物材料的性质还算比较了解。对培养瓶、培养板的重复使用简单的说两句。
一般培养瓶、培养板、培养皿的材质都是生物相容性的聚苯乙烯，且要求具有较好的光学性能。在加工成型后，要进行组织培养处理。各公司用的方法都不太一样，而且这都是讳莫如深的商业秘密。其实不外乎两种，一种是物理方法，即使培养细胞的那个面的粗糙度适合细胞粘附生长；第二种是化学方法，用季铵盐、多肽或者血清、血浆等促进细胞粘附的物质涂覆表面。
在重复使用培养材料的时候，无论用什么方法洗，都会破坏这层很薄的处理层，使培养材料的生物相容性变差。如果这样的话，我们冒着培养物被污染的危险，还不如使用玻璃培养瓶呢。
我为什么推荐使用一次性细菌培养皿呢？其实这是国内供应商对这种培养皿的一个俗称，应该从字面上翻译成“一次性使用培养皿”，也就是“Disposable Petri Dish”。这是没经过组织培养处理过的聚苯乙烯培养皿，买回后自己用聚赖氨酸、明胶、血清处理一下，灭菌后使用，效果不比细胞培养皿差，成本却低了很多。尤其向大家推荐以色列Mini Plast公司的一次性培养皿，Φ90的才8角钱一个，质量极佳，比国产的同样价格的强许多。
还有，可以买比利时Orange公司的培养瓶，价格只有Coring或Nunc的60%，我使用了一年，效果不比Nunc和Coring的差，而且是经过人体工学处理的，使用起来很顺手。

作者: 一叶 时间: 2012-9-16 10:29

以下是我把发在cuturl('www.biooo.com')的旧贴子，整理了一下，也许对大家有用。

其实DMEM细胞培养基的高糖和低糖对细胞培养影响并不大，我几年前刚开始做细胞培养时也常为此困扰。如果为了保险起见，选高糖的好了。培养基中的谷氨酰胺、丙酮酸钠浓度更重要，一定注意不同货号培养基之间的细小差别，最好选组分全加入的货号产品，毕竟省得不少另加试剂的开销。HEPES的添加也很关键，尤其对代谢旺盛的细胞更是如此。选血清时，宁可买Hyclone公司的新生牛血清，也不要用国产胎牛血清，切记。经济情况允许，建议用Hyclone的Define级血清，效果太好了。实际上国产胎牛血清都是新生牛，基本上都是病弱新生牛未哺乳前取的血，甚至不如进口新生牛血清，价格却相差不多。国产血清太“脏”了，其中的内毒素、支原体等指标都达不到要求，最近研究表明，内毒素是细胞凋亡的诱因之一。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活，灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。

Gibico的血清很好，我读硕士时一直用。但是最近两年由于疯牛病的原因（Gibico的血清不都产在美国和澳洲，也有疯牛病发生的国家），进口的少，价格也贵。同一价格的前提下，毕竟Hyclone的Define级质量更好。Sigma的血清也很好，质量标准比Hyclone的还严格。具体选那种，还得根据您的工作性质而定，毕竟在国内科研经费有限，除非老板有上千万的项目，可以不计实验成本。

关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
如果做MTT实验或类似的四唑盐参与线粒体代谢的实验，血清浓度尽可能低一些，一般5%-10%，可以减少血清对结果的干扰，尤其是采用水溶液法（如加10%SDS盐酸溶解而不用DMSO）时更加重要。如果您做流式细胞分析，需要分析细胞周期，要经过一个“同步化”过程，有的学者用血清饥饿法，也就是24小时不加血清，使细胞周期趋于同步化。

我的细胞传代原则：不用EDTA，只用胰酶，先用D-hank's洗掉残留培养基和血清，然后按1ml胰酶/10cm2培养面积加入，镜下观察，待到细胞回缩明显且尚未脱壁时（这个过程不超过1分钟），倒掉大部分胰酶，只保留细胞表面被少量胰酶湿润，37度培养箱中放置5-15分钟，直至细胞可象流沙状下滑，加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打使细胞散开，如有团块，可考虑200目筛过滤，可不洗涤离心细胞。此种方法对细胞伤害最小，如果做流式细胞分析，也可用此法，只不过在胰酶中加入等量EDTA溶液，出来的峰极规整漂亮。
某些细胞只用常规培养基不行，还必须补充生长因子或特殊量的氨基酸才能正常生长，要多参考相关文献。

另外，二氧化碳张力和温度也很重要，有些细胞需要较高的二氧化碳浓度或较特殊的温度。可选用透气盖培养瓶或培养皿培养板培养。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-16 10:29

讲究！想不到细胞培养有这么多学问！

作者: mamamiya 时间: 2012-9-16 10:30

对于293细胞的培养，我谈一下我的体会。293细胞作是一种常见的包装细胞系。
我当时的培养基配置是按一下比例，
配置高糖的DMEM培养基1000ml，
1.一袋DMEM培养基（GIBCOBRL)用去离子水溶解
2.加入NaHCO3 2.0g
3.加入谷氨酰胺 0.146g（终浓度为5mM）
4.加入青霉素10万U（终浓度100u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100u/ml）
5.定容900ml
6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中
7.加入灭活小牛血清100ml。

我感觉293细胞还是比较好培养的，只要把握好无菌原则，避免细胞污染，293细胞容易存活。当然在体外应用293细胞进行细胞转染时，如果是采用磷酸钙转染，一定要注意293细胞不要全部张满细胞培养盘，张满细胞培养盘时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落，我的经验是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染，可以避免细胞的大量脱落，再者进行细胞换液时，一定注意手法要轻，避免加入新的DMEM培养基后冲起细胞。

这是我的一点体会，只供参考

作者: Ao7 时间: 2012-9-16 10:30

经验之谈：
1、细胞很好养。Hyclone的Define级血清和Gibico的胎牛血清我都用过，我觉得还是Gibico的胎牛血清好；浓度10％足够了。
2、DMEM很好配。NaHCO2加2.5g PH就达到7.4左右了，无需多加，谷氨酰胺可加可不加，关系不大
3、消化液用的浓度胰酶0.05％＋0.02％EDTA，对细胞损害很小，其他和大家有共识。

作者: Ao7 时间: 2012-9-16 10:31

又：
细胞增殖推荐用promega的MTS法，简单，方便，好用！！

作者: xingyi08 时间: 2012-9-16 10:31

promega的MTS法？说来听听……

作者: Ao7 时间: 2012-9-16 10:32

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2012-9-16 10:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

promega的MTS法？说来听听……

楼主请看关于MTS：（来自cuturl('www.promega.com')）

CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay

cuturl('http://www.promega.com/catalog/CatalogProducts.asp?catalog%5Fname=Promega%5FProducts&category%5Fname=&description%5Ftext=CellTiter+96%3Csup%3E%26%23x00AE%3B%3C%2Fsup%3E+AQ%3Csub%3Eueous%3C%2Fsub%3E+MTS+Powder&product%5Fid=G1112')
Protocol Technical Bulletin #TB169.
cuturl('http://www.promega.com/tbs/tb169/tb169.pdf')

Related Products

CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay
cuturl('http://www.promega.com/catalog/CatalogProducts.asp?catalog%5Fname=Promega%5FProducts%5FCatalogProducts&category%5Fname=CellTiter+96+AQueous+One+Solution+Cell+Proliferation+Assay&description%5Ftext=CellTiter+96%3Csup%3E%26%23x00AE%3B%3C%2Fsup%3E+AQ%3Csub%3Eueous%3C%2Fsub%3E+One+Solution+Cell+Proliferation+Assay')

CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay
cuturl('http://www.promega.com/catalog/CatalogProducts.asp?catalog%5Fname=Promega%5FProducts%5FCatalogProducts&category%5Fname=CytoTox+96+Non%2DRadioactive+Cytotoxicity+Assay&description%5Ftext=CytoTox+96%3Csup%3E%26%23x00AE%3B%3C%2Fsup%3E+Non%2DRadioactive+Cytotoxicity+Assay')

其实四唑盐法的原理都一样，所以只是操作的简便，相对于MTT而言，并没有突破。如果要找放射性掺入法的替代，BrdU Cell ELISA或是BrdU掺入后流式细胞分析是一个很好的选择，只是价格太贵。去年￥5700买了一个试剂盒，做了三个试验就快用完了。可是花150元买500mg MTT，做到退休都用不完。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-16 10:33

这种方法的灵敏度和重复性如何，能完全代替同位素掺入法吗？

作者: Ao7 时间: 2012-9-16 10:33

虽然放射性掺入法有这样那样的缺陷，但是除了BrdU掺入法以外，其它方法无可替代。

作者: zzzz 时间: 2012-9-16 10:33

293细胞的培养主要是看他的传代数，太多了不行，所以唯一的办法是找到传代数少的细胞，然后培养。作过比较老的293状态就很差，而传数少的细胞贴壁还是很不错的。

作者: kulee 时间: 2012-9-16 10:34

大家好，看到各位的帖子，在下学到不少东西。我正在培养血管，也遇到培养液和培养基的问题，因为培养细胞和培养器官有所不同，在培养液的选择上本想用DMEM/Ham F12混合培养液，现在的问题是，实验要求培养液糖浓度应在正常血糖水平，即5.0mM/L左右，且需要较长期培养（7天），Ham F12糖浓度过高，不能使用。因此请教各位，换用何种培养液较为可行？望不吝赐教！多谢！

作者: rxcc33 时间: 2012-9-16 10:34

呵呵，想不到大伙对让细胞培养有如此多感想，实在令我很有共鸣。
总体感觉是293比hela,sy5y或者PT67要难养一些，但是使用好的培养条件，和注意无菌操作肯定会没问题，而培养基的组份一般在网上都可以查到，相信问题也不大。最要命的可能是新来的细胞在运输途中就出了问题，我曾试过只有非常少量的细胞存活下来，经过精心照料才难使其恢复元气，这花费了一个月的时间，实在是太不爽了，唯一庆幸的是这个细胞是白送的。
有哪些高手使用过乒乓的方法来提高病毒滴度？
效果如何？
请告之！

作者: 阿司匹林 时间: 2012-9-16 10:35

我觉得养这种细胞有几个关健步骤：
1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁

作者: feima+ 时间: 2012-9-16 10:36

湖北有做腺病毒的吗？我去湖医问过，他们让我如果搞到腺病毒转染质粒可以去他们那里做，可他们自己也没有做过。我找老外要了一同源重组好的质粒，目前正在找实验室，麻烦您能推荐一个吗？去武大问过，现在也没人做。

作者: daod 时间: 2012-9-16 10:37

293和C2C12我都养过，培养液均为高糖DMEM。对于293来说，传代次数并非决定性因素，在细胞生长状态较差时，可以以1：10传代来激活细胞。再有血清的使用最好是新生牛血清，可以不用灭活。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。切记一定要使用塑料瓶，可以反复使用，但要经过洗液处理。 C2C12细胞不能密度过大，否则会出现分化表型，使用玻璃瓶就可以。我一直在从事腺病毒载体的制备工作，其实很多东西不必到别人的实验室去做，自己查查操作手册或指南，照葫芦画瓢就可以了，但是重组病毒的鉴定一定要严格，我想诸位不会是仅仅为了做病毒而做病毒吧，肯定还有后续工作，对吗？

作者: daod 时间: 2012-9-16 10:38

请教一下大家，所说的一次性培养皿具体怎样处理，怎样消毒，好象高压湿热消毒不行。很想能得到您的指教。
先谢了。
在有一个问题：我现在在做大鼠气管上皮细胞的原代培养。原代培养的很好，但是再传代时，细胞的生长状态很差。传代时，我没用胶原包被培养6孔板。不知道有那位朋友做过。原代培养的气管上皮细胞能不能传代，传代时一定要用胶原包被吗？

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-16 10:39

关于一次性培养皿(塑料制品)再次使用的问题：
1.泡酸过夜；
2.蒸馏水反复冲洗十遍（目的是去处残酸），40度烤干；
3.紫外线等照射30分钟以上便可应用，照射过夜更好。
这只是我的一点经验，我在培养血管内皮细胞和平滑肌细胞时经常这么用没发现污染，细胞贴壁和生长良好。不知对你是否有用。还请大家发表意见。

作者: utt0989 时间: 2012-9-16 10:40

DMEM中有谷氨酰胺，为什么还要加呢？是不同厂家的产品，不同的成分吗
我用的DMEM（Hyclone）中有谷氨酰胺，只需每隔两周添加。

作者: utt0989 时间: 2012-9-16 10:40

配DMEM时，用盐酸和氢氧化钠调节PH值，行吗？
在配1640时为什么用二氧化碳和氢氧化钠调节？
请指教！！

作者: owanaka 时间: 2012-9-16 10:41

Essential protocols for cell culture
cuturl('http://www.qiagen.com/transfectiontools/cell_protocols/default.asp#ref')

作者: orangecake 时间: 2012-9-16 10:54

我个人也就的MTT测细胞的增殖才是经济，方便，实用的方法

作者: mamamiya 时间: 2012-9-16 10:54

Current protocol中SP2/0推荐用90% 胎牛血清(FCS) + 10% DMSO冻存。我们实验室用50% FCS + 40% Medium + 10%DMSO.

Current protocol 还建议细胞进入冻存液后，到真正入-70度冻存这时段不应少于15分钟。并且认为这段时间直接影响以后复苏质量。但一些却认为，细胞入冻存液后，应尽快冻存，你们的看法呢？

作者: bananapeople 时间: 2012-9-16 10:55

梯度降温，每分钟1度似乎比较理想

作者: fklo83 时间: 2012-9-16 10:55

请问哪位朋友有 GP2 293细胞呀？我这里养的很差，需要大家帮助。
293细胞是不是不是很贴壁？我养别的细胞贴壁很好，而293总有一部分贴的不好。
多谢。

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-16 10:55

细胞培养：RPMI-1640培养基如果标签上已经注明"with L-glutamine"，还要不要添加谷氨酰胺？添加量多少？象这种已含有L-glutamine的1640，其L-glutamine的浓度是多少？
再进一步，一般细胞（肿瘤细胞如S180，B16等）的培养需要谷氨酰胺的浓度应该是多少？
谢谢！

作者: bananapeople 时间: 2012-9-16 10:56

293是半贴壁细胞中较靠近贴壁的一种，所以ATCC建议胰酶消化，但不用胰酶也可以吹打下来。293细胞状态好不好主要看细胞是否清亮等等。但我自己的感觉好象是状态好的293贴壁紧。

作者: utt0989 时间: 2012-9-16 10:56

细胞培养：RPMI-1640培养基如果标签上已经注明"with L-glutamine"，还要不要添加谷氨酰胺？添加量多少？象这种已含有L-glutamine的1640，其L-glutamine的浓度是多少？
再进一步，一般细胞（肿瘤细胞如S180，B16等）的培养需要谷氨酰胺的浓度应该是多少？
谢谢！

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注明了“with L-glutamine”的培养基就不需要再加谷氨酰胺了，已含有L-glutamine的1640中L-glutamine浓度为2mM/L，其它细胞的培养就得看它们各自培养基是什么了，因为不同培养基其L-glutamine浓度也有差异，详细请见cuturl('http://www.atcc.org/Products/ClassicMedia.cfm')

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-16 10:57

293细胞用酶消化很容易下来，但是吹成单细胞却有点麻烦。各位能不能帮我指出问题出在什么地方。请问yong主任单纯吹下来的293细胞容不容易成单细胞形态？

作者: bananapeople 时间: 2012-9-16 10:58

吹打下来的细胞分散得没有消化的细胞分散好。

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-16 10:58

你用的胰酶加edta吗？胰酶浓度是多少，我在atcc上看到是0.25％，这里好像有朋友推荐0.05％，我依此浓度消化，效果很差。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-16 10:59

293细胞用酶消化很容易下来，但是吹成单细胞却有点麻烦。各位能不能帮我指出问题出在什么地方。请问yong主任单纯吹下来的293细胞容不容易成单细胞形态？

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消化时最好放入培养箱，在37℃时酶的活性最高，再加以仔细吹打（注意：吹打一定要有顺序，瓶底朝上，不要遗漏任何一个角落），应该没什么问题。有一次我养的一种细胞放在培养箱消化过久，导致细胞全部脱落到酶液中去了，麻烦得很。单纯吹下来的细胞一般不太容易形成单细胞形态。特别是密度很大或汇合了的细胞传代，不太可能会是单细胞。

作者: bananapeople 时间: 2012-9-16 11:01

我使用的胰酶浓度是0.125%，调PH可以用NaOH，也可以用NaHCO3，带酚红的胰酶调至紫红色消化能力强。消化温度也重要，可以用手加热细胞面，难消化的细胞也可以放入温箱。胰酶加入前，细胞最好用无血清的培养基或PBS洗一遍。如果胰酶效果好，胰酶加入后稍浸泡就倒掉，残存在瓶内的量足够消化彻底。
293贴瓶不紧，需要的消化较温和，一定要防止过消化。消化至细胞面看上去出现绒毛感较好，此时细胞形态已经变圆。如果消化的细胞随瓶流淌则消化过头了，这种细胞已经受伤，不好培养。
EDTA浓度我不记得了，你查书吧，EDTA的量增加一点也可以加速消化。

作者: S6044 时间: 2012-9-16 11:02

我最近养HEK293摸出了一点小经验，大家不妨一试。首先解决贴壁问题，可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿，方法是将明胶加入培养皿，使之浸泡到底面的各个部分，然后吸出，置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。当然了，若是新的塑料培养瓶就不用处理了，玻璃瓶我看还是下点功夫的好。第二是传代问题，细胞在达70~80%密度时就进行传代，传代时将欲传细胞从培养箱内取出，垂直放置5分钟，然后在瓶内加入等体积的预温至37度左右的培养液，充分吹打并1：1分瓶。在该过程中不一定非要吹成单细胞悬液，只要没有大的细胞团就行了。这样传代就是有点累，每24小时一次，不过伺候好了，细胞挺争气，分瓶后很少看到浮着的死细胞。

作者: yychen 时间: 2012-9-16 11:04

我不赞成反复使用一次性细胞培养器具，极难洗干净的。我曾经试验过反复使用，效果不理想。

推荐便宜的细胞培养耗材，比利时Orange和以色列Miniplast。二者的质量毫不比Corning、Facol的差，价格只有前者的1/2-3/5。我个人认为，Orange的培养瓶比Nunc公司的效果还好呢！

作者: pencil菲 时间: 2012-9-16 11:05

污染问题
刚刚开始培养细胞，是成纤维细胞，用DMEM+10%FCS，最近发现细胞总被污染，培养液中漂浮着一团团死细胞壮的东西（不敢肯定是死细胞还是细菌），时间长了会增多，但不见运动（听说细菌是能见运动的），很着急不知该如何控制，我试着用新洁而灭查过，不见好转，不知是什么原因，恳请指点。

作者: bananapeople 时间: 2012-9-16 11:05

你描述的不太清楚，有可能是霉菌，但霉菌污染在镜下可看到明显的菌丝。新洁而灭只是表面消毒，而不是灭菌，擦拭表面可降低污染几率，你作的是对的。但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。可在前面养细胞时加上制霉菌素或放线菌素D或双抗，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作了。

作者: lagua123 时间: 2012-9-16 11:05

谢谢，好在只是个别污染，我看了，没有菌丝，应该不是霉菌吧，我把污染的细胞在外面又放了一天，看到死细胞团块明显增多，不过还有很多细胞仍然贴壁，不知到底是什么污染。

作者: plaa 时间: 2012-9-16 11:06

请问各位细胞培养前辈，我现在要培养乳腺癌MDA231细胞，我找的细胞株是用1640培养的，而我从书上和文献上看，用于转染最好用DMEM，问：是否可以改换DMEM培养？改换时应注意什么问题吗？是慢慢过度，还是消化后直接换成DMEM？请指教

作者: zranqi_1 时间: 2012-9-16 11:06

我个人经验是1640的缓冲能力要大于DMEM。乳腺癌细胞MCF-7就是用DMEM加胰岛素养的，所以问题可能不大，为防万一，开始可使用1640/DMEM。转染并不是非DMEM ,关键是不能加抗生素，细胞密度，血清浓度，及转染试剂的质量等。

作者: loli 时间: 2012-9-16 11:06

我刚刚看了“細胞培養常見之問題與回答”（cuturl('http://www.nhri.org.tw/b5/plan/faqculture.htm')），上面怎么说不能使用与原来培养条件不同之培养基？你说可以，是不是1640和DMEM的组分相差不是很大，所以可以？你说的1640的缓冲能力大是什么意思，是指用1640还好些吗？

另外，我需要MCF-7细胞株，谁有呢？

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-16 11:07

我养的HepG2细胞总是成团，想要种到96孔板，很难达到单细胞的要求。消化时间短，成团根本没有办法分开：消化时间长，是分成单细胞了，但是细胞损伤极大。我花了将近2个月的时间也没有摸到合适的条件（痛苦哇！！！！）。那位仁兄养过hepG2，有没有碰到这种情况，怎么解决？会不会是我的细胞株退化的关系。

作者: 一叶 时间: 2012-9-19 11:11

污染问题
刚刚开始培养细胞，是成纤维细胞，用DMEM+10%FCS，最近发现细胞总被污染，培养液中漂浮着一团团死细胞壮的东西（不敢肯定是死细胞还是细菌），时间长了会增多，但不见运动（听说细菌是能见运动的），很着急不知该如何控制，我试着用新洁而灭查过，不见好转，不知是什么原因，恳请指点。

我认为是霉菌。我有过两次经历。培养液是清亮的，倒置显微镜下无一点杂质，37度孵箱培养2-3天，任清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，走向死亡》需尽早处理

作者: 大白菜 时间: 2012-9-19 13:59

出现这种情况时，培养瓶里的细胞长得密吗？有些细胞在密度较高时容易悬浮起来。
要是你的细胞在某段时间总是污染，就要怀疑是否从培养基、胰酶、器皿、移液枪等带进去的污染了。可以用你的培养基做个试培，看在不接种细胞的情况下是否也有这种现象。
要是你担心自己养细胞污染，可以加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-19 15:55

请教高手：
我买的CALTAG 公司的单抗：鼠抗人cd28，catlog no：MHCCD2800 克隆号：15E8(CLR-402).鼠抗人cd3：The catlog no.is MHCCD0300 and 克隆号： S4.1(706）
这两种抗体能不能做淋巴细胞培养的联合刺激剂？我用了，淋巴细胞就是不长，有什么办法？还有，淋巴细胞分离时有大量的血小板混入，怎么解决？
谢了！

作者: utt0989 时间: 2012-9-19 15:56

1640的缓冲能力大是指在相同培养条件下，1640的pH变化小。我的感觉是“不能使用与原来培养条件不同之培养基”理论上应是这样，实际操作起来是可以换的，如MEM培养的细胞可以用DMEM，有些用1640的可以用DMEM或DMEM/1640，但一般情况是低营养的可用高营养的代替。你在哪里，用MCF-7何用？

作者: HP007 时间: 2012-9-19 15:57

这种问题我在培养细胞的过程中也遇到过。我个人认为：首先可以排除细菌污染的可能，细菌很小，污染后只看见培养基很浑浊，而且，一旦污染，很快就看到。即使在倒置显微镜下，培养基也是一团模糊。只有在高倍镜下，才能看到细菌形态，很小，一般是杆状（大肠杆菌类）或很小的球形（链球菌或葡萄球菌），一般情况下，密度很大从而使整个培养基都不透明。第二，是霉菌的可能性也很小，因为霉菌形态更容易辨认，一般肉眼就能看出。培养基内有絮状物，或很大的团状，丝状物。显微镜下可以看到长长的菌丝。
如果你的细胞培养过程中，培养基一直是透明的，只是时间长了会出现很多团状的类似死细胞的物质，那么一下两种可能最大：1 支原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。2 营养问题：也就是说，根本不是污染，而且营养环境造成的。营养环境当然包括多方面的因素，包括细胞培养中所接触的所有器械是不是洗干净，三蒸水的质量，血清的批次（内毒素含量），培养基的PH值、存放时间，细胞是否需要一些特殊的生长因子，CO2张力，甚至培养环境中是否存在有害气体等等。总之，一切不适于细胞生长的因素都可能造成细胞死亡或凋亡，从而使培养过程中出现一些死亡细胞的团块。

作者: greenbee 时间: 2012-9-19 15:57

我养过HepG2，也遇到相似的情况，HepG2细胞总是成团大概有一下几点吧，我个人的观点。
1.HepG2长的特别快，如果等到融合后再消化，就不易消化了，总是成团。细胞有部分相互接触后，就应该消化了。
2.注意酶的活性是否还好。掌握合适消化的程度：在镜下观察细胞膜有些回缩，细胞间的空隙增大为好。如果细胞变成圆形，则消化过了。看到消化可以了，立刻把培养瓶树起，到掉消化液，加入培养液终止消化。吹打后要到镜下观察，是否细胞分散成单个细胞。
3. 有一次我把进口血清换成国产血清后，细胞总是长成团状。

作者: one 时间: 2012-9-19 15:57

Mini Plast公司的一次性培养皿在中国由哪个公司代理？买来后要不要消毒？
小弟经费有限，不得不买便宜货。还有，我的明胶放得太久了，可不可以高压消毒？这样会不会很影响它的活性？多谢！

作者: pencil菲 时间: 2012-9-19 15:58

明胶放得时间长了问题并不大，可以高压消毒，然后室温存放。

作者: xyw5 时间: 2012-9-19 15:58

我在培养人胚肺成纤维细胞，传不了几代，现在手头已经没有细胞了，谁能提供我一瓶啊，不胜感谢。（实验急需，又无力购买）

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-9-19 15:58

请问：有的实验（比如：转染）要求细胞的传代次数不多，请问已建系的细胞株存在着传代次数吗？传代次数应从原代培养算起，还是从冻存后复苏算起？

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-9-19 15:59

最近我们实验室养的正常肝脏细胞L-02有一个培养瓶里出现许多黑色的颗粒状物质，遍布于细胞间隙和培养基中，细胞也被其覆盖，形态看不清楚，这些黑色颗粒好像贴在瓶壁上一样，非常牢固，细胞生长状态还行，以前有一瓶细胞中也有这种情况，现在这瓶细胞还行，但是这种黑色颗粒状物质到底是什么东西一直弄不清楚，不知大家有没有遇见过这种情况，可否给我指点一下，谢谢。

作者: junhun 时间: 2012-9-19 15:59

请问：有的实验（比如：转染）要求细胞的传代次数不多，请问已建系的细胞株存在着传代次数吗？传代次数应从原代培养算起，还是从冻存后复苏算起？

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据我所知，应从原代算起。如：传10代后，冻存，再复苏继续培养即为11代。
请问有哪位在做肠上皮细胞培养。我是用生后一天乳鼠小肠，污染问题已解决，肠隐窝已完全分离下来且无杂细胞，目前遇到的问题是：隐窝分离下来后，高糖DMEM培养基培养，但细胞就是不争气，培养5天就剩下不多了，还请哪位指教。先谢了。

作者: junhun 时间: 2012-9-19 15:59

再请教你一下，建系的细胞是永生细胞，它也存在传代数吗？谢谢指教。

作者: skytree 时间: 2012-9-19 16:00

请问有水养过CHO细胞，我要养了，该细胞有何特点，养时应注意些什么？

作者: zhezhe 时间: 2012-9-19 16:00

目前遇到的问题是：隐窝分离下来后，高糖DMEM培养基培养，但细胞就是不争气，培养5天就剩下不多了，还请哪位指教。先谢了。

原代细胞一般选择低糖培养液好一些，传过5代以后就可以用高糖培养也了。

作者: zhezhe 时间: 2012-9-19 16:00

再请教你一下，建系的细胞是永生细胞，它也存在传代数吗？谢谢指教

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是的，代与代之间的许多性质不同。有时有很大差异。

作者: zhezhe 时间: 2012-9-19 16:01

原代细胞用低糖培养基，

建系细胞用高糖培养基。

作者: langlang 时间: 2012-9-19 16:04

再请教你一下，建系的细胞是永生细胞，它也存在传代数吗？谢谢指教

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有些建系了的细胞也是经过病毒改造了的,可以保持原来细胞的特点,但可以传代.

作者: daod 时间: 2012-9-19 16:05

各位有没有用1640养过293细胞，效果一样吗？

作者: wood533 时间: 2012-9-19 16:05

我刚刚开始养细胞,发现培养瓶中有一些小黑点(物镜20*),且有增多的趋势,并不停的在动.但刚开始不影响细胞的生长,过了一段时间后细胞生长状况开始不好.不知是什么原因?

作者: 101010 时间: 2012-9-19 16:08

这大概就是所谓的黑胶虫，双抗、制霉菌素等均无效，只有抛弃。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:08

谈谈293细胞：

人胚肾细胞系293是一种E1区缺陷互补细胞系。用磷酸钙共转染法很容易使DNA进入细胞。悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定，，应用时最好采用单层培养。
传达次数较少的单层培养293细胞是成功获得重组病毒和病毒斑的关键。２９３细胞的培养质量特别是单层培养的品质情况是病毒斑形成的重要因素。也是重组子构建成功与否的关键。２９３细胞在传代１２０次以后，其生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，一旦出现这种情况很能形成病毒斑。应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。单层培养细胞在５－１０％FBSDMEM中能生长很好。一般来讲，１：１０传代后，一周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:11

293细胞用1640养没问题，不过DMEM不比1640贵哪去呀，干吗不用１６４０
２９３用１６４０养时得驯化，我做过一次，２－３代就可以了。
保险起见，建议１０带以上，以期遗传性状稳定。祝你好运。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:11

建系的细胞也存在寿命问题，真正永远生长的细胞系是不多见的。
大多数细胞系的寿命是１.5－２.0 年，或者１５０代，所以，细胞系在引进后一定要冻存，所以细胞系有老化问题，同一细胞系，不同实验室也有可能不一样，原因就在这。
明白了吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:12

你弄混了建系的概念。

一般来说，原代之后的细胞培养均称为细胞系，只是大多数细胞系在传代2-6代间都趋于死亡了，能稳定传代的细胞系不多，传下来的就是我们常见的“细胞系”了。我们常见的细胞系实质上只是细胞系的一小部分，只是能稳定传代的那部分细胞系。
因此，也存在代数的问题，要从原代之后开始算，一般能稳定传代的都是10代以后的细胞系。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:12

你的231是用什么转染。脂质体还是电穿孔，
要求不一样的，其实什么都可以，试试，其实我的经验都是试出来的，做多了就知道了，其时，绝大多数试验的要求还是比较宽松的，不一定要按书本作。明白道理，你会自由很多。

祝你好运。

作者: yychen 时间: 2012-9-19 16:12

我养的不是293细胞，我养的是MCF-7。因为我的细胞是找别人拿的，所以我不知道传了多少代，而实验要求细胞传代次数不能太多，而给我细胞的人也说细胞有些老化，但我拿回来后，长的很快，我已冻了两管，不知这样的细胞能用于实验吗？请指教。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:13

MCF-7细胞很皮实的，没问题，长得飞快的，很耐老化。没问题，多加血清，有半个月就可以了。

作者: tuuu2 时间: 2012-9-19 16:15

我从两个地方拿过2次HepG2细胞，细胞的性状截然不同，有点细胞退化太厉害了。深感细胞应该注意及时冻存保存。传代对细胞影响太大了。

作者: mamamiya 时间: 2012-9-19 16:16

各位细胞培养的高手：
1.从外周血分离PBMC，通过黏附贴壁的方法，加入IL-4、GM-CSF诱导贴壁的单核细胞向DC转化，一般40ml外周血能够分离得到多少DC？
2.PBMC中诱导出的DC，CD1a阳性的细胞量有多高？
3.7天后镜下观察的细胞基本都悬浮生长，光镜下观察的细胞外形都是圆的，怎么不象一些文献中所说的有毛刺状突起。

谢谢。

作者: one 时间: 2012-9-19 16:16

个人体会，如果所培养的细胞培养时间过长，细胞老化，可以把细胞以极低密度传代，消化细胞成悬液后，只要一滴或几滴，传到别的培养瓶中，多放培养基，培养它十来天，长出来的细胞都是很好的集落状，长滿60%汇合后传代，就会发现，此时细胞不仅形态好，而且活力甚高。

作者: pencil菲 时间: 2012-9-19 16:17

可能是你们财大气粗，我们科室都是用国产的杭州四季青的血清也挺好的。
我们科室有养白血病细胞的，也有养骨髓细胞的（包括骨髓干细胞），还有做造血干祖细胞集落培养等。
对于293细胞我没养过，但欢迎大家一起交流所有细胞培养方面的知识。

作者: dotaaa 时间: 2012-9-19 16:18

这大概就是所谓的黑胶虫，双抗、制霉菌素等均无效，只有抛弃。

有时可能是细胞碎片，如果想留下细胞的话，可以离心几次，或许能够解决问题。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:18

楼上是毕隆转基因公司的吧。

已经不止一次发现你们公司的广告了。

这里是学术交流区域，

还是请兄台找合适的地方做生意吧。

你慢走，不送。

谢谢！···

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-19 16:19

我培养的是HepG2 细胞,用的是DMEM低糖培养基。培养过程中出现一些透明的、颗粒状的东西,有的散在细胞之间,有的吸附在细胞表面.而且越来越多，但培养液不浑浊。刚开始时细胞生长不受影响，后来细胞就长不好了。我试着加两性霉素D，也除不掉。但我的培养液中有双抗，应该不是细菌污染啊...请问大家有没有相同的经历啊...都快急死了...
兄弟们...帮忙啊...而且那东西比细胞小得多...越来越多之后细胞就很难看...有的细胞从瓶壁上脱落下来...
就是不明白那是什么东西啊...有什么办法可以除掉啊...

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-19 16:20

...显微镜下观察,没有看到菌丝...只是单个的颗粒.....到底是什么啊....真是又烦又急.....

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:21

这种东东我遇到过，它多发生于细胞很长时间不换液，长得很老状态不好的时候，其实质是什么我不清楚，可以肯定不是细菌真菌，支原体或黑胶虫。丫啶橙染色显明量均匀的绿色，表明其核酸丰富，但细胞质并不明显。通过多次换液，当细胞如果能转好的时候，这些东东会消失，给人感觉是这些东东天然存在，细胞长不好就会致病，就像机会感染一样。

早年我还换液挽救，但很快就不干了，根本就得不偿失，不如重新复苏一只新的细胞。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-19 16:22

我觉得不能排除污染，你可以请细菌室的帮忙看看，染色后几分钟就可以知道。我的细胞曾经被空气中存在的极低毒性的细菌污染，表现和你描述的极象。且细胞可以长期换液不浑浊。

作者: remenb 时间: 2012-9-19 16:24

有哪位同道培养过“原代”成骨细胞？能否介绍些您的经验？如取材、所用的培养基，最好给介绍些具体的成功步骤。
谢谢！！

作者: owanaka 时间: 2012-9-19 16:24

Mini Plast公司的一次性培养皿哪家公司代理？

作者: 园丁## 时间: 2012-9-19 16:25

呵呵呵...谢谢各位的帮助,我已经找出原因了,是支原体感染....用一些点抗生素轻松搞定啦......对细胞无任何不良影响,而且据说目前尚无耐此种抗生素的支原体菌株....

作者: 铜雀 时间: 2012-9-19 16:27

是哪种抗生素呀？
红霉素类的吗？除了大环内酯类还有别的吗？

作者: yueban-1147 时间: 2012-9-19 16:30

不是啊...是泰乐菌素...兽用支原体病的药....但可用于细胞培养...无任何不良反应...Sigma有得卖....很便宜的120元/20ml(8mg/ml).....
使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染....

如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度....

作者: zsxan1990 时间: 2012-9-19 16:32

我想往细胞培养液里加入其他的一些诱导物质，不知有什么要注意的地方？望各位指点一下！

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-19 16:34

我觉得你需将你具体情况说得更具体点，这样才能针对你的问题提出建议。
我想第一应是无菌（这点就不用说了），第二是加入的浓度是个非常要注意的地方，但不知你的意图不好详细说。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-19 16:35

我的人胚肺纤维细胞一买来，用我的培养系统后也出现，死细胞团块，黑色丝状。培基不变浑浊，我想是支原体污染。我用的是杭州四季青的超级小牛血清。细胞慢慢死去，越来越少。这位兄弟的细胞大概也是这种情况。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-19 16:35

我的情况是这样的，我在座干细胞的定向分化，想在细胞培养液中加入一种药物（临床上用的），不知剂量如何确定，比如：临床上要求用生理盐水或葡萄糖稀释，按体重使用的，我在细胞培养中怎么办？谢谢！

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-19 16:35

Disposable Petri Dish不都是塑料的吗？那怎么灭菌，湿热灭菌不变形吗？

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我为什么推荐使用一次性细菌培养皿呢？其实这是国内供应商对这种培养皿的一个俗称，应该从字面上翻译成“一次性使用培养皿”，也就是“Disposable Petri Dish”。这是没经过组织培养处理过的聚苯乙烯培养皿，买回后自己用聚赖氨酸、明胶、血清处理一下，灭菌后使用，效果不比细胞培养皿差，成本却低了很多。

作者: caihong 时间: 2012-9-19 16:36

“最近我们实验室养的正常肝脏细胞L-02有一个培养瓶里出现许多黑色的颗粒状物质，遍布于细胞间隙和培养基中，细胞也被其覆盖，形态看不清楚，这些黑色颗粒好像贴在瓶壁上一样，非常牢固，细胞生长状态还行，以前有一瓶细胞中也有这种情况，现在这瓶细胞还行，但是这种黑色颗粒状物质到底是什么东西一直弄不清楚，不知大家有没有遇见过这种情况，可否给我指点一下，谢谢。 "

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我也遇到相同问题,细胞被黑色颗粒物质影响到不能贴壁伸展,请有经验的朋友帮忙解决困难!

作者: kulee 时间: 2012-9-19 16:36

我觉得应该先查相关文献,根据文献确定浓度或直接向这一领域专家求助,最好是外国人,日本人除外.最不理想的办法是自己摸索.浓度梯度..

作者: 2541 时间: 2012-9-19 16:37

293细胞转染效率比较高，生长快，有的用。只是经不得震动很是烦人，但是如果生长不是占满空间的话，还是比较好处理的，我自己的感觉是胰酶消化蛮重要，不要浓度太高，浓度较低的消化，在孵箱里宁可多放些时间，待到成流沙状移动时，加血清终止。传代后长的很可爱，最好不要老传代，容易走样。

作者: tuuu2 时间: 2012-9-19 16:37

我在培养草鱼吻端上皮细胞ZC7901细胞系，我们一直用EDTA来消化，但有时单靠EDTA又很难消化，我尝试过加入少量的胰酶，例如当我按0.05%胰酶+0.02%EDTA进行消化，在消化液加入到培养瓶之后，马上出现如流沙般倾下的状况，结果，细胞几乎没有收获到，所以关于要不要加胰酶，加多少，让我很难摸透。
另外，我所培养的这种细胞很难在96孔板上帖牢，即使是细胞生长状况很好时，也只碰上仅有的几次贴壁的情况，这是个一直捆扰我的问题。
我还遇上这样一个问题，细胞经常呈集落状生长，不均匀贴壁，集落集落之间好象出现生长抑制一样。把这样的细胞经过消化后，直接加入培养基不换瓶，则细胞能贴壁均匀生长，可是当再次一传二或三时，新瓶子的又是集落状生长。
各位有经验的XDJM，能否给我一些建议？不甚感激呀！

作者: join 时间: 2012-9-19 16:38

你好！不知你查的文献的结果是怎么样，人家要是做过是最好的，你可以参考一下人家所用的浓度来试一下你的实验。但别人要是没做过相似的实验的话，看看有没有人用这个或这一类的药做过细胞实验，根据他们用的浓度结合你的实际情况选几个浓度做个浓度梯度关系，看看结果如何？再具体筛选。
我做的是药理血液方面的课题，因此可能对药物筛选有点熟悉。如果你还有什么问题的话或想更具体讨论的话。可以写信给我。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-19 16:38

别人是在人的细胞系上做的，我是用小鼠细胞系，不知这样有什么要改变的？

作者: gmjghh 时间: 2012-9-19 16:39

各位朋友，有没有养中脑多巴胺能神经元的呀？我试过两次，但都因胎鼠脑子太小，没法定位，以失败告终。
我个人认为培养基中血清比例最好不要超过20%, 因为20%以上时会产生一种抑制因子，反而抑制细胞的生长。一般10%--15%就够了。

作者: 铜雀 时间: 2012-9-19 16:39

我的建议是首先找出合适的观察指标，然后用人家做过的剂量去试一下，就有结果了。甚至可以他们的浓度为中间浓度上下选几个浓度大致筛选一下。至于针对这个细胞株有无特殊要求，这还得你去找建系的文献看看它的生长特性。做细胞培养，要你做得多了，自然会有些只可意会不可言传的经验。所以我的建议去试着做，多做几次，你就会有收获了。
一般来说是没什么大的改变的。保险的做法是按照我上面的建议试一下。

作者: guagua 时间: 2012-9-19 16:40

我也养了一段时间的293细胞了，谈谈我的一点经验：
1.细胞传代比例为1：4，这样细胞密度不会太大，容易吹打成单细胞悬液。
2.一般隔天传一次代，也就是今天传代的话，下次应该是后天传代
3.胰酶消化前用PBS洗一遍，这样消化效果会比较好
4.我用的是国产的四季青新生牛血清，感觉还不错
5.用塑料培养瓶

目前正在扩增腺病毒，各位高手请多多指教

作者: yhz1973 时间: 2012-9-19 16:40

有没有哪位养过骨髓基质细胞？我想请教有关取材和培养需注意什么问题？一般取材时对鼠龄有何要求？谢了。

作者: guagua 时间: 2012-9-19 16:41

骨髓基质细胞我养过兔子的，一般取2-3斤重的兔子，用骨髓穿刺针从胫骨平台或者大转子穿刺，注意穿刺的落空感，小心不能穿透了，穿刺到位的话，是比较好抽的，一般取1到2ml就可以了，然后是离心，1000rpm10分钟，弃去上清，用含10%的胎牛血清的DMEM培养液重悬，接种于培养瓶中。次日要及时换液，除去飘浮的红细胞。

至于鼠，我不知道有没有那么小的穿刺针，或者你可以把股骨两端剪断后，用PBS冲洗髓腔内部，得到的冲洗液再离心，其他步骤同上。

作者: yhz1973 时间: 2012-9-19 16:41

我还想问一下，淋巴细胞分离液有什么作用？是不是可以不用？淋巴细胞也是悬浮的吧？那么换液时不是就可以去掉了吗？
我看到一些文献取材后第7天才首次换液。
还有，在培养的过程中要注意什么地方吗？

另外，低糖和高糖的DMEM在应用中有很大的区别吗？谷氨酰胺、VitB6、丙酮酸激酶、碳酸氢盐又分别有什么用处？
谢了！

作者: join 时间: 2012-9-19 16:42

骨髓基质细胞的培养中文文章很多的，一般是取股骨，用注射器冲出细胞后，反复吹打，或过4＃针头，然后用15％血清的DMEM培养即可，过夜后弃掉悬浮细胞即可！

作者: join 时间: 2012-9-19 16:43

cuturl('http://10.15.61.242:85/~kjqk/xbyfzmyxzz/xbyf2002/0204pdf/020427.pdf')
这是一篇文章！
另外，淋巴细胞分离液当然是分离淋巴细胞，一般是要用的，要不一些红细胞，细胞碎片之类的就很难分清楚了，一般的分离液很好的，我们实验室有的时候用它分离鱼的淋巴细胞，还可以，但不如percoll好用。淋巴细胞是悬浮的，换液时，可以离心成沉淀后再用培养液悬浮，这位朋友去看看细胞培养方面的书吧！

作者: yhz1973 时间: 2012-9-19 16:45

我还想请教一下，为什么取材时用低糖的DMEM，以后又用高糖的DMEM来培养。我比较了一下，除了糖含量以外，低糖的DMEM还含有丙酮酸激酶。这有什么影响吗？淋巴细胞分离液只是把淋巴细胞沉降下来，还是把红细胞、白细胞等也沉降下来？再次感谢！

作者: sunnyB 时间: 2012-9-19 16:48

大鼠骨髓基质细胞的取材和培养

我用过15天内的新生鼠、一月龄重约100g的大鼠和二月龄约重200＋g的大鼠，结果是15天内的新生鼠、一月龄重约100g的大鼠取材效果都可以，二月龄约重200＋g的大鼠取材的细胞长得不太好。

最简单用直接贴壁法：一般取股骨和胫骨骨髓，麻醉后75％酒精浸泡消毒后将双侧股骨和胫骨取下，剪开骨端，用含15％血清的低糖DMEM 冲洗骨髓腔，吹打分散细胞，直接接种培养瓶。1-3天换液，PBS洗去血细胞。

也可以用Percoll，Ficoll分离

作者: sunnyB 时间: 2012-9-19 16:50

淋巴细胞分离液可以分离去掉红细胞（最下面）和淋巴细胞（次下面），骨髓基质细胞在单个核细胞层，就是分离液上面的一薄层白色细胞层。

DMEM选用低糖

作者: ending 时间: 2012-9-19 16:52

文章已收到。谢谢！
我今天已取了基质细胞，一部分用了淋巴细胞分离液，一部分没用淋巴细胞分离液，看效果再说吧。

作者: yes4 时间: 2012-9-19 16:53

细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
解决办法：
1、扔掉细胞
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。

作者: yhz1973 时间: 2012-9-19 16:54

怎么干细胞讨论组没法添加图象,只能在这儿求助了,
大家帮我看看图象里面的是不是拟胚体?左上角的那个中间怎么好像又有一层,而且,我这一批拟胚体好像有3层结构的!
谢谢!

图片附件: 93908-2.0-embed.jpg (2012-9-19 16:54, 109.36 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13868

作者: wu11998866 时间: 2012-9-19 17:39

各位同仁，能否介绍一点关于DRG细胞原代培养的经验？我马上要开始养细胞了，我查了很多文献，发现他们用的胶原酶、胰酶的型号差别很大，还有培养基，有用Ham's-F12的，有用Ham's-F12和DMEM(1:1)混合物的，不知哪一种更好？
还有其他一些应该注意的问题，还望多多指教！

作者: 831226 时间: 2012-9-19 17:41

细胞原代培养,首要的最关键的问题是是要保证无菌,因原代培养比买细胞系要复杂许多,操作步骤多,容易污染.
关于消化的问题,胶原酶较温和,对细胞损伤小,但价格贵.胰酶作用强,价格便宜很多.前者适合消化纤维少的组织,后者相反.有时可二者以一定浓度比混合使用.具体的多大浓度,消化多长时间,你最好参照细胞培养的书,或直接查文献.要不只有自己摸索.一般,百分之零点二五的胰酶,消化10MIN差不多了,37度.
至于培养基对细胞影响不大.但原代最好用15-20%的小牛血清,当然有条件的用胎牛血清更好

作者: toy 时间: 2012-9-19 17:42

我想问问血清要是灭活时间过长，两个半小时会有什么影响吗！！

请指教！！

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-19 17:43

血清灭活时间不宜过长...过长严重影响血清活性....一般在灭活时取装等量水的瓶子与血清同时放入56度的恒温水槽中...在装水的瓶中放一温度计....等温度上升至56度后保温半小时即可....

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-19 17:44

另外...血清在从-20度中取出时应放到室温或4度冰箱中解冻...约需一天时间左右....切忌放到37度的水槽中解冻...不然血清中会出现沉淀...影响血清活性.....
等血清完全解冻后再进行灭活....根据经验...其实将4度或室温的血清放到56度的水槽中45分钟左右即可....不必那么严格......

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-9-19 17:45

我在群上看到如果不作免疫学方面的试验，血清可以不灭活，我要做细胞免疫化学，这算不算是免疫学方面的试验呢，另外，如果血清没有灭活，会对细胞产生什么样的影响，大概多长时候就会产生这样的影响，我前几天配的培养及血清没有灭活，我急切想知道这个问题，请各位大侠告知详情，谢谢

作者: hold住 时间: 2012-9-19 17:45

我的经验也是56°半小时，要不然补体还是有活力的，对细胞有害

作者: utt0989 时间: 2012-9-19 17:46

我现在正在做细胞培养，但是对血清也没有灭火，而且，我们实验室其他的人也不用灭活血清，仅供参考！！

作者: one 时间: 2012-9-19 17:49

请教:
MTT法检测的时候,96孔板要不要离心?我自己请教过别人,两位老师告诉我不用
离心,但有些文献上说需要离心,我们实验室因为没有可以离心培养板的离心机,所以我想能不能用别的方法来替代,因为也没有可以进行旋转培养的培养箱,所以我就隔7,8个小时轻轻晃晃,不知道是否可行?
Tris-NH4Cl可以裂解红细胞,但我一直没有查到配置方法不知哪位能告诉我.
哪位能推荐我一本介绍淋巴细胞培养的好书,我现有的书都是一带而过.
我的email 是lx72587@163.com
欢迎大家多多指导!

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 10:44

关楼上的问题：
mtt一般是不需离心，但你培养的是淋巴细胞属于悬浮生长的细胞，所以必须离心（1000rpm，5min），才能避免培养液或血清的干扰。

Tris-NH4Cl可以裂解红细胞，具体的配方：0.83%ammounium chloride+
10 nm Tris-HCL（PH 7.4）
不知你是在做哪一种淋巴细胞培养，不过，向你推荐一本挺好的书，上面关于各种淋巴细胞的培养及其应用都有，《体外培养的原理与技术》薛庆善主编科学出版社 2001

作者: one 时间: 2012-9-20 10:46

谢谢楼上的帖子,但我现在的困难是没有可以离心培养板的离心机,唉!
关于你推荐的那本书,我很想购买,请问从哪里可以订购?不好意思麻烦你复印!(请问你的Email是?),关于Tris-NH4Cl的配方,请问10 nm Tris-HCL（PH 7.4）中nm什么意思?是纳克吗?(不好意思)
我培养的只是小鼠淋巴细胞,没有分T细胞或其它的细胞进行培养,然后给予一定
干预后检测一些指标,但因为是才接触细胞培养,所以有很多向大家学习的地方.

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 10:52

我想与大家交流一下有关osteoclast的培养经验，谢谢

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 10:53

你好，nm 的意思是纳摩尔每升，
我的Email是wuj8281@sina.com
《体外培养的原理与技术》在本校的“兴科医药图书有限公司”有售，
电话028-85442160

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-9-20 10:53

小弟的课题要用内皮细胞，不知有哪位南京的同道正在培养内皮细胞，能否提供点给我。

作者: dotaaa 时间: 2012-9-20 10:54

前两天作了一批血清对照,发现灭活与未灭活的血清还是有区别的.
我认为这个问题应该看细胞系而定,不同的细胞系可能敏感度不同,这一定要先做试验,如果嫌麻烦的话,那还是用灭活的血清保险!
一家之言!

作者: toy 时间: 2012-9-20 10:56

我觉得你的细胞不对补体敏感的话，还是不要灭活得好。对于像sp2/0细胞来说，灭不灭都没什么差别

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 10:56

请教：
我最近买的Percoll原液：比重(1.130±0.005)，PHARMACIA，北京华美生物工程公司。
1关于“Percoll储存液：Percoll原液与10倍体积PBS按体积比为9∶1的比例混合，比重调至1.123 g/ml，此液为100% Percoll”的方法是否正确？
2 你以前关于Percoll分离液的配制方法中没有1.073g/ml 这一密度的具体配制方法，能补充一下吗？
3 分离MSC操作中是否可以直接用 1.073g/ml 这一密度的Percoll 分离液，而不用其他几个密度？
4 利用25%-60%的8种剃度的Percoll分离液分离MSC操作中，干细胞层具体是哪一层？
5 25%-60%是否为25，30，35，40，45 ，50，55，60% ？
叨扰之事，不胜感激

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 10:57

sorry
补充一下配制红细胞溶解液Tris-NH4Cl的方法：
1 mol/l Tris-HCl缓冲液，0.2 ml PH 7.4
0.83%NH4Cl 9 ml
调 PH至 7.2后，加双蒸水至10 ml即为含约0.7%NH4Cl的0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.2（ 0.02mol/l Tris-NH4Cl液）。
取一定量该液加入细胞混悬液中，震荡2分钟即可溶解红细胞。

作者: yychen 时间: 2012-9-20 10:58

我正在做心肌细胞培养,想作RT-PCR,请教各位每个样品至少需要多少细胞才够用!

作者: pencil菲 时间: 2012-9-20 10:59

普通的７５ml的细胞培养瓶长满一瓶就够了．直接将TRizol加进去，消化一会，吸管吹吸几次，液体变粘就可以了，取出来，氯仿抽提，异丙醇沉淀１0min足够了．质量很好．

作者: owanaka 时间: 2012-9-20 10:59

我正在做动物外周血单核细胞培养，都是老一辈传下来的方法，我本人对外周血单核细胞培养的理论知识比较缺乏，请各路大虾指点！

作者: xingyi08 时间: 2012-9-20 11:01

请教几个配制问题：
1 一包GIBCO公司的1640，有谷胺酰胺，无NaHCO3，在配制的时候我要加几
克的（2克吗） NaHCO3才能达到合适的PH值？
2 我买的CONA (sigma)和MTT(Biomol公司）是华美公司进口分装的，无说明书，我怕配错了问大家有没有相关说明书和配制方法？
3 配制双抗时，链霉素我买的是100万单位一瓶的，而一般要求是100微克/毫
升，这之间怎么换算？可以用生理盐水配吗？
谢谢！

作者: mamamiya 时间: 2012-9-20 11:01

5%CO2时加２克NaHCO3 PH值即可达7.4,10%加3.7克NaHCO3 即可，但实际上我们在配培养基时5%CO2时加的也是3.7克NaHCO3 ，配好后用１Ｎ盐酸调整PH值即可，如果培养基偏碱可将瓶口拧松放入培养箱，如果培养箱没问题的话很快就会起到缓冲作用，对细胞没有损害。
将１００万单位链霉素溶于５ml灭菌生理盐水或hanks液中，每１０００ml培养液加0.5ml,即为终浓度１００单位/ml

作者: zhenxin 时间: 2012-9-20 11:02

建议各位战友不要使用M-Plasmocin （Invivogen），其抗支原体的作用一般，甚至不能根除，完全是代理商晶美公司的广告胡吹出来的（这是一位晶美内部员工的话）...

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-20 11:02

Ls-174T（结肠腺癌细胞）在刚买来的时候贴壁良好，仅仅轻微抱团，在传了几代冻存后复苏出来时状态还不错，但是再传几代以后细胞基本不贴壁，不铺展，只堆砌成团，胞体发黑不再清亮，在瓶底呈菌落样生长，消化时无需胰酶，轻轻吹打就下来。液中大量似碎片物质，瓶底覆一层膜，胰酶无法消化下来，显微镜下看好象是死细胞紧贴瓶壁。培养液一开始用1640+10%BS，后来改用1640+5%BS+5%FCS，无效。百思不得其解，向各位讨教。
另外，HL-60细胞也出现了问题，哪位前辈高人指点一下该如何养HL-60细胞？不胜感激！

作者: toy 时间: 2012-9-20 11:02

HL-60细胞只要用90% 1640+ 10-% FCS来养就行了...很简单的...

作者: toy 时间: 2012-9-20 11:07

到于前面的结肠癌细胞为什么是这样...首先考虑是否细胞被污染...其次培养液是否有问题...

作者: vera+ 时间: 2012-9-20 11:07

HL-60悬浮细胞，刚买来时呈单个分布，传了几代后也是严重抱团，用胰酶消化吹打使其分散，但养了几天以后又抱在一起，头痛啊！

作者: cj_mondy 时间: 2012-9-20 11:08

注意接种浓度不要太高....另外要及时传代....至少我养HL-60一直都能让它保持单细胞状态生长.......

作者: avi317 时间: 2012-9-20 11:13

我最近买的Percoll原液：比重(1.130±0.005)，PHARMACIA，北京华美生物工程公司。
1关于“Percoll储存液：Percoll原液与10倍体积PBS按体积比为9∶1的比例混合，比重调至1.123 g/ml，此液为100% Percoll”的方法是否正确？
2 你以前关于Percoll分离液的配制方法中没有1.073g/ml 这一密度的具体配制方法，能补充一下吗？
3 分离MSC操作中是否可以直接用 1.073g/ml 这一密度的Percoll 分离液，而不用其他几个密度？
4 利用25%-60%的8种剃度的Percoll分离液分离MSC操作中，干细胞层具体是哪一层？
5 25%-60%是否为25，30，35，40，45 ，50，55，60% ？
叨扰之事，不胜感激

回复如下：：：
实际上Percoll分离液的配制的梯度(百分比)是可以根据你的实验特殊需要而自己设定合适的梯度的.小心加入各层分离液.离心洗涤就可.
参照STANDDARD的Percoll分离液的配制方法:
用PBS配制25%~60%浓度的8个浓度梯度液体，按比重大小由大到小依次加入50ml离心管中，再把混匀的细胞小心在加在最上层。在4度下以15000rpm离心20分钟仔细吸取干细胞层的细胞，尽量不要吸到红细胞，加入离心管，
用PBS洗涤，1500转，离心10分钟，重复三次。计数并以培养液混悬细胞后加入塑料培养瓶中。一般培养几天（大鼠8天，人10天）后细胞铺满瓶底。
此为不连续Percoll密度梯度离心.

而可用9份Percoll原液与1份1.5mol/LNaCl溶液混合.取此液70.14ml,加0.15mol/LNaCl溶至100ml.此Percoll应用液密度是1.073g/ml.随后加入此液到离心管,高速离心20MIN形成梯度管.其后,小心加入细胞悬液于Percoll梯度之上,低速离心15MIN.完毕,吸取表面3-4cm厚的液体,从上到下分部收集,每分部收集液体1ml,各分部用3-5倍的PAS洗涤3次,取样分类记数即可.此为连续Percoll密度梯度离心.
而(1)中的方法好象是加细胞悬液到1.073Percoll分离液900g离心30MIN就可.随后收集.洗涤!!

你可以试试!!

请参看我:
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=10484&pg=6&h=1&bpg=1&age=0')

尤其这篇文献!!
(1)Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.
J Cell Physiol. 1998 Jul;176(1):57-66.

作者: dog002 时间: 2012-9-20 11:14

我上个学期做了一些RPE的培养，最近有位战友跟我问起有关方面的方法，贴在这里一起看吧，不对的地方欢迎指正。一点自己的体会
我采用的是消化法，附件里有一篇参考文献，培养基基采用DMEM/F12培养基，血清用国产胎牛就行，（当然也用过进口的，好像更好，生长快一些）浓度5~10%都行。消化酶只用0.25%胰蛋白酶就行了，37C半个小时就够了。
具体步骤如下：
1.在超净台操作。整眼球或角膜移植术后剩余的眼球，沿角巩膜缘环形剪开，小心除去眼前段组织，玻璃体及视网膜，要轻柔操作以免造成脉络膜脱离导致失败；
2.PBS漂洗三四次，加入0.25%胰蛋白酶至杯沿下1mm处，放入37C培养箱消化30分钟左右；
3.小心吸掉消化液，加入适量含10%FBS的DMEM/F12培养基，轻轻吹打周壁使RPE脱落，收集细胞悬液放入50ml培养瓶，反复三四次共得到5ml悬液，就可以放入培养箱培养了，此时在倒置显微镜下可以看到大量充满色素颗粒的圆形RPE细胞，有的为单个细胞，有的为细胞团；
4.两天后在取出观察，根据培养基颜色变化（代表酸碱度），在3~5天后换液，一般在第3天后就会看到细胞贴壁，变成扁平的梭形，一般只有两个伪足，细胞核清晰可见，细胞浆中含有丰富色素颗粒；
5.在7天左右就会见到细胞旺盛分裂，10天左右就可以首次传代了，一般传代后四五天就会长满，需要再次传；在第9~10代以前的细胞形态和生长特点比较均匀，都可以用来做研究。
6.细胞暂时不用的可以冻存起来，用时再复苏，方法书上有，就不多说废话了。

作者: pencil菲 时间: 2012-9-20 11:16

这儿做肝细胞培养的比较多了，我想问一下：肝细胞检测一般常用那些方法？
作培养的园友能不能排张照片看一下。另外小鼠肝细胞系一般在那儿能买的到？

作者: HP007 时间: 2012-9-20 11:17

不知各位有没有一些关于买标准品的信息。我想买大蒜素和红花黄色素的标准品，但是找了2个星期还找不到，丁香园上介绍的方法也试过了，还是没有，急死了......

作者: gmjghh 时间: 2012-9-20 11:18

请问各位老师：MTT法测定的时候，受试药用PBS来配制还是用培养液配制较好？

作者: yysr238 时间: 2012-9-20 11:18

建议大家不要上当，bluemoon不是科研人员，是试剂商，所谓的PAA实验室只不过是他们经理杜撰的而已，不存在的，他推荐的东西我们所有人买过，还向我抱怨过，－－－可以一眼认出是假货，诸位不信可以试试。

建议删帖，不能给这些骗子留可乘之机。

作者: is2011 时间: 2012-9-20 11:19

MTT溶液配制：称取250mg MTT ，放入小烧杯中，加 50 ml PBS（0.01mol/l，ph7.4）
在磁力搅拌器上搅拌30 min，用0.22um的微孔滤膜除菌，分装，4。c保存。两周有效。
药物最好用PBS 配制，以免不必要的干扰！也是先配储液，除菌同上，

作者: TAT 时间: 2012-9-20 11:20

请问：
1 MTT法时，我的测定药物如阿莫西林是粉剂时，我用三蒸水，PBS,培养液中的哪一种配制效果比较好？对实验影响小。
2 改良的MTT中加入的是三联溶液（10%SDS，5%异丁醇，0 .12mmol/l HCl（w/v/v））100ul/，）请问这个溶液中具体的配方是？
谢谢大家！

作者: TNT 时间: 2012-9-20 11:23

进口培养瓶下酸会使表面薄膜脱落，不好
紫外灯照30分钟不够，要2~4小时。
没污染可说明你本事大

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 11:41

好，MTT法的关键是必须了解受试细胞MTT结晶还原产物（formazan）吸光值的大小与细胞数量之间的线性关系范围，选择适当的接种密度及细胞培养时间。因此，在进行MTT实验之前，应测受试细胞的贴壁率、倍增时间、不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时细胞不致过满，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
粉剂用PBS配最好，因为任何有蛋白或酚红的溶液都可影响结果。
下面是我曾经做的MTT，仅供参考：
1 MSC 1×105 ,100ul接种96孔板
2 测前4h，更换无血清培养液，同时加入20ul/孔 MTT液（5 mg/ml），37 0c，5%co2，4h
3 吸取上清，加入150 ul DMSO ，震荡15 min
4 37 0c，5%co2，4h（此时间应根据具体的颜色反映来定）
5 490 nm 测OD 值

作者: yes4 时间: 2012-9-20 11:42

TT溶液配制：称取250mg MTT ，放入小烧杯中，加 50 ml PBS（0.01mol/l，ph7.4）
在磁力搅拌器上搅拌30 min，用0.22um的微孔滤膜除菌，分装，4。c保存。两周有效。
药物最好用PBS 配制，以免不必要的干扰！也是先配储液，除菌同上，

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MTT溶液配好后好像应该避光保存，方法是用锡纸或黑色塑料包裹，为了避免配制过多浪费（两周内有效），我们一般每次只配2~5ml就够了，用量可以自己计算。

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 11:42

用作间充质干细胞分离的分离介质：PERCOLL液
具体配制方法，见cuturl('http://www.cellseparation.nu/media/18-1115-69AC.pdf')

作者: KGZ564 时间: 2012-9-20 11:43

看看这个细胞培养操作手册站点，当然还有很多其他宝贝，

cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Cell_Culture/Cell_Culture_Techniques_120.html#Basic')

作者: ffooll 时间: 2012-9-20 11:53

我最喜欢干大事可是对细胞却素手无策，请个位前辈指教一些基本操做的心得体会
如消化，吹打。能够的到大家的指教非常荣幸。
谢谢

作者: guagua 时间: 2012-9-20 11:56

这位朋友可以到我们的细胞培养专区看看，保证会有很大的收获，有些可是书上也找不到的呀！

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 11:56

各位大虾，请教一下流式细胞术鉴定大鼠骨髓间充质干细胞的金标准？
谢谢

作者: ha111 时间: 2012-9-20 11:57

最近我在养人脐静脉内皮细胞，文献上说内皮细胞贴壁后曾梭形，可是我的细胞有好多是圆形，是不是细胞活性的问题，请各位专家传授经验。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-20 11:58

请教一个问题，MTT法可用酸性SDS溶解，请问酸性SDS的具体配方是？有没有更多溶解液的配方？
谢谢！

作者: 04906 时间: 2012-9-20 11:58

293细胞是一种贴壁不是很好的细胞，在培养换代时，不必用胰酶消化，只用吸管吹打就能使其从培养瓶上脱落。另外，在换培养液时，要沿瓶壁缓慢流下，不可用力太大。正如大家所说，293细胞的代数对细胞质量影响也很大，一般我们拿到手的细胞已经是25代左右，建议大家传代最好不要超过30代。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-20 12:40

国内的293在30代以内的较少，包括ATCC来源的，早代次的293有加拿大的一个公司提供，是由腺病毒载体的权威Graham FL早期冻存的。

作者: okhaha 时间: 2012-9-20 12:45

最近我在养人脐静脉内皮细胞，文献上说内皮细胞贴壁后曾梭形，可是我的细胞有好多是圆形，是不是细胞活性的问题，请各位专家传授经验。
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你好
我最近也要养内皮细胞，不知你是用的什么培养基，不过我养的是猪的主动脉内皮，希望能交流经验。

细胞培养专区的各位高手，不知大家有没有养内皮细胞的经验，洗耳恭听
还有，如果要测细胞毒作用，是用MTT，或是测LDH活性，还是用Cr51啊，我看国外的文献大多是后者，给点建议

作者: wood533 时间: 2012-9-20 12:45

有没有人在做成骨细胞培养啊？？
俺有问题请教啊。
请问出于矿化期的细胞传代后仍是处于矿化期吗？还是原始状态？

作者: yysr238 时间: 2012-9-20 12:46

内皮细胞在密度较低时其外形与成纤维细胞不好区分。一般认为细胞汇合时才会显示出鹅卵石样形状。除了培养时的细胞密度影响细胞外形，我在实验中还观察到培养的时间也对外形有影响。经过转染且用抗性筛选后形成的克隆细胞的形状与教科书上画的形状差不多（可呈现典型的多角型），但这些克隆细胞继续培养后形状又变得不太规则。你培养的细胞圆形是否为细胞虽贴壁但尚未伸展，不太好判断，因为不知此时细胞接种后多常时间。

内皮细胞多用M199培养基，血清要好，有条件加一些生长因子。

国外的文献大多是用Cr51，因为老外比较信放射性标记。有条件就用此方法。

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 12:47

你好，根据我的经验，人脐静脉内皮细胞应该呈铺路石样（见附件），至于细胞活性的问题可以做简单的Trypan-blue exclusive test 就可以判定。

作者: bananapeople 时间: 2012-9-20 12:48

请帮助我！
我所养的草鱼吻端上皮细胞最近出了个怪问题！由于前段时间贴壁效果不好，我用0.2％明胶处理了细胞瓶，长势还行，可是总会有一两瓶在第三天左右出现培养液混浊现象，仔细观察，感觉不像污染，而贴壁处的细胞瓶壁上似乎有一层乳白色油膜被牵动着要掉下来似的，仔细寻思，明胶高压灭菌，操作也应该没有问题，刚开始出现这种现象时，我把无菌室彻底清洁了一遍，所有物品重新灭菌，但现在仍旧有这种现象，请有经验的朋友们帮我分析分析，好吗？
谢谢！

作者: utt0989 时间: 2012-9-20 12:48

SDS配方:20%SDS加50%DMF,如20克的SDS加入100ml含50%DMF的溶液中.

作者: daod 时间: 2012-9-20 12:49

十万火急！我要养A293细胞系，文献说该细胞可以在ATCC买到，现在联系后没有回音。请问你们在哪个公司买的，价位大概是多少。
先谢谢各位了。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-9-20 12:49

有养破骨细胞的吗，愿意和其交流。

作者: vera+ 时间: 2012-9-20 13:49

我用0.05%的胰酶消化293细胞，吹打之后只有很少的单细胞，基本上都是几个细胞聚集在一起的细胞团，请问有什么好方法可以将293细胞弄成单细胞悬液？

作者: kulee 时间: 2012-9-20 13:49

我的培养液用了15mM Hepes,3.4g/l NaHCO3,DMEM,结果配出来的培养液很奇怪,加血清后还可以,pH7.1左右,可是在CO2里放一段时间后变碱了,7.6左右,不知什么原因,怎么解决?原来从来没有出现这种情况!

作者: milkdog 时间: 2012-9-20 13:49

看外文细胞培养protocol时，passage,seed 和confluent几个细胞培养名词意思似懂非懂，请大家帮忙指点。谢谢先！

作者: 2541 时间: 2012-9-20 13:50

293细胞消化时容易聚集成团，确实是个恼人的问题。今天实验时无意中发现了一个比较好的方法。首先用EDTA 过一遍，也就2～3秒时间，然后吸出所有EDTA，用胰酶正常消化。此时消化时间较只用胰酶消化短一些，但细胞基本能分散开，一般2～3细胞在一起。

作者: 2541 时间: 2012-9-20 13:50

passage，指传代，名词理解代.一般认为消化分瓶为一代。
seed；指细胞接种。
confluent：指细胞汇合，即细胞生长一段时间后，细胞与细胞之间没有肉眼可见的间隙。

作者: toy 时间: 2012-9-20 13:51

谢谢各位的指导，原以为看看参考文献就可以做了，没想到还有这么多的奥妙，我的那些比较圆的细胞一般都会脱落死亡，可能还是活性差的原因，不知大家是否认同。怎样才能避免？

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 14:25

看外文细胞培养protocol时，passage,seed 和confluent几个细胞培养名词意思似懂非懂，请大家帮忙指点。谢谢先！

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补充一下
confluent 是指细胞融汇程度，如80%confluent 意思是细胞生长至培养介质的80%，一般此时细胞都达对数生长期，可以进行细胞活力、增殖等评价

作者: 大白菜 时间: 2012-9-20 17:00

谢谢各位的指导，原以为看看参考文献就可以做了，没想到还有这么多的奥妙，我的那些比较圆的细胞一般都会脱落死亡，可能还是活性差的原因，不知大家是否认同。怎样才能避免？

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可能性很大。我当初也遇到过此问题，后来增加血清浓度后就好了。原代接种时可以增加血清浓度，待到传代后此时细胞的适应性增加，可以考虑将血清浓度稍微降低。

作者: toy 时间: 2012-9-20 17:00

感谢哪位朋友谈一下换液时的心得体会?比如你用培养板或培养皿养细胞时,先吸掉1/3左右液体,应该在何处吸比较好?加新液体进去,又该在圆孔的何处加比较好?谢谢!

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在无菌操作的情况下,可适当倾斜培养板或培养皿,用枪尖或吸引器缓慢吸去原培养液.在加新培养液时,可将培养液先打在孔壁,让它缓慢流下.注意不可用力太大,尤其是那些俯壁不好的细胞.另外,也要注意无菌操作,避免污染.

作者: guagua 时间: 2012-9-20 17:02

继续请教热心者&高手一问题：

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我辛辛苦苦养了好长时间的Sp2/0一夜之间全长霉菌，好心痛。请教了许多人，都说没法！不知道大家有什么诀窍如何防止霉菌，是否可加些格外的抗菌素或者什么特别的培养基？

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-20 17:02

霉菌一旦污染，很难杀灭。必须严格控制，以防从培养瓶中扩散到培养箱和环境中。酒精对其无杀灭作用。

作者: windy+++ 时间: 2012-9-20 17:02

我想大蒜注射液或者大蒜素对霉菌的效果因该不错

作者: sunnyB 时间: 2012-9-20 17:03

防止霉菌，可以加两性霉素，sigma有卖，好像200元左右。很多文献上也可查到。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-9-20 17:05

制霉菌素 Nystatin
抑制细胞培养后霉菌的产生

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:06

万分感谢你的帮助，再问个简单问题，因没养过EC ，不知道你发过来的图片里是什么染色，是鉴别EC的 vIII 吗？

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你好，图片里的EC PICTURE 是vIII 因子相关抗原免疫组化染色，可以作为鉴别EC 用

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:08

霉菌污染和许多因素有关，根据我的经验应该预防为主，注意：
1 一般在培养液里常规加两性霉素B，效果不错，
2 取材和传代最好选择适宜的天气，因为阴暗潮湿的天气易长霉菌，当然如果细胞培养
室本身就是百万粒级的就不存在这个问题，
3 在拿取培养瓶和孔板过程中应常规用75%酒精棉球进行擦拭消毒。

作者: jujuba 时间: 2012-9-20 17:13

请教大家：
我在从脾细胞悬液中破渗红细胞的时候的时候，加完破渗液吹打1分钟，然后离心约5分钟，后来发现离心后都成为絮状物质，只有很少的细胞，不知道是不是因为破渗时间太长还是转速太大，还是别的原因，在破渗后离心的时候是不是应该加点培养基或别的，阻止细胞继续被破渗？请大家指教在裂解红细胞的时候应该注意的问题。
谢谢！

作者: langlang 时间: 2012-9-20 17:13

霉菌污染和许多因素有关，根据我的经验应该预防为主，注意：
1 一般在培养液里常规加两性霉素B，效果不错，
2 取材和传代最好选择适宜的天气，因为阴暗潮湿的天气易长霉菌，当然如果细胞培养
室本身就是百万粒级的就不存在这个问题，
3 在拿取培养瓶和孔板过程中应常规用75%酒精棉球进行擦拭消毒。

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感谢您的热心和详尽的回答！想请教进一步：两性霉素B的常规浓度？这种浓度影响细胞生长吗？

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:14

QUOTE:

原帖由 langlang 于 2012-9-20 17:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
霉菌污染和许多因素有关，根据我的经验应该预防为主，注意：
1 一般在培养液里常规加两性霉素B，效果不错，
2 取材和传代最好选择适宜的天气，因为阴暗潮湿的天气易长霉菌，当然如果细胞培养
室本身就是百万粒级的就不存在这 ...

两性霉素B的常规浓度是2ug/ml,Sigma 有售，另外也可用制霉菌素（25ug/ml）。一般不会影响细胞生长，

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:14

我的培养方法
材料：
1．动物：新生新西兰大白兔
2．药品及试剂： α－MEM 培养基(Gibco产品)，新生胎牛血清(Gibco生产)，1,25（OH）2D3（Sigma产品），羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）（Roch产品），青霉素－链霉素 (Gibco产品),甲苯胺蓝，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）检测盒。3．主要仪器：锯式切片机、CO2培养箱、倒置相差显微镜、普通光学显微镜、台式高速离心机、深低温冰箱、除菌过滤器、显微外科手术器械、96孔培养板等
方法：
1．骨磨片的制备：将新鲜牛股骨用锯式切片机将皮质骨切成6×6mm厚约40um的小片，将骨磨片至蒸馏水中，超声清洗3次，自然晾干，紫外线照射消毒（254 nm ,20 min）后置4˚C冰箱内备用。分离OC前，取出骨片，浸泡于含抗生素（青霉素1000u/ml，链霉素1000ug/ml）的α－MEM 培养液中，换液三次，每次20分钟。
2．OC的分离：将新生兔断颈处死，75%乙醇浸泡5min，无菌条件下取四肢长骨，在Hans 平衡盐溶液中去净附着在骨表面的软组织及软骨骺，用α－MEM培养液清洗骨干2次，然后在α－MEM全培养液（含15％胎牛血清，青霉素100U／ml，链霉素100ug/ml，25mM HEPES，PH7.0~7.2）内，将骨干纵行刨开，轻刮骨的髓腔至颜色变白，用尖吸管(5ml空针25号针头)吸取培养液反复冲洗髓腔面，收集冲洗液，用筛网过滤，去掉骨片， 1000rpm离心5 min，沉淀物加20ml培养液悬浮，血细胞计数器计数，使悬液含1×107／ml，接种96孔板，80分钟第一次换液，以后每3天换液。

我的体外分离培养破骨细胞成功的主要体会为：应用出生24小时内的动物，幼稚的破骨细胞容易成活；动物处死后分离速度要快，否则破骨细胞易受损伤；严格无菌操作，以防污染；骨片、盖玻片临用前在培养液中预孵育；在培养过程中，破骨细胞贴壁速度较其它细胞快，要得到相对纯度较高的破骨细胞，在细胞悬液加入培养板培养80分钟后，用a-MEM将未贴壁或贴壁不牢的其它细胞冲洗掉，才可得到纯度较高的破骨细胞[7]；细胞悬液加入培养板40分钟内破骨细胞贴壁时间段内要静置培养，不要晃动培养板从而影响破骨细胞贴壁

作者: dog002 时间: 2012-9-20 17:15

我还想请教一个问题：最近采集腹腔巨噬细胞做饲养细胞，腹腔中的脂肪组织老是堵针头（10ml注射器），回抽一点就出问题，不知道大家有什么心得体会？非常感谢你们的建议。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-20 17:24

，我的论文已完成，采用的方法与你类似，直接分离新生新西兰兔的破骨细胞，与你的区别是：
1.培养液用的是M199，老外大多用的是α－MEM ，因为破骨细胞对营养要求高，用MEM差些。我现在的诱导都是用Hyclone的α－MEM 。
2.我贴壁时间是3小时，若只用于TRAP染色，贴壁30分钟。
3.骨片我直接沉淀，不用筛网。
目前我诱导的基本方法是：首先消化新生小鼠颅骨得到成骨细胞，培养2天后加入8周小鼠骨髓细胞，VitD3浓度为5×10-8 M，但效果不行。国内诱导以北京大学口腔医学院于世凤老师那儿较多，我曾经给日本的Udagawa写了封信，他的方法我已经采用，他说北大口腔的李小同（音译）在日本工作2年，让我请教他。

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:29

你好，我的论文已完成，采用的方法与你类似，直接分离新生新西兰兔的破骨细胞，与你的区别是：
1.培养液用的是M199，老外大多用的是α－MEM ，因为破骨细胞对营养要求高，用MEM差些。我现在的诱导都是用Hyclone的α－MEM 。
2.我贴壁时间是3小时，若只用于TRAP染色，贴壁30分钟。
3.骨片我直接沉淀，不用筛网。
目前我诱导的基本方法是：首先消化新生小鼠颅骨得到成骨细胞，培养2天后加入8周小鼠骨髓细胞，VitD3浓度为5×10-8 M，但效果不行。国内诱导以北京大学口腔医学院于世凤老师那儿较多，我曾经给日本的Udagawa写了封信，他的方法我已经采用，他说北大口腔的李小同（音译）在日本工作2年，让我请教他。

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关于日本研究者的方法，更偏重于凝胶纯化法，总结如下：（请见附件）
我由于很难购买到bacterial collagenase 和 cell matrix type I-A 两种试剂，就没有采用这种方法，不过这种方法可以得到1*104的纯破骨细胞，还是值得推崇的

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:29

另外，请教各位战友bacterial collagenase 和 cell matrix type I-A 两种试剂哪里能买到？谢谢

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-20 17:29

你好，我在复旦大学骨代谢研究室学习时，那儿的高建军老师曾经做过凝胶纯化，他讲非常难做，这篇文章请见附件。
直接分离，或者再加上凝胶纯化，都是分离的成熟破骨细胞；采用骨髓细胞、脾细胞或外周血单核细胞诱导形成破骨细胞，可以观察对它发育的影响，尤其是OPG、OPGL、RANK的发现，目前这方面的文章很多，我在pubmed上已检索到超过400篇，全文也有100多篇，你若需要，我很乐意奉送。

作者: idea2011 时间: 2012-9-20 17:30

你好，很羡慕你能到复旦大学王洪复老师的骨代谢研究室学习，相比之下我就比较寒酸了，我基本上是自己摸索的方法，所以结果就一般。
我自己积累的文章不太多，所以希望你能慷慨解囊，先谢过了。
最近我也查到一些有关OC 培养的信息，几个公司的产品介绍中利用OC CULTURE KIT 可以得到大量TRAP+的OC样细胞（见邮件附件），不知你看过没有。

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-21 12:25

那篇文章已看到，文章的方法与国外文献的相同，这个方法国外已成熟，但国内还未做，可以尝试，也可以不购买试剂盒，自己做，我看到sigma公司有RANKL，只是较贵。在邮件中我给你了一篇关于用M-CSF 、RANKL诱导的文章。
我目前采用消化小鼠成骨和骨髓细胞共培养诱导的方法，步骤如下，只是结果不理想。
1.无菌条件下揭去新生小鼠的头皮，将其头盖骨取下，在Hanks液中去除表面软组织，用剪刀剪成约1×1mm大小，在0.1％胶原酶中37℃消化20分钟，弃去上清，再在0.1％胶原酶中37℃消化90分钟，将含细胞的消化液在1000r/min离心5分钟，吸去上清，沉淀的细胞团用α-MEM制成细胞悬液，按1×104/cm2接种于培养板中。
2.将6-8周雄性小鼠拉断颈椎处死，75％乙醇中浸泡5分钟消毒。
3.无菌条件下取其胫骨，去除表面软组织。将胫骨两端以剪刀去除，在骨的一端以25G注射针头以1mlα-MEM缓慢注射冲洗骨髓腔，离心管收集骨髓细胞。
4.以α-MEM洗两次，即1000转/分钟离心5分钟共2次，以含10％胎牛血清、10-8 M 1α,25-(OH)2 D3的α-MEM在预先接种成骨细胞的培养板中培养，骨髓细胞数目为5×105/cm2
这种方法我还在摸索。
下图是我直接分离兔破骨细胞的TRAP染色

[ 本帖最后由 yapuyapu 于 2012-9-21 12:26 编辑 ]

图片附件: 127193-cell1200-embed.JPG (2012-9-21 12:26, 17.32 KB) / 该附件被下载次数 29
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13874

作者: 00无名指00 时间: 2012-9-21 12:27

看了楼上两位的帖子后，受益非浅。我刚开始做，用的是新生的SD大鼠的成骨细胞和一月龄的SD大鼠的骨髓细胞一起培养，加1，25-vitD3，培养基是DMEM，不成功。想问：骨髓细胞取材时要不要加淋巴细胞分离液取界面层的基质细胞？培养液是不是要加HEPES？你们的文章能否发给我一些，我想要有关骨髓长时间培养诱导分化形成破骨细胞的方法的文章。谢谢！

作者: dotaaa 时间: 2012-9-21 12:29

你好，诱导培养我还未成功，希望能共同探讨，和你探讨几个问题：
1.培养基绝大多数文献都是采用α-MEM，因此我也采用，原因前面我已谈到，破骨细胞对营养要求高，α-MEM和其他MEM系列培养基的区别是含有脱氧核甘酸，且氨基酸含量多。
2.加淋巴细胞分离液（F－H）分离的目的应该是提纯骨髓中的单个核细胞，然后和成骨细胞或骨髓基质细胞共培养，我给日本的Udagawa写信，他们不分离，其实Udagawa开始（1988年）就是取骨髓细胞加Vit D3培养，不另加成骨细胞或骨髓基质细胞，因为骨髓中就含有基质细胞。
3. HEPES我想应该可以加，因为它不影响细胞生长。
文章请见附件，较早的没有电子全文，我给你出处，你在图书馆找一下，如果实在找不到，我扫描了给你。
J Clin Invest 1986 Oct;78(4):894-8
Endocrinology 1987 Jun;120:2326-33
Endocrinology 1988 Apr;122(4):1373-82

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 12:32

那篇文章已看到，文章的方法与国外文献的相同，这个方法国外已成熟，但国内还未做，可以尝试，也可以不购买试剂盒，自己做，我看到sigma公司有RANKL，只是较贵。在邮件中我给你了一篇关于用M-CSF 、RANKL诱导的文章。
我目前采用消化小鼠成骨和骨髓细胞共培养诱导的方法，步骤如下，只是结果不理想。
1.无菌条件下揭去新生小鼠的头皮，将其头盖骨取下，在Hanks液中去除表面软组织，用剪刀剪成约1×1mm大小，在0.1％胶原酶中37℃消化20分钟，弃去上清，再在0.1％胶原酶中37℃消化90分钟，将含细胞的消化液在1000r/min离心5分钟，吸去上清，沉淀的细胞团用α-MEM制成细胞悬液，按1×104/cm2接种于培养板中。
2.将6-8周雄性小鼠拉断颈椎处死，75％乙醇中浸泡5分钟消毒。
3.无菌条件下取其胫骨，去除表面软组织。将胫骨两端以剪刀去除，在骨的一端以25G注射针头以1mlα-MEM缓慢注射冲洗骨髓腔，离心管收集骨髓细胞。
4.以α-MEM洗两次，即1000转/分钟离心5分钟共2次，以含10％胎牛血清、10-8 M 1α,25-(OH)2 D3的α-MEM在预先接种成骨细胞的培养板中培养，骨髓细胞数目为5×105/cm2
这种方法我还在摸索。
下图是我直接分离兔破骨细胞的TRAP染色

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谢谢你的文章，你的图片不错嘛
你现在做的方法应该是叫“骨髓诱导培养法”吧，试试加一点DEX（100nM)，看看效果如何

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 12:32

看了楼上两位的帖子后，受益非浅。我刚开始做，用的是新生的SD大鼠的成骨细胞和一月龄的SD大鼠的骨髓细胞一起培养，加1，25-vitD3，培养基是DMEM，不成功。想问：骨髓细胞取材时要不要加淋巴细胞分离液取界面层的基质细胞？培养液是不是要加HEPES？你们的文章能否发给我一些，我想要有关骨髓长时间培养诱导分化形成破骨细胞的方法的文章。谢谢！

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你好，加HEPES的目的主要是为了稳定PH值，让OC 能有一个偏酸的环境（6.8-7.0），
所以在配培养液的时候最好将PH调至上述水平。

作者: pencil菲 时间: 2012-9-21 12:33

文章已收到，非常感谢两位的帮助。我准备在培养液中加入HEPES和DEX试试看。另外，我有一瓶用L-DMEM培养的取材时没有加分离液的骨髓细胞，现在有两种形态的细胞，一种象豆芽形状，一种象球形，奇怪的是这两种细胞既不长也不死。整整快一个月了。天天看它的数目和形状都不变。两位有什么看法？

作者: HPLC使者 时间: 2012-9-21 12:33

我想问一下用腺病毒做载体与用逆转录病毒做载体有何不同，两者各有何优缺点，我初涉分子生物学，对这些看不懂，请您指教！
另外，我要将一基因转染给哺乳动物CD4＋T细胞，然后过继转移给动物，观察转染此基因的细胞对动物疾病的影响，我差的文献Science上用的是MIGR1 retrovirus vector，不知这载体有何特点，有没有卖的，您能提供些帮助吗？
先谢谢了

作者: KGZ564 时间: 2012-9-21 12:34

请教高手：
我买的CALTAG 公司的单抗：鼠抗人cd28，catlog no：MHCCD2800 克隆号：15E8(CLR-402).鼠抗人cd3：The catlog no.is MHCCD0300 and 克隆号： S4.1(706）
这两种抗体能不能做淋巴细胞培养的联合刺激剂？我用了，淋巴细胞就是不长，有什么办法？还有，淋巴细胞分离时有大量的血小板混入，怎么解决？
谢了！

我看过这方面资料，这两种抗体可以做淋巴细胞的联合刺激剂，不过是CD4+ T细胞的，我不清楚对其它细胞是否也可以。不知你养的什么细胞，我也要做淋巴细胞培养，有什么经验我们可以相互交流交流。

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 12:35

我想问一下用腺病毒做载体与用逆转录病毒做载体有何不同，两者各有何优缺点，我初涉分子生物学，对这些看不懂，请您指教！
另外，我要将一基因转染给哺乳动物CD4＋T细胞，然后过继转移给动物，观察转染此基因的细胞对动物疾病的影响，我差的文献Science上用的是MIGR1 retrovirus vector，不知这载体有何特点，有没有卖的，您能提供些帮助吗？
先谢谢了

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腺病毒载体与逆转录病毒的区别很多，最大的区别就是腺病毒不整合基因组，而逆转录病毒整合。所以，对于需要长期表达的情况，用逆转录病毒好，对于瞬时表达，用腺病毒好。

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-21 12:36

你现在骨髓诱导做到那一步了？我加过DEX，效果不明显，还是没有破骨细胞生成。我在重点做诱导，我用的是sigma的Vit D3，我看到有人用酒精溶解，VitD3应该是脂溶性的，而我当时用培养液溶解的，会不会没有溶解下来。
关于加DEX，骨髓细胞可能不需要，文献上有矛盾，但用脾细胞诱导大多数加。
你诱导培养液PH值调多少？能把具体方法说一下吗？

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-21 12:36

请教高手：
我买的CALTAG 公司的单抗：鼠抗人cd28，catlog no：MHCCD2800 克隆号：15E8(CLR-402).鼠抗人cd3：The catlog no.is MHCCD0300 and 克隆号： S4.1(706）
这两种抗体能不能做淋巴细胞培养的联合刺激剂？我用了，淋巴细胞就是不长，有什么办法？还有，淋巴细胞分离时有大量的血小板混入，怎么解决？
谢了！

我看过这方面资料，这两种抗体可以做淋巴细胞的联合刺激剂，不过是CD4+ T细胞的，我不清楚对其它细胞是否也可以。不知你养的什么细胞，我也要做淋巴细胞培养，有什么经验我们可以相互交流交流。

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刺激淋巴细胞生长可以用IL-2或PHA等...效果很好...

作者: guagua 时间: 2012-9-21 12:37

我自己找到裂解红细胞的具体方法了：
1，蒸馏水低渗溶解红细胞：在沉淀细胞中加入1毫升三蒸水，轻摇20秒，然后加等量1.8%的氯化钠溶液调至等渗，在加足量Hanks液混匀，离心（200g,10min) 洗涤。
2在沉淀细胞中加入1毫升Gey液（含0.7%NH4CL的Tris-HCl缓冲液，PH7.2),振摇两分钟，残留红细胞溶解后，再在加足量Hanks液混匀，离心（200g,10min) 洗涤。然后将细胞悬液过玻璃面柱去除死亡细胞和细胞碎片，离心（200g,10min) 沉淀细胞，以含5%的FCS的培养液洗涤，离心（200g,10min) 两次后，配成所需密度的细胞悬液。

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 12:37

你现在骨髓诱导做到那一步了？我加过DEX，效果不明显，还是没有破骨细胞生成。我在重点做诱导，我用的是sigma的Vit D3，我看到有人用酒精溶解，VitD3应该是脂溶性的，而我当时用培养液溶解的，会不会没有溶解下来。
关于加DEX，骨髓细胞可能不需要，文献上有矛盾，但用脾细胞诱导大多数加。
你诱导培养液PH值调多少？能把具体方法说一下吗？

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我的方法前面已提过，VitD3是脂溶性的维生素，而你用用培养液溶解是不妥的，应该用无水乙醇溶解，配制成10-5M 的储存液，用时1ul 加入1ML培养液成 10-8 M工作液。加DEX100nM是需要的，可以增加OC的数量。诱导培养液PH值调至7.0较好。

作者: owanaka 时间: 2012-9-21 12:38

最近我养的COS-7细胞出了怪事:细胞瓶底出现了很多黑喳喳,高倍镜下又看不见它在动,好象是细胞的排泄物似的,牢牢的粘在瓶底.细胞的生长似乎不受影响.D液洗不掉,传代去不掉,培养液又不混浊.不太象是污染或着黑胶虫.这样的细胞怎么办?还能要吗?作转染行吗?急!!

作者: moonlight45 时间: 2012-9-21 12:38

我还想请教一个问题：最近采集腹腔巨噬细胞做饲养细胞，腹腔中的脂肪组织老是堵针头（10ml注射器），回抽一点就出问题，不知道大家有什么心得体会？非常感谢你们的建议。
1 首先是手法，注意抽一下不行，就转动针头方向。最好把针头面朝向腹壁。如果有困难，可以把外面皮肤剪开一块。用小镊子夹起腹壁肌肉，进针。
2 如果还用难度，可以先往腹腔内注射培养基或缓冲溶液，（多少都可），抽出后离心富集即可

作者: moonlight45 时间: 2012-9-21 12:39

我的培养液用了15mM Hepes,3.4g/l NaHCO3,DMEM,结果配出来的培养液很奇怪,加血清后还可以,pH7.1左右,可是在CO2里放一段时间后变碱了,7.6左右,不知什么原因,怎么解决?原来从来没有出现这种情况!

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是不是你的二氧化碳浓度有问题？建议检查一下培养箱

作者: fsdd817 时间: 2012-9-21 12:40

最近我养的COS-7细胞出了怪事:细胞瓶底出现了很多黑喳喳,高倍镜下又看不见它在动,好象是细胞的排泄物似的,牢牢的粘在瓶底.细胞的生长似乎不受影响.D液洗不掉,传代去不掉,培养液又不混浊.不太象是污染或着黑胶虫.这样的细胞怎么办?还能要吗?作转染行吗?急!!

我现在也在养COS细胞.我考虑,如果你的细胞形态是正常的,俯壁良好,而且培养基是清亮的,那么我考虑你说的这种黑喳喳多半是培养基里的东西,我想绝对不会是细胞的代谢产物.你可以取培养基在显微镜下看看,是否还有这些黑喳喳,或者更换另外一瓶培养基.其实只要细胞的形态,俯壁均正常的话,我建议你继续用这些细胞做转染.以上仅供参考,若有其他情况可以在发贴讨论.

作者: ritou1985 时间: 2012-9-21 12:42

胞瓶底出现了很多黑喳喳,高倍镜下又看不见它在动,好象是细胞的排泄物似的,牢牢的粘在瓶底.细胞的生长似乎不受影响.D液洗不掉,传代去不掉,培养液又不混浊

Reply:

如排除瓶底的污物等原因，这可能就是细胞污染的前兆。因为有抗生素的原因可以没有明显的混浊。

建议用高浓度的抗菌素、两性霉素冲洗三天。如俯壁良好,而且培养基是清亮的,可扩增培养。

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-21 14:08

你好，看来我以前VitD3溶解的有问题，我曾经看到一篇文献用酒精溶解，就怀疑我当时溶解的不对。sigma的说明书也太简单。
另外，你用酒精配成10-5M 的储存液，用时1ML 加入1000ML培养液才成 10-8 M工作液，不是100ml吧。
你的破骨细胞养的如何，贴张图看看。

作者: zhezhe 时间: 2012-9-21 14:21

最近我养的细胞瓶底有很多小而圆的东西，有折光性，特别在细胞少的时候，则象一层沙似的，原以为通过传代能去除，但没作用，它会同细胞一起被细胞消化，且离心也去不掉。请问：这是什么东西，怎样去除。

作者: utt0989 时间: 2012-9-21 14:36

最近我养的细胞瓶底有很多小而圆的东西，有折光性，特别在细胞少的时候，则象一层沙似的，原以为通过传代能去除，但没作用，它会同细胞一起被细胞消化，且离心也去不掉。请问：这是什么东西，怎样去除。

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污染了吧？建议加双抗杀。
另外，要把你养细胞用的培养基、培养瓶等东西做个试培，看污染出在哪一步。

作者: zhezhe 时间: 2012-9-21 14:37

请问你说的双抗是指青、链霉素吗？我配培养基时加的有，你是指加大剂量吗？剂量大概是多大？
有人说可能是衣原体感染，如果是的话又怎么办？

作者: yueban-1147 时间: 2012-9-21 14:37

衣原体在常规的倒置显微镜下是看不见的。可以用DNA染色的方法观察，具体方法可以查询鄂征主编的细胞培养参考书。双抗当然指青、链霉素。配培养基时加的作为1倍浓度的话，杀菌是常用2或5倍的浓度处理。不过一般没有太大用，可能的话就重做吧。如果培养室条件较好的话，建议培养基中可以不加双抗。我觉得培养基中加双抗没有太大作用，主要还是要注意无菌操作。

作者: junjie05 时间: 2012-9-21 14:38

有两个问题请教大家。
1、心肌细胞免疫组化抗体（大鼠）有哪些？在哪能买到？
2、用纤维蛋白原和凝血酶作载体，比例怎么掌握？（配成不同硬度、不同孔径）
请指教！

作者: eric930 时间: 2012-9-21 14:38

各位战友我在养血管内皮细胞，用的是高糖DMEM ，原代培养时细胞长得很快，但是刚开始时像菊花一样，在成片的细胞团中有“开花”似的细胞附在贴壁细胞上，不知是什么原因，请教各位

作者: junjie05 时间: 2012-9-21 15:06

刚开始时像菊花一样，在成片的细胞团中有“开花”似的细胞附在贴壁细胞上 ?
传一张照片上来看看。

作者: 阿敏 时间: 2012-9-21 15:08

养细胞养得我好郁闷，刚开始还以为长势喜人，结果没几天，瓶子里附着像海藻似的白色悬浮物，重新PBS冲洗，加大双抗后（拼命往瓶子里加，估计浓度有n倍），那东东没消失，我的贴壁细胞全没了，。。。。。。。：）
真是命苦啊

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 15:09

是不是霉菌污染，长得很快，这两天南方多雨，霉菌长得很厉害，我已经污染了两次了，以后多加注意，培养箱的水盘很重要！

作者: mamamiya 时间: 2012-9-21 15:09

有没有培养成骨样细胞或者做成骨细胞原代培养的同志，讲讲个中的体会吧！

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 15:09

你好，以下是我的成骨细胞培养的一点体会，仅供参考，请指正：
成骨细胞原代培养、鉴定与活性检测
2.2.1 成骨细胞原代培养在无菌条件下，在超净工作台上分离SD大鼠颅顶骨，去除软组织与骨膜，PBS反复漂洗3~4次，在F-12培养基中将骨组织剪成碎片，用含0.1% I型胶原酶和0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化分离成骨细胞。将富含成骨细胞的细胞悬液种植于培养瓶中，加入含10% FBS、青霉素100 U /ml、链霉素100μg/ml的F-12培养基5ml，放入37℃、饱和湿度、5%CO2和95%空气的孵箱中静止培养。细胞分离次日换全液，以后每两天换全液一次，直至细胞长成融合状态进行细胞传代[10]。取2~4代细胞用于实验。
2.2.2 成骨细胞鉴定与活性检测在用台盼蓝（Trypan blue dye）染色法检测细胞活性，细胞活性均在95%以上。用对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性；用BGP、PICP试剂盒分别检测成骨细胞功能活性；用Von Kossa染色检测钙化结节形成。

作者: fei1226com 时间: 2012-9-21 15:10

请教大家：我的药物是多糖类，过滤除菌的时候比较难滤，易堵，高压，又因为是糖类，最好不要高压，所以每次损坏好几个滤膜，不知有没有更好的办法？

作者: TAT 时间: 2012-9-21 15:12

请教大家：我的药物是多糖类，过滤除菌的时候比较难滤，易堵，高压，又因为是糖类，最好不要高压，所以每次损坏好几个滤膜，不知有没有更好的办法？

作者: caihong 时间: 2012-9-21 15:13

我的一点成骨细胞经验：
目前成骨细胞多采用酶消化法，我的做法和jetter兄稍有不同：我先用胰蛋白酶或胶原酶消化20分钟后弃去上清中的细胞，因为开始消化的细胞以成纤维细胞多，然后再消化60-90分钟，收集第二次的细胞，多为成骨细胞，培养使用。培养基我曾经用过M199、MEM、α－MEM，成骨细胞对培养基要求不高。
成骨细胞鉴定与活性检测常用的方法还有MTT法，测定其增殖率。

作者: kulee 时间: 2012-9-21 15:13

师姐留了hela细胞给我，但是的-80度冻了一年半，不知道复苏后会不会活？担心折腾一周，最后发现是浪费劳力。各位有什么高见？

作者: kulee 时间: 2012-9-21 15:15

-80度冻存一年半，时间上确实有点长，不过Hela细胞很皮实，也很好养，所以估计不会有什么问题。
祝你好运！

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师姐留了hela细胞给我，但是的-80度冻了一年半，不知道复苏后会不会活？担心折腾一周，最后发现是浪费劳力。各位有什么高见？

作者: jujuba 时间: 2012-9-21 15:21

我在取背根节做雪旺细胞培养时，有大量的成纤维细胞，传代后成纤维细胞更多，请教各位大虾有没有好的纯化雪旺细胞的方法？

作者: eric930 时间: 2012-9-21 15:21

雪旺细胞的纯化，文献有很多报道了，不过都是80年代的了，不过最近也没有什么新方法。
消化法：由Brockes（1979）[34]提出，Wrathall等[35]又作了一些改进。基本步骤是：将鼠坐骨神经剪碎，置于0.25%胰酶和0.03%胶原酶中消化离心，培养。为了增加雪旺细胞的分裂速度和抑制成纤维细胞分裂，应用牛垂体浸出物（BPE）来刺激雪旺细胞的分裂和在培养24-48小时后，应用Ara-c抑制和破坏成纤维细胞，然后再用Thy-1.1，1.2抗血清加兔补体来溶解成纤维细胞。最后得到雪旺细胞的纯度可达99.5%。
植块法：由Askanas[36]报道，步骤如下：取鼠坐骨神经去除神经外膜，切成1cm3的小块，贴附于培养皿中，等待植块四周长出细胞后，将植块切除，再移植到新的培养皿上，使植块四周在长出应细胞后，再移植到新的培养皿上，直到获得大量的雪旺细胞，最后去除植块。该方法可以得到几乎纯净的雪旺细胞，因为通过反复移出植块，可去除大部分的成纤维细胞。优点是：通过反复移出，可明显减少非雪旺细胞数目，而不用细胞毒药物。
差速贴壁法：由Kreider和Pleasure等[37]报道。该方法主要是利用多聚赖氨酸，对成纤维细胞粘附力较强，对雪旺细胞粘附力较弱原理，而将成纤维细胞粘附到玻片上，将含有非粘附雪旺细胞的上清收集、离心、培养。优点：速度快；雪旺细胞产量高；不用抗有丝分裂药物抗血清和补体。由于该方法是在分离获得细胞的同时，就去除了成纤维细胞，因此其速度明显快于其它方法，缺点是成纤维细胞含量较高于其他方法。

作者: xevin 时间: 2012-9-21 15:22

小弟有两个问题：
1 我清理二氧化碳孵箱时发现水槽中有成团的菌丝。请问各位大虾水槽里应该加什么药？多大剂量？
2 我师妹的HL-60细胞最近生长状态不佳（hyclone1640+10%国产小牛血清），如何处理可以提高活力？降低血清含量？低密度种植？

作者: windy+++ 时间: 2012-9-21 15:22

请问大虾，平衡液D-Hanks和PBS哪一种适合进行成纤维细胞的培养？配制好后用高压灭菌好还是过滤好？

作者: junjie05 时间: 2012-9-21 15:23

前两天我也碰到了这样的问题，后来用新诘而灭擦过后，再用灭菌蒸馏水擦一遍，最后CO2培养箱的水是用灭菌的蒸馏水。反正灭菌是很简单的事！希望对你有帮助！第二个问题请说的仔细点，到底是那一方面不好（形态、生长速度？）

作者: junjie05 时间: 2012-9-21 15:27

培养液用DMEM，不知你用PBS或Hank's做什么？配消化液，还是单独清洗细胞，我们都用PBS配的，用起来还不错。（小鼠和人的成纤维细胞实验过）。

作者: junjie05 时间: 2012-9-21 15:28

培养箱的污染一般与水无关，应该是过滤膜的问题！

前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；

具体可参考，培养箱的操作说明！

作者: milkdog 时间: 2012-9-21 15:28

我昨天晚上把细胞复苏了，今天换液后观察，40倍放大视野也就四个细胞左右，不知道这样养下去会怎么样？昨天离心的时间长了点，1000r　10分钟，有没有关系？　这样的细胞有没有养的价值？有没有什么改进的办法？比如再复苏一瓶，合在一起养？

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-80度冻存一年半，时间上确实有点长，不过Hela细胞很皮实，也很好养，所以估计不会有什么问题。
祝你好运！

作者: summerxx 时间: 2012-9-21 15:30

我养的HepG2细胞总是成团，想要种到96孔板，很难达到单细胞的要求。消化时间短，成团根本没有办法分开：消化时间长，是分成单细胞了，但是细胞损伤极大。我花了将近2个月的时间也没有摸到合适的条件（痛苦哇！！！！）。那位仁兄养过hepG2，有没有碰到这种情况，怎么解决？会不会是我的细胞株退化的关系。

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该类细胞我养过1年，消化的时机不好，你的细胞可能长得太满，细胞的状态不好，胞间连接比较致密。下次传代时要注意不要等细胞完全融合才传代。1：3要遵守

作者: loli 时间: 2012-9-21 15:30

HEPG2细胞是一种比较特殊的细胞，有的时候增殖会向上方生长，形成明显的细胞团。因此消化成单个细胞比较困难，你有没有尝试加入EDTA？如用EDTA，消化好后一定要注意离心。

作者: qumm1985 时间: 2012-9-21 15:54

请问各位大侠：如果我用原代培养的细胞进行细胞转染实验，但此细胞系没有得到鉴定，是否得到国际同行认可，在国外发表文章

作者: toy 时间: 2012-9-21 15:54

我也遇见过，可能不是支原体吧，支原体多形性，但小亮点圆圆的，很规则啊。

作者: junjie05 时间: 2012-9-21 15:55

我刚开始学养细胞，有一个问题：我购买了Gibco的PRMI1640（含谷胺酰胺，不含碳酸氢钠），请问用不用加碳酸氢钠？我没加，测PH值是7.3，是不是一定要加碳酸氢钠？如果加，要加多少？

作者: loli 时间: 2012-9-21 15:55

有谁知道培养箱水盘中硫酸铜的浓度？

作者: DDD 时间: 2012-9-21 15:57

我刚开始学养细胞，有一个问题：我购买了Gibco的PRMI1640（含谷胺酰胺，不含碳酸氢钠），请问用不用加碳酸氢钠？我没加，测PH值是7.3，是不是一定要加碳酸氢钠？如果加，要加多少？

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我用的也是Gibco的PRMI1640，我的经验是还是加上一点，具体剂量为每1000毫升培养基加2克的碳酸氢钠即可。祝你好运！

作者: DDD 时间: 2012-9-21 15:57

请问大虾，平衡液D-Hanks和PBS哪一种适合进行成纤维细胞的培养？配制好后用高压灭菌好还是过滤好？

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我师兄也养成纤维细胞，据我所知，平衡液D-Hanks更适成纤维细胞的生长。配制好后用高压灭菌15-20分钟即可。

作者: kewanqi2011 时间: 2012-9-21 15:57

晕, D液比PBS更接近细胞内环境...当然是D液好啦...最好是用H液.....

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-21 15:59

1。看到前面的许多同学讨论有关细胞培养的问题，在这里也谈谈自己的体会。曾经用过细胞培养的资料是司徒镇强和吴军正编的细胞培养，很使用，18￥一册，还算适中。
2。Hepg2细胞消化后重铺时很容易成团，推荐用多聚赖氨酸处理器皿，但是消化时很费力，只是个人见解，仅供参考。
3。RMP1640每升中加3.7克氯化钠。
4。培养箱水盘中硫酸铜的浓度没有具体说明，书上只说加少许，应该是能够溶就可以了吧！蓝蓝的就差不多了吧！

作者: yes4 时间: 2012-9-21 16:01

有养表皮细胞的人吗？交流一下吧。
也许是福气，由于我在高原，亚热带，所以基本没有遇到过霉菌污染的事，抗生素用标准浓度的青链霉素也就够了。但我觉得表皮细胞的生长没有文献报告的快——我用的是Hyclone的DMEM/F-12培基，10%的胎牛血清。

作者: dog002 时间: 2012-9-21 16:02

把外源基因转染哺乳动物细胞后，细胞形态发生什么样的变化？对于不同种细胞来说，转染基因后都发生相同的变化吗？

作者: caihong 时间: 2012-9-21 16:04

硫酸铜的量最好是饱和溶液，也就是有颗粒存在！

作者: wu11998866 时间: 2012-9-21 16:04

有养表皮细胞的人吗？交流一下吧。
也许是福气，由于我在高原，亚热带，所以基本没有遇到过霉菌污染的事，抗生素用标准浓度的青链霉素也就够了。但我觉得表皮细胞的生长没有文献报告的快——我用的是Hyclone的DMEM/F-12培基，10%的胎牛血清。

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上海医科大学（复旦医学院）公共卫生学院
金锡鹏博导
e-mail: xpjin@shmu.edu.cn

金教授是培养：皮肤角质细胞、成纤维母细胞、黑色素细胞的专家。

另外，北京一家公司专门在养皮肤表皮细胞，涉及企业秘密这里不好公开

作者: rxcc33 时间: 2012-9-21 16:05

1、细胞培养经典的ｐＨ值范围是7 2～7 4,可略微偏酸,但不能低于6 8。我们观察293细胞明显适应酸性环境,ｐＨ值在6 2～6 3仍能正常生长及繁殖,尤其是在复苏细胞时。若ｐＨ值超过7 4,则细胞难于贴壁,而ｐＨ值在6 9～7 1时,可顺利贴壁生长,故建议培养293细胞时将ｐＨ值调定在此范围内。2、细胞消化　293细胞的一个生长特性是细胞间易聚集成团。若消化不彻底,则细胞在贴壁生长前即互相粘着成团,细胞易老化且在瓶底分布不均匀。我们的经验是用0 02%ＥＤＴＡ和0 1%胰酶顺次消化,即先加ＥＤＴＡ1ｍｌ至50或100ｍｌ培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去,再加0 1%胰酶1ｍｌ,轻摇使之接触所有细胞后,弃去,将培养瓶置温箱中3～5ｍｉｎ,镜下观察细胞变圆,就可终止消化。3、复苏　293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ｍｌ培养瓶待细胞长满瓶底的70%～80%时消化冻存,复苏时将其全部接种至50ｍｌ培养瓶中,易造成细胞的拥挤和层叠,使细胞更难贴壁和生长。我们在293细胞复苏时,多次发现上述因细胞过密而不贴壁,进而死亡的情况。而接种至2个50ｍｌ瓶中时,未出现上述情况。另外,293细胞复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。我们观察,293细胞对更换培养基非常敏感,加入新鲜培养基后立即观察,可见细胞触角回缩,部分细胞变圆,易浮起,可能因受冷刺激或ｐＨ值改变,故我们认为复苏后48小时进行首次更换培养基比较合适,且用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。影响293细胞体外生长因素初步探讨周文泉　闵志廉　李莉　张玲珍江苏医药杂志2001年6月第27卷第6期

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 16:07

『转贴』
cuturl('http://www.nicpbp.org.cn/shw/nicpbp.nsf/0/504993BA24441C3948256A810011DA31?opendocument')标题: 牛血清在细胞培养中的作用与质量要求
投稿栏目: 生物制品学术交流
作者: 管理员提交日期: 2001-07-06
正文: 中国药品生物制品检定所李德富研究员

生物技术已经被世界各国视为一种高技术，在整个科学技术中占据了特殊的显著地位，特别是生命科学的发展更
离不生物技术，生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认
为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切
关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程
中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，
杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正
在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切
相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量
又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的
应用中牛血清又是最为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证牛血清质量也是促进
生物制品质量提高的重要环节。

一、牛血清在细胞培养基中的主要功能
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 16:08

5.起酸碱度缓冲液作用。

6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

二、牛血清的主要成份
血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常
随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。

1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。
纤维粘连素细胞促进细胞附着；
α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性
和被细胞利用。

2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞
生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。

3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。
胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。
类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。
促生长激素：促细胞增殖效应。
氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松
，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。

4其他成份
氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意
义。

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 16:09

三、牛血清的质量要求
随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到
的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也
不断提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。

（一）、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6.对细胞有良好的支持繁殖作用。

（二）、我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包
括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查。

（三）、美国对牛血清的质量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场，
他们对其质量标准要求都极为严格，从血清来源到产品质量都有明确规定。

1）血清来源：可从世界各国收集胎牛血清，但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求。地方当局还不
清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集，有说明血清质量的证明资料：包括收集过程的全部资料、检验
结果和交付情况。

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 16:09

2）血清的收集：胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10个月内）血清静脉取血。血清采集条
件必须符合工业生产的标准：低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。符合要求的血清56℃水浴30分钟灭
活。

3）血清的制备：
a. 超低IgG胎牛血清：通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量减到最低，一般IgG≤5ug/ml，生物学活性不变。

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧
化酶／过氧化酶方法测定）。

c. γ－射线照射：已经证明γ－射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体。照射剂量为30～45KG。
而且这个剂量的γ－射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响。

4）除菌过滤:经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括0.2微米（micron）和0.1微米滤膜。FBS要
通过三层0.1微米滤膜，其他血清可通过0.2微米滤膜。

4.终产品血清质量

1）化学检定：渗透压
pH
蛋白含量――电泳法
白蛋白球蛋白血红蛋白
随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄。
2）微生物学检查：细菌、真菌符合USP标准。
支原体：在支原体专业培养基上培养了3～4周，培养温度36℃±2℃
分别在需氧和厌氧条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次，Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法
无法检出的支原体如猪鼻支原体等。

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 16:15

病毒检查：
牛兰舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛细小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼肠弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

检查方法：
已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15％待测血清，连传3代共21天。阴性对照细胞培养液
中加15％已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。在观察
期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。

如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。阴性对照样品按同样方法。再将牛腹泄病毒、牛细
小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，再培养7天，用荧光
抗体技术进行检查。

细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察。取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、
豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查。试验在2～8℃和20～24℃进行。阴性对照细胞预先感染副流感
Ⅲ型病毒作为阳性对照。未感染的细胞作为阴性对照。

3）内毒素检测
用鲎试剂检查。

4）细菌噬菌体检查
主要检查E.Coli(C300 or K-12)噬菌体。

5）激素含量测定
每批FBS对某些激素含量都要进行测定，包括：雌二醇、胰岛素、孕硐、睾丸素、甲状腺素等。

6）血红蛋白检测
血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70％，血红蛋白含量≤mg15/dl。

7）细胞生长效果测定
a.细胞克隆效果测定
细胞选择：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清浓度与细胞数:
10％血清／1个细胞／孔
4％血清／5个细胞／孔
细胞培养基RPMI－1640， 96孔培养盘36℃±2℃，5％二氧化碳培养10～
15天。试验中选择一个已知参考牛血清作对照。
克隆效率计算：
克隆效率＝(阳性孔平均数/ 培养孔总数) X100％

相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率

b.贴壁效率试验：
用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验，A549（人肺癌细胞）该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化。采
用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10％血清――100细胞／孔，4％血清200介细胞／孔
。放36℃±2℃，湿润5％二氧化碳培养箱培养10～14天，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率。从这两种不同血清
浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平，分析两种试验条件下平均贴壁效率。

贴壁效率（％）＝(每孔克隆平均数/ 每孔活存的培养细胞平均数) X100％

相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率
c. 二倍体纤维细胞促生长试验
人二倍体细胞株 WI28 MRc5

作者: ffooll 时间: 2012-9-21 16:16

25cm2细胞培养瓶，5％血清，每瓶接种1.5X105细胞连传3代，每代血清浓度和接种细胞数相同，每代培养7天，每
代接种二个细胞瓶，36℃±2℃培养。以同样条件用已知参考血清进行平行培养。每代收获细胞计数，计算每批待
检血清与参考血清的相对生长率（RGR）。

RGR＝(试验血清每瓶细胞平均数/ 参考血清每瓶细胞平均数) X100％

牛血清主要质量要求（Sigma）

胎牛血清新生牛血清成牛血清
牛龄胎 10～14天＜10个月
无菌－－－
病毒－－－
支原体－－－
噬菌体－－－
内毒素（ng/ml） ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)
血红蛋白（g%） 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5
pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0
渗透压（mom/Kg H2O） 240～340 240～340 240～340

新的药品管理法即将公布，新的药品管理法对生物制品提出更严格的质量要求。特别是我国即将加入WTO，会有更
多的国外生物制品进入中国市场，我国的生物制品也希望更多地走向国际市场，所以在制品质量上要求会更高，
产品的市场竞争应主要靠质量竞争。所以对产品中的主要原材料的质量要求也会越来越严格。如实验动物我国SDA
已提出严格的质量标准，并提出全国各使用部门达到标准的期限。为了贯彻2000年版《中国生物制品规程》标委
会修订了《中国生物制品主要原辅材料质控标准》其中包括了生产用牛血清的质控要求，这是一个最低要求，和国
外产品的要求还有差距，希望各牛血清生产单位和使用单位，自己能制定出更高更严格的标准，以进一步提高我国
生物制品质量。

作者: windy+++ 时间: 2012-9-21 16:17

我感觉293还是比较好养，我是用杭州四季青的血清培养在塑料瓶里的（不是替他们做广告，是因为一般的细胞我们都用国产血清养），细胞生长状态良好，但293贴壁不牢，这是它的特点，所以传代时不用酶消化，反复吹打几次细胞就会脱落。另外，体外传代的代数不宜过多，否则会引起表型的改变。
C2C12我养的是从ATCC买来的细胞株，按常规方法培养，没觉得有特别的困难。可能需要更换一下培养基和培养条件。
但愿对你有帮助。

作者: windy+++ 时间: 2012-9-21 16:18

谁能告诉我Hela,SMMC7721 细胞的对数生长期是多少？谢谢！

作者: qumm1985 时间: 2012-9-21 16:18

我养的SP2/0总是有霉菌污染，请问怎样才能把环境中的孢子去掉。

作者: qumm1985 时间: 2012-9-21 16:19

听说用甲醛熏屋子可以祛除孢子，但熏了之后怎么处理啊，屋子里都是甲醛人受得了吗？

作者: mamamiya 时间: 2012-9-21 16:19

听说用甲醛熏屋子可以祛除孢子，但熏了之后怎么处理啊，屋子里都是甲醛人受得了吗？

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这种方法一般不遇到重大污染事件或有长假一般不用，屋子里都是甲醛人当然受不了。
呵呵
我们一般喷雾就可以了什么酒精，TD片，双氧水其实都可以啦。
做露天操作细胞时我一般是TD片和双氧水各喷一遍，然后紫外照射过夜。
露天操作细胞没问题。

作者: hyuu 时间: 2012-9-21 16:20

细菌一般只能在油镜下才能看到，如果看到单个的单位，那肯定不是细菌

作者: hyuu 时间: 2012-9-21 16:20

各位老专，请问那位曾经养过肝脏细胞，生长怎么样，能传多少代？

作者: greenbee 时间: 2012-9-21 16:22

也正在做成体肝细胞的培养（我只作为一个阳性对照），不过看过的资料一般没有传很多代的，一般4－6代就不错了！

作者: qqq111 时间: 2012-9-21 16:23

大家好，我是培养细胞方面的菜鸟，以后还得向大家多请教，谢谢楼上的回答。我的屋子在半个月前一直挺好的，没有污染，非典时期我停了半个月回来就这样了，看来我可能要用杀手甲醛了。

作者: DDD 时间: 2012-9-21 16:25

无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

作者: milkdog 时间: 2012-9-21 16:26

我在做小鼠的成骨细胞原代培养是出现了真菌的污染，经过革兰氏染色和请微生物专家看片确定是念珠菌的污染。我的细胞培养室开始使用时间不长，各项消毒措施也很严格，所以环境污染的可能性很小，怀疑是小鼠自身所带的污染。因为我用的是胎鼠的颅骨经过消化后获取成骨细胞的，有可能是小鼠子宫里有念珠菌的生长。请问有谁知道如何防止培养过程中真菌的污染或者该使用什么药物来去除真菌的污染？？？？？？？？顺便发两张照片给大家看看，一张是培养基中存在的大量成簇存在的、象葡萄样的念珠菌：
0

图片附件: 31915911.jpg (2012-9-21 16:26, 37.27 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13877

作者: milkdog 时间: 2012-9-21 16:27

还有一张是经过革兰氏染色的照片，各位大侠有谁知道该如何预防或者去除真菌污染的请快快支招！

图片附件: 79015009.jpg (2012-9-21 16:27, 56.47 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13878

作者: summerxx 时间: 2012-9-21 16:29

谁有3T3-L1脂肪细胞株和L6骨骼肌细胞株，我想讨教一下，谢谢！

作者: summerxx 时间: 2012-9-21 16:29

哪位高手养过兔VX2肿瘤细胞，我是新手，请多多指教。

作者: u234 时间: 2012-9-21 16:31

我也做成骨细胞的培养，贴上取才的方法，仅供参考。
实验前准备
动物：新生24小时内的大鼠（常用的Wistar或SD均可）10-20只
器械：眼科剪3把眼科镊3把大号皮镊1把培养皿3-4个 50ml 烧杯3个 15ml 塑料离心管6个脱脂纱布若干细胞培养常规用各种吸管15个，25ml培养瓶3个（以上器械用量为常规用量，可视具体情况有所变动）
试剂：70%酒精消化酶（含02.% 胶原酶I和0.1%透明质酸酶）DMEM 培养基（Gibaco）胎牛血清（TBD生物材料公司）无酚红1640培养液（Gibaco）双抗（终浓青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml）PBS
取材
1.  动物消毒把实验动物浸泡70%酒精3-5分钟，建立分两次浸泡，可充分保证动物无菌，避免污染。
2.  手术取颅骨动物用纱布拭干后，拉颈处死，用大号皮镊固定其颈部，眼科剪从动物鼻部沿正中剪开头部皮肤，拉向两边，从鼻根处环行剪下动物颅骨，放入预先备好的盛有无酚红1640培养液的培养皿中（如无培养液用PBS代替亦可），培养液可加入约10倍终浓的双抗。
3.  制备待消化的颅骨用眼科镊小心剔除颅骨上的结缔组织和毛细血管，至骨片完全呈乳白色，依次过双抗递减的培养液洗涤3次，转入烧杯，眼科剪将样本剪成糜状，加入消化液约8-10ml消化；
4.系列消化消化共分五次进行系列消化具体过程见下面所示的程序图：

收集消化3,４,５的细胞沉淀，加入1ml DMEM+10%FCS，吹打1min，合并收集到的细胞，计数后大致按105，接种在25ml 培养瓶中，置于37℃ 5%CO2培养。
5.观察 12小时后观察细胞，了解细胞的贴壁情况，接近24小时后换液，清除杂质和死亡细胞及未贴壁的细胞。
说明：上述取材过程为成骨细胞培养常用的方法，另外我们在实际操作中也用0.25％的胰酶预消化20分钟，再进行3次序列消化也能取得较满意的效果，多用于样本量少的情况，但应注意消化过程时间的控制，尽可能避免延长时间，减少消化对细胞的损害。
培养细胞培养用含10％胎牛血清的DMEM，培养前调整PH至7.2-7.4，常规换液，细胞融合至60％左右可消化传代。
鉴定
1．  形态学鉴定
2．  碱性磷酸酶染色
3．  骨结节染色
不知为什么，图贴不上去。我还是发一个附件吧。
另外，请各位帮帮我想一下，我现在要试的药是一些油，比如说苏籽油等，我不知该如何加到细胞中去，如何溶解？我用酒精或DMSO溶解后，酒精或DMSO用水稀释到对细胞没影响的浓度，油也很稀了，怎么办？用吐温80行吗？
谢谢！

图片附件: 53903832.snap.jpg (2012-9-21 16:31, 54.15 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13879

作者: one 时间: 2012-9-21 16:31

刚来，不知道别人是否介绍过，但这方法确实是我自己10年前想出来的。
霉雨季节到了，一旦有霉菌污染，真是头痛啊。当年没有空调和层流间，这个季节只好干别的了。
无意中发现，有块长毛的木块发在一个国产的铜内胆孵箱里（不是CO2孵箱），几天后毛都没了。
于是试验用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上硫酸铜。结果以后几乎没有过霉菌污染了。
后来，市面上开始有铜内胆的孵箱卖了，贺利氏、Forma....，不过买得起的人还不多。
这个方法比酒精、紫外照强多了。最多是箱子里有点锈，正好可以看看孵箱里的不锈钢质量怎样。

作者: langlang 时间: 2012-9-21 16:32

我一直怀疑我的超净工作台里有霉菌污染，大家帮忙支个招，怎样才能除去。我试过用酒精烧但好象还是有。

作者: ending 时间: 2012-9-21 16:32

我刚开始学养细胞，有一个问题：我购买了Gibco的PRMI1640（含谷胺酰胺，不含碳酸氢钠），请问用不用加碳酸氢钠？我没加，测PH值是7.3，是不是一定要加碳酸氢钠？如果加，要加多少？

作者: ending 时间: 2012-9-21 16:33

我一直用的培养基就是Gibco的PRMI1640，我的个人建议是加2g的碳酸氢钠，然后通
CO2或用1N 的HCl将PH值调到你所需值。当然也可先通CO2后再加入碳酸氢钠。还有碳酸氢钠可先配成溶液或直接加入粉剂。本人一直是直接将2g的碳酸氢钠粉加入，然后用HCl调PH值，需注意的是家HCl是要少量少量加入，多测几次以免调的太酸难以调回。
但愿对你有点帮助！

作者: ending 时间: 2012-9-21 16:36

关于MTT法的个人心得:
与前面朋友所述相同的地方不再重述，我发现MTT溶液配好后密封避光于-20度储存一个月内都不会失效，很省事的哦！还有一般在570nm处测。

作者: yueban-1147 时间: 2012-9-21 16:36

同意,我是把收好的细胞放在一个泡沫盒子里,里面塞些棉花,然后放入-70度,这样温度就会一度一度的降下来,过夜,然后再置入液氮中,据说细胞放在-20度存活率最低.
不知可对??

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梯度降温，每分钟1度似乎比较理想

作者: 大白菜 时间: 2012-9-21 16:37

大家的吸耳球都是怎么保持无菌的，是不是每次实验都要换个吸耳球

作者: remenb 时间: 2012-9-21 16:38

请教各位，细菌或支原体在普通相差显微镜下能看得见吗？我养的细胞长的越来越慢，贴壁不牢，但培养液不浑浊，镜下可以看见培养液里不断变形的东西，有时是黑色的虫子一样的形状，有时由变成轮廓很清的亮亮的小圆点，好象是横断面。不知是什么，出现了2次了，而同时养的另外一种细胞却很好。请帮帮忙，多谢！

作者: HP007 时间: 2012-9-21 16:39

大家的吸耳球都是怎么保持无菌的，是不是每次实验都要换个吸耳球

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吸耳球应该定期用新洁尔灭浸泡消毒，没有必要每次都要换。

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 16:40

请各位指教
血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化
细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种死亡形式，指细胞在生理或病理情况下发生有序的主动的非炎症死亡，又称程序性死亡(programmed cell death，PCD)。血管内皮是循环血液与血管平滑肌之间的中介组织，对于维持血管内环境的平衡具有重要意义。现已发现，血管内皮受损是动脉粥样硬化症(atherosclerosis，AS)发生的关键因素。本文就诱导内皮细胞(endothelialcell)凋亡的一些因素与AS的发生之间的关系以及有关机制作一综述。
1 内皮细胞凋亡的细胞及分子基础
在外界因素诱发细胞发生凋亡时，细胞内Ca2+、Mg2+明显增加，激活细胞内的核酸内切酶，将染色体切断，同时Ca2+浓度升高会激活钙激活蛋白酶(calpain)，谷酰胺转化酶(transglutaminase)和蛋白激酶C使细胞骨架断裂，胞浆蛋白交叉联合，细胞内信号传递受损，进而促使细胞凋亡。
许多基因与细胞凋亡有关。P53基因可以诱导细胞凋亡；bcl—2基因家族的表达产物位于细胞内膜系统上，成员间通过形成同二聚体或异二聚体促进或抑制细胞凋亡;c—myc基因是一个凋亡调控基因，若没有第二信号系统作用时使细胞进入凋亡过程，活化型Ras与其下游效应器作用产生抗凋亡作用，Caspase家族需一些因子活化才能产生凋亡信号。
2 内皮细胞凋亡与AS
大量实验证实，易发生AS的局部血管的内皮细胞具有更新增加的现象，说明内皮细胞更新和此前的细胞凋亡与AS斑块形成有关。凋亡加速使内皮细胞更新增加，从而改变内皮细胞功能，诱发AS发生。血管内皮细胞的凋亡可能是AS形成的始发步骤[1]。另外还发现一些易诱发动脉粥样化的因素，如氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density1ipoprotein，oxLDL)、ROS(reactive oxygen species)、血管紧张素II(Ang II)、葡萄糖、致炎细胞因子都被证明能诱导内皮细胞凋亡；相反，一些抗AS的因素如雌激素，NO(一氧化氯)或抗氧化剂等均能阻止细胞凋亡。
2．1 促内皮细胞凋亡因子与AS
2．1．1 oz—LDL 、 ox—LDL具有细胞毒性作用，可以直接损伤内皮细胞本身。毒性剂量的oz-LDL能诱发培养的内皮细胞出现大批凋亡。Isabelle等[2]发现此凋亡在一个持续和滞后的细胞质Ca2+峰后出现，如用EGTA将胞外Ca2+整合或用Ca2+通道阻滞剂硝苯地平或尼索地平后则会阻断此Ca峰和凋亡，核酸内切酶抑制剂则只会抑制凋亡不会阻断Ca2+峰。此实验与前述凋亡过程相吻合。
Stefanie等[3]发现ox—LDL诱导内皮细胞凋亡与增加CPP32样蛋白酶的活动有关。后者为诱导蛋白水解使细胞凋亡的主要酶。专一性抑制CPP32的活动则可完全阻断ox—LDL诱导的细胞凋亡。一些抗氧化剂可阻碍ox—LDL诱导的凋亡，也能阻断CPP32样酶的活动，阻止其水解CPP32成为有活性的亚单位P17。提示ox—LDL诱导的内皮细胞凋
亡可能是通过增强CPP32样蛋白酶的活动而实现的。
Li等[4]发现，ox—LDL能显著增加培养的人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)的特异性植物凝结素样ox-LDL内皮受体(LOX—1)的表达。LOX—l在ox—LDL参与的HCAEC凋亡中起重要作用。反义LOX—l会抑制ox—LDL的诱凋亡作用。LOX—l的化学抑制物也会减少ox—LDL诱导的凋亡。在此凋亡过程中核因子B(nuclear factor，NF—会被活化，故NF—
B抑制剂也会抑制ox—LDL参与的HCAECs的凋亡。由此可知，ox—LDL会上调自身内皮受体，其诱导的凋亡是由LOX—l的活动来调节的，在此过程中，NF—B可能起信号传导的作用。而低氧诱导的主动脉内皮细胞中，NF—B通过抑制助Bcl—2
而作用[5]。
高浓度ox—LDL致内皮细胞凋亡要通过细胞膜上的中性神经鞘磷脂酶(neutral sphingomyelinase，NSMase)活化途径。NSMase水解鞍磷脂为神经酰胺和磷酸胆碱，神经酰胺或类似物充当应激反应的信号分子。抗NSMase既抗体可抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡。NSMase活化和随后的内皮细胞凋亡可能是启动动脉斑块破裂的一个重要事件[6]。
有学者认为[7]ox—LDL能促使细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中，损坏了线粒体膜，进而诱导内皮细胞发生凋亡。 ·
2、1．2 R0S ROS能诱导各种类型的细胞发生凋亡。在血管壁，ROS由动脉粥样化斑块处巨噬细胞形成，在单核细胞、白细胞粘附后作用于内皮。内源性的ROS由内皮与血
管平滑肌NADPH氧化酶合成，从AngII、ox—LDL、肝瘤坏死因子(TNF—α)均可诱导其合成。内源性的ROS可以影响内皮细胞线粒体膜通透性，促使细胞色素C释放，从而诱导内皮细胞凋亡。相反，对于平滑肌细胞，内源性R05的合成可促其增殖[8]。
Fen8等[9]发现由高浓度葡萄糖诱导所产生的ROS会活化c—Jun氨基末端激酶(c—Jun NH2—terminal kinase，JNK)，后者又会激发Caspase-3进而诱发细胞凋亡。

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 16:41

2．1．3 血管紧张素II(AngII)丛AngII诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVECs)凋亡与剂量有关。Stefanie等[10]将HUVECs与不同浓度AngII孵育18h，发现如同时阻断AT1与AT2受体则会抑制AngII的凋亡诱导作用，但分别阻断其中之一则无此作用。AT2的选择性激动剂也会剂量依赖性地诱导凋亡，专一性抑制Caspase-3的活动会阻断AngII诱导的凋亡。提示AngII诱导的凋亡与Caspase-3的活动有关。
2．2 抑制内皮细胞凋亡因子与AS
2．2．1 雌激素 Ioakim等[11]用细胞因子TNF诱导HUVECs细胞凋亡。发现雌二酪(E2)会抑制此凋亡且与剂量有关，专一性E2受体拮抗剂会抑制这种作用。E2在抗细胞凋
亡作用中起维持作用。提示E2的抗AS作用可能与其维持内皮细胞完整性有关。
Alvarez等[12]的实验证实，17b—雌二酪通过增加内皮细胞与基底的联系及增加PPl25激酶的酷氨酸磷酸化作用来减少内皮细胞的凋亡，从而起到抗AS发生的作用。
最近，Sudoh等[13]学者用切除卵巢的雌性Wistar大鼠的实验也证实E2的抗内皮细胞凋亡作用。而黄体酮不影响E2的作用。
2．2．2 NO(一氧化氮) 大量研究表明内皮NO合酶(eNOS)合成的NO可抑制内皮细胞的凋亡。因此NO可以防止由一些致炎细胞因子和一些能导致AS的因子如ROS、
AngII所致的细胞凋亡[14I。
日本学者Sata施等[15]的实验表明NO合酶抑制剂会影响肾上腺馆质素(Adrenomedullin)的抗凋亡作用，而NO供体则有抗内皮细胞凋亡的作用。鸟苦酸环化酶抑制剂及cGMP类似物对此凋亡作用无影响。提示NO抑制内皮细胞凋亡是通过一个与cGMP无关的机制进行的。
Stefanie等[10]的实验显示NO供体硝普钠会完全阻断AngII的促凋亡作用及降低Caspase-3的活动。由此推测NO通过干预Caspase活动而抑制凋亡。
但是日本的Suenobu等[16]发现NO供体(NOR3)能诱导内皮细胞凋亡，其作用可被cGMP依赖的蛋白激酶抑制剂KT5823和一种可溶性鸟苦酸环化酶抑制剂ODQ所抑制。ODQ的作用也会被KT5823所抑制。NOR3诱导的内皮细胞凋亡可被EF—l拮抗。通过Wester印迹试验表明，NOR3会增加P53而非Bcl—2的作用。产生这两种不同的作用的原
因可能与NO的量有关。
2．2．3 Zn Zn对于维持细胞膜的结构与功能是必需的。Henning等[17，18]指出，Zn一方面通过其抗氧化作用和膜稳定性而防止内皮细胞被一些破坏细胞稳定性的物质如多不饱和脂肪酸(亚油酸)和细胞因子如TNF所损害，进而阻止内皮细胞的凋亡；另一方面Zn还可能参与凋亡信号的传导途径而起抗AS作用。因为在细胞因子介导的氧化应激反应中发现Zn能阻止一些转录因子如Kappa B和AP—l的活化，而且Zn还与Caspase基因的话化有关。
Meerarani等[19]也发现，亚油酸和TNF—a能上调Caspase-3的活动，从而诱导内皮细胞凋亡。Zn经TPEN整合后能显著增加这种凋亡作用。生理浓度的Zn可以阻止凋亡，
减轻凋亡细胞的形态学改变。而中等浓度的二价阳离子如Ca、Mg都没有此作用。
3 抗凋亡药物与AS
现发现许多具有抗AS的药物与其抗内皮细胞凋亡，保护血管内皮的功能有关。如前所述，抗氧化剂如N—乙酰半肮氨酸、Vit C、Vit E、雌激素、E2等的抗AS机制一方面是可以抑制ox-LDL、ROS等氧化物质的产生，从而抑制其诱导的内皮细胞凋亡[3，ll~13]；另一方面也可以减少R0S等物质对平滑肌细胞的增殖作用[8]，从而阻断AS发生的两个重要步
骤。
环抱菌素A(cyclosporin A)[7]10mol／L可完全抑制ox-LDL诱导内皮细胞释放细胞色素C，也可阻止TNF及AngII诱导的细胞色素c的释放，环胞菌素A的这种内皮细胞保护作用可以解释其部分抗AS作用。
Driscoll等[20]发现辛伐他汀(Simvastatin)能改善高胆固酵损伤的内皮功能。其机制与减少超氧阴离子生成，减少NO失活所致凋亡有关。
总之，由多种因子诱发的血管内皮细胞凋亡是AS发生的一个重要因素。防止内皮细胞凋亡，保护内皮功能为我们提供了一种新的预防和治疗AS的策略，内皮细胞凋亡发生的诱导因子、相关基因及蛋白产物和信号传导过程均可以作为我们寻找抗AS药物的靶点。相信此类研究的不断深入，将会为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供新的依据。

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 16:42

参考文献：
[1] Dimmeler S，Hermann C，Zeiher AM．Apoptsis of endothelialcell：contribution to pathophysiology of atherolerosis[J]．Eur Cytokine Netw，1998，9：697—698．
[2] Isabelle EB，Meilhac O，Pieraggi MT，et al．Oxidized LDLsinduce massive apoptosis of cultured human endothelial cellsthrough a calcium一dependent pathway prevention by aurintricarboxylicacid[J]． Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17：331—339．
[3] Dimmeler S，Haendeler J，Galle J，et al．Oxidized low—densitylipoprotein induce apoplosis of human endothelial cell by activationof CPP32—1ike proteases;a mechanistic clue to the‘reponseto injury’hypothesis[J]．Circulation，1997，95：1760—1763．
[4] Li D，Mehta JL．Upregudation of endothelial receptor for oxidizedLDL(LOX—1)by oxidbed LDL and implications apoptosis ofhuman coronary artery endothelial cell; evidence from use of antisense L0X—1 mRNA and chemical inhibitors[J]．Arterioscler Thromb Vasc Bio，2000，20：1116—1122．
[5] Matsu***a H，Monri***a R，Nata T,et al．Hypxia—inducedendothelial apoptosis through nuclear factor-B(NF—mediated bcl—2 suppresion in vivo evidence of lhe importance of NF—B in endothelial cell regulation[J]．Circ Res，2000，86：974—981．
[6] Chatterjee S．Sphingolipds in atherosclerosis and vascular biology [J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18:1523-1533.
[7] Walter DH,Haendeler J,Galle J,et al.Cyclosporin A inhibits apoptosis of human endothelial cells by preventing release of cytochrome C from mitochondria[J].Circulation，1998，98：1153—1157．
[8] Dimmeler S,Zeiher AM.Reactive oxygen species and vascular cell apoptosis in response to angiotensin II and pro-atherosclerotic factors[J].Regul Pept,2000,90:19-25.
[9] Ho FM,Liu SH,Liau CS,et al.High glucose induced apoptosis in human endothelial cells is mediated by sequential activations of c-Jun NH2-terminal kinase and caspase-3[J].Circulation,2000,101,2618-2624.
[10] Dimmeler S,Rippmann V,Weiland U,et,al.Angiotensin II induces apoptosis of human endothelial cells protective effect of nitric oxide[J].Circ Res,1997,81:970-976.
[11] Spyridopoulos I,Sullivan AB,Kearney M,et al.Estrogen-recepter mediated inhibition of human endothelial cell apoptosis: estradiol as a survival factor[J].Circulation,1997,95:1505-1514.
[12] Alvarez RJ,Gips SJ,Moldovan N,et al,17 beta-estradiol inhibits apoptosis of endothelial cells[J].Biophys Res Commun,1997,237:372-381.
[13] Sudoh N,Toba K,Akishelial M,et al.Estrogen prevents oxidative sress induced endothelial cell apopotosis in rats[J].Circulation,2001,103:724-729.
[14] Dimmeler S,Zeiher AM,Nitric oxide-an endothelial cell survival factor[J].Cell Death Differ,1999,6:964-968.
[15] Sata M,Kakoki M,Nagata D,et al.Adrenomedullin and nitric oxide inhibit human endothlial cell apoptosis via a cyclic GMP-indenpent mechanism[J].Hypertension,2000,36(1):83-88.
[16] Suenobu N,Shichiri M,Iwashina M,et al.Natruretic peptides and nitric oxide induce endothelial apoptosis via a cGMP-dependent mechanism[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,19(1):140-146.
[17] Henning B,Toborek M,Mcclain CJ.Antia therogenic properties of zinc,implications in endothelial cell metabolism[J]. Nutrition ,1996,12(10):711-717.
[18] Henning B,Meerarani P,Ramadass P,et al,Zinc nutrition and apoptosis of vascular endothelial cells:implications in atherosclerosis[J]. Nutrition,1999,15(10):744-748.

作者: idea2011 时间: 2012-9-21 16:42

[19] Meerarani P,Ramadass P,toborek M,et al. Zinc protects against necrosis factor alpha[J].Am J Clin Nutr,2000,71(1):81-87
[20] O'Driscoll G,Green D,taylor RR,Simvastin,an HMG-Coenzyme A reduse inhibitor,improve endothelial function with month[J]. Circulation,1997,95(5):1126-1131.

作者: summerxx 时间: 2012-9-21 16:43

吸耳球应该定期用新洁尔灭浸泡消毒，没有必要每次都要换。

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我们的吸耳球从来不处理，就在操作台上放着。因为玻璃管上都塞棉花，而且每次操作操作台都照紫外，我觉得没必要再处理了。

作者: qumm1985 时间: 2012-9-21 16:43

请教各位，细菌或支原体在普通相差显微镜下能看得见吗？我养的细胞长的越来越慢，贴壁不牢，但培养液不浑浊，镜下可以看见培养液里不断变形的东西，有时是黑色的虫子一样的形状，有时由变成轮廓很清的亮亮的小圆点，好象是横断面。不知是什么，出现了2次了，而同时养的另外一种细胞却很好。请帮帮忙，多谢！

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细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状的东东，培养液一般会浑浊，支原体偶没见过，不过据前面的大虾描诉也是黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊浊（具体情况你可看前面的帖子）。另外提醒你还有黑胶虫，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的。你结合自己的情况判断吧。如果是黑胶虫，可以用无菌生理盐水多洗几次，一般不会太影响，细胞还是可以用的。

作者: abc816 时间: 2012-9-21 16:44

我把那些细胞用Hanks液洗了几遍，换上新培养液，居然活过来了，只是长得很慢。我又重新复苏了一只细胞，发现培养也里也有那种东西！到底是什么？！

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-21 17:21

我用胶原酶1消化培养的人成纤维细胞总不能贴壁，请大家帮忙指正一下可能的原因在哪里？

作者: wu11998866 时间: 2012-9-21 17:28

刚上手养细胞，就来看这里的帖子，很有用也！
对于这种正常二倍体细胞是不是有很多注意点？望指教！

作者: tuuu2 时间: 2012-9-21 17:28

有人用过德国GREINER的细胞培养板和酶标板吗？说说怎么样？挺便宜的

作者: kuaizige 时间: 2012-9-21 17:28

我们的吸耳球从来不处理，就在操作台上放着。因为玻璃管上都塞棉花，而且每次操作操作台都照紫外，我觉得没必要再处理了。

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和我一样.偶尔用消毒液泡泡.

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-21 17:29

我正好在养她。开始时，经常出问题。主要是养3天后，若不传代或换液，他就给你难看：立马漂起来。经过苦苦摸索，终于找出原因。原来，293细胞很娇能，对培养环境要求苛刻。我的培养液配置时未精却计算盐份。后来，认真配置后，她就不死了，要养6天不换液也没关系。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-21 17:30

请问293细胞长满70%～80%传代时用0.25%胰酶消化多长时间为宜，通常是整块得掉下来，好像很难吹打成单细胞。在玻璃瓶上贴壁很慢，请问你们养293时一般多长时间贴壁啊。
多谢赐教！：）

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-21 17:30

请问各位，我现在在做293细胞降血清，请问有没有什么好的经验和建议。
多谢赐教！：）

作者: windy+++ 时间: 2012-9-21 17:31

我消化成纤维细胞时，细胞总是成团，吹也吹不开。稿的细胞复苏时，成团细胞都死光光。不知为何？

作者: summerxx 时间: 2012-9-21 17:31

消化液中加入EDTA。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-9-21 17:32

我要培养成熟大鼠的心肌细胞,请有经验的朋友不吝赐教!

作者: bohe221 时间: 2012-9-21 17:32

但我现在的困难是没有可以离心培养板的离心机,唉!
关于你推荐的那本书,我很想购买,请问从哪里可以订购?不好意思麻烦你复印!(请问你的Email是?),关于Tris-NH4Cl的配方,请问10 nm Tris-HCL（PH 7.4）中nm什么意思?是纳克吗?(不好意思)
我培养的只是小鼠淋巴细胞,没有分T细胞或其它的细胞进行培养,然后给予一定干预后检测一些指标,但因为是才接触细胞培养,所以有很多向大家学习的地方.

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我们也做测定淋巴细胞增殖或活细胞数量的MTT法，可以不同离心板的方法：
细胞培养结束前4小时，加MTT溶液10微升/孔，4小时后，轻轻将微孔板倾斜一些，用移液器吸出100~150微升（如果你在此时微孔中的液体有200～210微升的话，如果在此时微孔中只有100~120微升，则不需要吸出），当然要小心一些，不要把细胞吸出来，然后每孔加入100微升甲臢溶解剂（20％SDS，50%DMF）（DMF＝N，N，二甲基甲酰胺，配法：SDS 40g加入100ml DMF中，补足蒸馏水至总体积200ml）然后，需要将微孔培养板置于37度培养葙，过夜(>14小时), 最后用酶标仪在570nm处测定光密度值。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-9-21 17:33

请问293细胞长满70%～80%传代时用0.25%胰酶消化多长时间为宜，通常是整块得掉下来，好像很难吹打成单细胞。在玻璃瓶上贴壁很慢，请问你们养293时一般多长时间贴壁啊。
多谢赐教！：）

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其实293细胞在low passage时很容易贴壁，而且生长很好，当传至几十代以上时，容易形成细胞团块，并且少量的PBS清洗时即易脱落，消化后也不容易吹成单细胞悬液，所以依本人的经验，最好，购入时先大量冻存，以备后患。
293的贴壁50%一般几个小时即可，12小时-24小时肯定90%以上细胞贴壁，所以当传代后第二天，细胞生长良好，如果传代10－20%，4、5天就可以长至80%，一般2、3天细胞增殖一次。我使用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，一般不超过1分钟，最佳方法是先以1：1消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s，效果不错。有机会交流。
E：roger0704@sina.com

作者: langlang 时间: 2012-9-21 17:34

有人用过德国GREINER的细胞培养板和酶标板吗？说说怎么样？挺便宜的

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一般般...偶用过...但价格太贵了...不如用corning的...

作者: XYZQ 时间: 2012-9-21 17:34

各位高手，我是听我同学告诉我的有一个丁香园专门讲细胞培养的，我马上入社，一口气，把大家的高论看了一遍，收益颇丰，但还有许多问题，希得到大家的帮助。简单的讲我的实验：抽取兔骨髓基质细胞，培养，利用质脂体将骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因（载体是pcDNA3）转入培养的骨髓基质细胞，然后与生物活性陶瓷复合培养10天，植入自体颅骨缺损处。术后4、8、12周检测其成骨效果。我的问题是：
（1）质脂体转染的效率问题。因为我没有用G418筛选，用它筛选周期太长，如果转染的效率太底，我的种子细胞（基因转染的细胞）与传统的细胞比较就没有什么意义了。我所看的文献转染的效率（质脂体介导）10%、12%、5%的都有，各位费一些心，多谢。

作者: skytree 时间: 2012-9-21 17:34

是的,右上角一个最为典型.左上角的不是三层结构,是中央出现坏死,发黑所至.

作者: skytree 时间: 2012-9-21 17:35

补充一下,这是回复"干细胞"的是否为"拟胚体"那位同仁的.

作者: viviwang1987 时间: 2012-9-21 17:36

我已经做了2个月的MTT,用SDS,DMF来溶解确实比较好,我专门做了溶解剂的对比实验,不知道你们加在每个孔里是10的5次方,还是?
我现在遇到一个问题是我做的是中药,配置浓度高的时候,过滤器很困难,但又不能高压,别人说可以用10%的酒精配,但10%的酒精没有消毒效果,不知道是什么理由.

作者: star#room 时间: 2012-9-21 17:36

我正在培养DRG和Schwann细胞，我所用的多聚赖氨酸包被的培养皿未经过三蒸水冲洗，就直接接种，请问各位这样是否会对DRG和Schwann产生影响？

作者: fei1226com 时间: 2012-9-21 17:37

我也用SDS-DMF，但我发现放在培养箱中后1小时就完全溶解了，不需等很久时间，随着时间的变化，吸光度越来越低，但降的速度很慢，我不知道在吸光度最高的时候测是最好吗？一般放越久，吸光度会越高，但SDS-DMF不太一样。
多多指教和探讨

作者: is2011 时间: 2012-9-21 17:37

293和C2C12我都养过，培养液均为高糖DMEM。对于293来说，传代次数并非决定性因素，在细胞生长状态较差时，可以以1：10传代来激活细胞。再有血清的使用最好是新生牛血清，可以不用灭活。293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。切记一定要使用塑料瓶，可以反复使用，但要经过洗液处理。 C2C12细胞不能密度过大，否则会出现分化表型，使用玻璃瓶就可以。我一直在从事腺病毒载体的制备工作，其实很多东西不必到别人的实验室去做，自己查查操作手册或指南，照葫芦画瓢就可以了，但是重组病毒的鉴定一定要严格，我想诸位不会是仅仅为了做病毒而做病毒吧，肯定还有后续工作，对吗？

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请问养c2c12有何技术关键，有何要注意的否，谢谢

作者: any333 时间: 2012-9-21 17:37

are there some body have exoerience on endothelial cell culture,especially microvascular, could you summarize about that including isolate, subculture,... in detail?

Thank a lot!

作者: any333 时间: 2012-9-21 17:39

我的293E和293ET细胞死掉了。当时取细胞的时候，是从液氮中取的，然后放到-70度的冰中运送，总过程只有十分钟，复苏细胞的是一位老手，应该不会有什么问题。还可能是什么原因呢？不知谁还有这两株细胞以解我燃眉之急？谢谢。

作者: mimili_901 时间: 2012-9-21 17:39

我在养一些杂交瘤细胞，在做亚克隆时怎么有些空被污染啊，在同一块板上有的被污染，有的则很好，现在这些细胞能用么！
另外，细胞霉菌污染后要注意些什么啊，有什么挽救的办法么！

作者: plaa 时间: 2012-9-21 17:44

朋友们！我认为细胞系很好养，原代细胞才不好养，如原代脐静脉内皮细胞，原代气道上皮。但你要注意不能污染，消化下的细胞数不能太少，另加各类细胞的生长添加剂，一般不会有大问题。

作者: zhezhe 时间: 2012-9-21 17:47

最近饲养的细胞中出现肉眼见如豆腐渣样东西，液体很快变黄，但是不浑浊，镜下见为黑色丝团状物，请教被人也说不是霉菌，不知是何物，请教。

作者: HP007 时间: 2012-9-21 17:47

1.液体很快变黄:可能是细菌污染，因为细菌的营养消耗很大
2.丝状物：从形态上看可能是霉菌

作者: toy 时间: 2012-9-21 17:47

软骨细胞不贴壁会有何原因？我已用多聚赖氨酸铺底40分钟。
谢谢！

作者: BUK 时间: 2012-9-21 17:48

不知什么原因，我六孔板里面的细胞，只长在中间，边缘一圈全死了。各位有没有遇到过？是什么原因？是不是我每次加完药以后都震荡板子引起的，还是板本身有问题？细胞的问题？

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-21 17:48

受益非浅！谢谢各位前辈的讨论，我只是字一边看就觉得很过瘾了。这真是一个好地方啊。我是养细胞的新手，以后还希望前辈多多指教。

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-21 17:51

同骨髓间质干细胞（MSCs）进行了长期、艰苦卓越的战斗，现在已经折腾的我是一个头俩个大，还往高手指点一二！
1.取材部位：试验动物为兔子。一般多以胫骨平台，但我每次所得细胞量少，且有时候取材比较费劲，为何不选取髂后上嵴？
2.所选用细胞分离液的密度是多少？大鼠和人的不同，兔子的呢？1.073行吗？
3.贴壁时间：一般几天后开始贴壁？最近不知为何每次原代细胞贴壁的时间似乎越来越长，3天后才能见极少量细胞开始贴壁。前面有战友说第二天换液，这样会不会把细胞给丢掉了？
4.用细胞分离液与不用对于细胞的贴壁和生长有何影响？

作者: kewanqi2011 时间: 2012-9-21 17:52

我在养一些杂交瘤细胞，在做亚克隆时怎么有些空被污染啊，在同一块板上有的被污染，有的则很好，现在这些细胞能用么！
另外，细胞霉菌污染后要注意些什么啊，有什么挽救的办法么！

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将污染孔用浓酸或浓碱封闭掉，好的孔继续培养就是。
霉菌污染后最好扔掉算了，基本没法抢救。以后多注意无菌操作，环境消毒，尤其培养箱，最好酒精擦洗，水盘放不挥发的防腐剂或硫酸铜什么的，另外可在培养基中加防霉素。

作者: wood533 时间: 2012-9-21 17:52

我养的PBMC中出现了许多约淋巴细胞1/4--1/5大小的透亮的颗粒状物质，形状各异，以圆型居多，有杆状，椭圆型，有抖动，在分离PBMC的当日我也可看到这些东西，但没有这么多，但随着培养时间增加数目就明显增加，甚至比淋巴细胞还多，有人说是虫，有人说是支原体，我觉得支原体不会有这么大，请高手们指点一下，我不胜感激
还有象PBMC这种悬浮细胞除用1640培养外还可用其他培养基吗

作者: yes4 时间: 2012-9-21 17:52

如果对细胞生长状态影响明显且培养液颜色变化快（很快变黄），则可能是细菌污染；
如细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，且同一批号的血清养的细胞有类似现象，则可能是血清中的黑胶虫污染。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

作者: yes4 时间: 2012-9-21 17:53

我养的PBMC中出现了许多约淋巴细胞1/4--1/5大小的透亮的颗粒状物质，形状各异，以圆型居多，有杆状，椭圆型，有抖动，在分离PBMC的当日我也可看到这些东西，但没有这么多，但随着培养时间增加数目就明显增加，甚至比淋巴细胞还多，有人说是虫，有人说是支原体，我觉得支原体不会有这么大，请高手们指点一下，我不胜感激
还有象PBMC这种悬浮细胞除用1640培养外还可用其他培养基吗

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如果对细胞生长状态影响明显且培养液颜色变化快（很快变黄），则可能是细菌污染；
如细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，且同一批号的血清养的细胞有类似现象，则可能是血清中的黑胶虫污染。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-21 17:56

细胞仍有增殖，但有所下降，并且培养液未变混，但我上流式测活性分子CD80的表达却老是不表达或表达很低，真不知道怎么办

作者: qqq111 时间: 2012-9-21 17:56

各位好，我是刚刚来到这个论坛，请多关照。
我想请教一些关于细胞转染方面的文章，谢谢。

作者: jujuba 时间: 2012-9-21 17:56

不知什么原因，我六孔板里面的细胞，只长在中间，边缘一圈全死了。各位有没有遇到过？是什么原因？是不是我每次加完药以后都震荡板子引起的，还是板本身有问题？细胞的问题？

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你的细胞是贴壁还是悬浮？六孔板是平底还是U形底？六孔板培养悬浮细胞时，一般细胞是会聚于孔中央的，但边缘的不会死。只是因为边缘细胞密度低，你见到的死细胞或变形细胞多些而已。你对比一下未加药的对照细胞，看看什么样。

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-21 17:57

你的细胞是贴壁还是悬浮？六孔板是平底还是U形底？六孔板培养悬浮细胞时，一般细胞是会聚于孔中央的，但边缘的不会死。只是因为边缘细胞密度低，你见到的死细胞或变形细胞多些而已。你对比一下未加药的对照细胞，看看什么样。

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谢谢您的热心。我养的细胞是贴壁的细胞，我用的六孔板是平底的。我看了，加药和没加药的孔细胞都是这个样，而且我重复了8次都是这样，真是头都大了。

作者: kewanqi2011 时间: 2012-9-21 17:58

大家好，对于细胞培养，我是一个新手。我刚开始培养三叉神经细胞，只需要培养过夜就可以了。我培养了几次，用的是dmem/f-12培养液，但细胞膜有点薄，活性不好,贴壁尚可。请问一下，有谁知道如何改进，以及有相关的资料呢，我没查到几篇有关三叉神经细胞培养的文章。多谢帮忙。

作者: misswu61 时间: 2012-9-21 17:58

请问谁养过成纤维细胞？俺没有经验，能谈谈吗？

作者: bohe221 时间: 2012-9-21 17:59

请教各位高手，有谁做细胞共培养的？望指点一二
1.用Millicell装置时候，上下层同时铺可以吗？对细胞密度有无要求？
2.若要两种细胞直接接触（既直接接种于培养皿中），对细胞接种的先后顺序有无要求？可否先接种一种细胞，在接种另一种（第一种细胞的密度不大时候接种），这样对后一种细胞的贴壁有无影响？两种细胞的密度有无要求？会不会因一种细胞的优势生长而导致另一种细胞被淘汰？
另，做原代培养的时候，为何六孔培养板边缘的细胞比较多？

望各位不吝赐教，在此先谢过了 ^_^

作者: ero11 时间: 2012-9-21 17:59

请问谁养过成纤维细胞？俺没有经验，能谈谈吗？

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midas养的是那种成纤维细胞呢？我最近也在养，是大鼠皮肤的

作者: hold住 时间: 2012-9-21 18:00

我马上要养海马神经元，目前我们实验室有一套不太成熟的海马神经元培养流程，
现公布于此，希望得到前辈的指点。
流程：
第一天  准备：多聚赖氨酸涂皿，60。C烤干。
第二天  配接种液： DMEM培养液
1％（体积比）双抗
1％（体积比）谷氨酰胺
10％（体积比）马血清
10％（体积比）胎牛血清
上述混合液置10％CO2孵箱中平衡4小时。
1、当天取新生大鼠海马，0.25％胰酶消化，37。C CO2孵箱中30分钟。

2、吸出海马组织块置于3ml接种液中终止反应。

3、吸出组织块置于3ml接种液中，吸管吹打
（用力稍轻，约10次）成细胞悬液，静止。

4、移出上层细胞悬液，再加入3ml接种液吹打
15-20次，可稍用力，静止。

如此反复三次，将三次得到的细胞悬液集中计数

用接种液稀释细胞浓度至1-2×106/ml ,每皿接种2ml。

第三天配维持液： DMEM培养液
1％（双抗
1％谷氨酰胺
1％N3
10％马血清
上述混合液置10％CO2孵箱中平衡4小时，弃去原培养液，加入2ml维持液继续培养。

第五天  见有胶质细胞成片生长时或有巨噬细胞出现，每皿中加20-30ul 阿糖胞苷。

第七天配维持液；吸出1ml原液，加入1ml新配维持液
此后每3天换一次液，整个培养期不超过15天。

我用上述方法养了几次，神经元状态不是很好，很少能活过两周。不知上述流程是否
有缺陷，请指教。

另：是否有较为简便的方，能比较客观的区分神经元，最好不要涉及抗体。

作者: kswl870 时间: 2012-9-21 18:00

我要开始养神经元和星形胶质细胞，但我不知道星胶的接种液和维持液与神经元的是否可以相同？谢谢各位！
有朋友可提供星胶的培养流程？

作者: qumm1985 时间: 2012-9-21 18:00

我要开始养神经元和星形胶质细胞，但我不知道星胶的接种液和维持液与神经元的是否可以相同？谢谢各位！
有朋友可提供星胶的培养流程？

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楼上的兄弟，本人没有养胶质细胞的经验，但看过一些这方面的资料，请看下面的帖子：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=212408&sty=1')

作者: dotaaa 时间: 2012-9-21 18:01

我在培养成纤维细胞，可是不管组织块法和酶消，3－5天后组织块和细胞就慢慢变黑，整体死去，请告诉我WHY?

作者: junhun 时间: 2012-9-21 18:01

我也在准备养海马神经元细胞，但海马的具体部位不是特别清楚是不是在鼠脑后部分开大脑皮层的两条带有白色的且卷折进脑下部的那两个。

作者: junhun 时间: 2012-9-21 18:01

请教高手:要使细胞更好的贴壁用哪一种贴壁较好?是多聚赖氨酸,鼠尾胶原还是0.1%的明胶？谢谢

作者: S6044 时间: 2012-9-21 18:02

我也在准备养海马神经元细胞，但海马的具体部位不是特别清楚是不是在鼠脑后部分开大脑皮层的两条带有白色的且卷折进脑下部的那两个。

取出大脑后（小脑、脑干去除），沿中央沟把大脑分成左右半球；将一把游丝镊（玻璃分针也可）插入丘脑，起固定作用；用另一把镊子沿侧脑室将皮层掀开，这是可以看一月牙形结构，折光性较强，其上覆盖有一层细密的毛细血管网，这便是海马；拨除血管，小心取出海马即可消化培养。

上述过程通常要在解剖显微镜下进行，以确保取准海马。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-21 18:02

血管平滑肌细胞如何用酶消化法培养？

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-21 18:03

请问各位，在细胞培养中，胰蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶有什么区别，何时用这三种酶？

作者: fklo83 时间: 2012-9-21 18:07

请教一下各位：
我要养牙乳头细胞并使之永生化，有没有人养过，请不吝赐教！
还有，有谁有永生化方面的资料，请帮一下忙，急需，谢谢了！
（就要开题了，还没有眉目，请各位多多指教）

作者: pengke1983 时间: 2012-9-21 18:07

请教HepG2和Hep3b的培养。自己养过不下10种细胞，没想到栽倒在这了。按理来讲这两种细胞不应该难养。注意到好像细胞喜欢酸性，在培养基中加了Hepes，用的是胎牛血清10%,DMEM 培养基，复苏10天了，感觉HepG2还生长，但速度非常非常慢，至今尚未传代。Hep3b就不行了，不停有细胞漂浮，培养基好像很容易变碱，不知道什么原因，特求教。如果哪位能赐两瓶，非常感谢！

作者: mickeylin 时间: 2012-9-21 18:07

请教各位高手,我养的是正常大鼠的腹腔巨噬细胞,但取细胞时发现混入少量成纤维细胞,在后期生长形势明显好于巨噬细胞,有可能影响实验结果,有什么方法去除掉吗?盼赐教.

作者: zsxan1990 时间: 2012-9-21 18:08

最近我找到培养细胞长霉菌的原因了。
一段时间我培养原代细胞，开始没问题，但以后换液N次后，总有几瓶细胞长霉菌。找原因，从培养液、谷氨酰胺、血清等都找不到原因。请一位同学监督我试验操作，没问题。但在关闭超净台时，他发现我开超净台的风机达到14格，分析认为可能与此有关。有道理，查查书，确实如此。偶还认为超净台的风机开得越大越好呢！减小风机到6-8格。没问题了。

作者: qhyu 时间: 2012-9-21 18:08

我在组织工程论坛发了副照片，请各位帮着参谋一下
谢谢
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=76&id=37074&sty=1&tpg=1&age=0&ppg=10')

作者: c86v 时间: 2012-9-21 18:08

大家好，我是第一次在这里发言，望多多指教！
我打算做人或大鼠肾小球系膜细胞的培养，不知哪位做过，谈谈经验，如果有这种细胞买更好，我可以不从原代培养做起，因为时间紧迫，望各位友人大力支持，多谢！！

作者: qhyu 时间: 2012-9-21 18:09

Ⅱ型胶原酶好象也可以的。
实验室有个博士用的Ⅱ型胶原酶消化大鼠胎鼠头骨，也培养成功了

作者: baidukk 时间: 2012-9-21 18:10

我刚刚开始淋巴细胞培养，现在遇到的一个问题是，在用淋巴细胞分层液（1.077密度）分离单个核细胞的时候，发现红细胞有一点凝聚成小球状，而且下沉速度过快，在我配平之前就已经下沉到试管底了，而且在离心完以后，只能看到单个核细胞层，中性粒细胞层不可见。奇怪的是，离心后管底的红细胞成流质状。。
请问：这是不是我的分层液出现问题了？
如果是分层液的问题请问一下如何补救？

作者: kuaizige 时间: 2012-9-21 18:10

我做课题用，需要培养皮层神经元，但是培养不出来，实验没法开展。心情很急，谁能帮我一下，介绍介绍经验，感激不尽。先谢谢大家了！！！！
ps：我在南京，如果哪位南京网友能提供帮助，能去现场参观参观，那是最好的。

作者: cocacola 时间: 2012-9-21 18:10

以我的经验，我们的293 长的非常快，从北医三院韩启德先生实验室搞来的，转过，高表达ALPHA 1 三种的亚型受体，一度让我门应付不过来，长的特别快，象中等瓶子，种的密度稍微大一点，3天最多就的传代。

作者: cocacola 时间: 2012-9-21 18:11

请教各位高手,我养的是正常大鼠的腹腔巨噬细胞,但取细胞时发现混入少量成纤维细胞,在后期生长形势明显好于巨噬细胞,有可能影响实验结果,有什么方法去除掉吗?盼赐教.

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以我的经验，一般是尽快做，该测的结果赶快测，不要等到成纤维细胞长的太旺盛。一旦混了，好象没有什么好办法。只有重做了。

作者: yychen 时间: 2012-9-21 18:11

以色列miniplast 的培养皿那里便宜了，0.90 的是细菌培养皿，能养细胞么？

作者: yychen 时间: 2012-9-21 18:12

我刚刚开始淋巴细胞培养，现在遇到的一个问题是，在用淋巴细胞分层液（1.077密度）分离单个核细胞的时候，发现红细胞有一点凝聚成小球状，而且下沉速度过快，在我配平之前就已经下沉到试管底了，而且在离心完以后，只能看到单个核细胞层，中性粒细胞层不可见。奇怪的是，离心后管底的红细胞成流质状。。
请问：这是不是我的分层液出现问题了？
如果是分层液的问题请问一下如何补救？

据我的经验，首先，加血样时动作要轻柔，但同时要注意速度。
如果真的不行，就适当用pbs稀释血样后再加到1077上。
我不知道你怎么分单核及中性细胞。淋巴细胞分离后就该只有一层云雾状细胞悬液。你怎么还要分那么细。我不懂，你说说看

作者: okhaha 时间: 2012-9-21 18:13

发现红细胞有一点凝聚成小球状，而且下沉速度过快？

是不是红细胞凝集了？要不要加抗凝物质！

作者: zsxan1990 时间: 2012-9-21 18:13

刚刚开始学习培养细胞，一些心得和大家分享：

1.发现细胞成团生长，虽然还有空间，但是团落中部细胞明显拥挤，出现死亡细胞，于是应该換液吹打使其分散。
2.在換液时最好不要採用傾倒的方法而是用吸管或槍頭講培養皿中的液體吸齣，此操作的目的是防止傾倒時液體囬流汚染。
3.換下來的槍頭可以丟棄在廢液鋼內，這樣可以避免每次都拿搶反復進齣從超凈臺。
4.在換液時註意反復搖動培養皿防止細胞因長時間缺液而幹涸。
5.不要把培養皿的蓋子放到自己手下方。
6.一切蓋子在蓋囬之前都要在酒精燈上殺菌。
7.消化的時間根據tripson的濃度而定。一般可以在鏡下觀察，看到大部分細胞有形態變化時即可。時間一定要控製好。
8.吹打時可以一半一半的操作。可以反光看到細胞下來。
9.鏡下觀察看到細胞均勻分佈。不要求每個細胞都下來，因為太多吹打對細胞也有損傷。
10.所有操作時避免槍頭或移也管頭接觸培養皿底部。

大傢多多指教！

作者: u234 时间: 2012-9-21 18:14

请求原代培养指导，急！急！
各位大师您们好
我是细胞培养的新手，现在正在为培养原代大鼠（SD）肾小管上皮细胞而发愁。我已经取了两次均失败，培养瓶内都是细胞碎片（24小时内）。取细胞的方法是80、100目钢网过滤，收集100目网上物1000rpm离心5min。我用的培养也液是TDB的胎牛1640（10%），0.2%的胰蛋白酶37℃温相消化20min
1640终止消化后分装培养。
请各位大师给我一些指点，愚人将感激不尽。

作者: BUK 时间: 2012-9-21 18:14

求助各位有识之士，养了1年余的两种细胞，前段时间由于某些原因，冻存了。现在开始复苏，很简单的工作，以前也做过，没有问题，可是复苏了几次，总是在第一次传代以后，就开始生长不良，细胞轮廓边缘亮亮的，好像贴壁不劳似的，生长很是缓慢，而且细胞间隙有很多黑色的渣子。开始怀疑营养不良，换血清高点的培养液尝试，它们竟然干脆罢工，状态更不好了，到底出了什么问题，难不成细胞也要放暑假吗？去年此时好像该细胞的状态也不好。

作者: 101010 时间: 2012-9-21 18:15

经验之谈：
1、细胞很好养。Hyclone的Define级血清和Gibico的胎牛血清我都用过，我觉得还是Gibico的胎牛血清好；浓度10％足够了。
2、DMEM很好配。NaHCO2加2.5g PH就达到7.4左右了，无需多加，谷氨酰胺可加可不加，关系不大
3、消化液用的浓度胰酶0.05％＋0.02％EDTA，对细胞损害很小，其他和大家有共识。

请问一下加入EDTA有何用处？

作者: zzzz 时间: 2012-9-21 18:15

EDTA能螯合消化液中的二价阳离子（Ca2+,Mg2+等），其中Ca2+在细胞间连接、粘附中起一定作用，消除Ca2+可起到一定的细胞分散作用。但也要注意，消除这些二价离子的作用（尤其是Mg2+),可抑制某些酶的作用。

作者: xyw5 时间: 2012-9-21 18:16

主任：您好。我有几个问题请教。
1。我们在做K562的培养，如果用24孔或96孔板的话，对细胞和板有什么要求吗？
2。悬浮的细胞到什么程度就应该换液了，每次传代有什么要求？
3。细胞复苏后如何计算死亡的细胞数？什么时候开始计算？
4。培养中发现细胞并非真正悬浮，换液时还需要吹才能完全脱落。为什么？
谢谢！！

作者: xyw5 时间: 2012-9-21 18:16

你好，MTT法的关键是必须了解受试细胞MTT结晶还原产物（formazan）吸光值的大小与细胞数量之间的线性关系范围，选择适当的接种密度及细胞培养时间。因此，在进行MTT实验之前，应测受试细胞的贴壁率、倍增时间、不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时细胞不致过满，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。
粉剂用PBS配最好，因为任何有蛋白或酚红的溶液都可影响结果。
下面是我曾经做的MTT，仅供参考：
1 MSC 1×105 ,100ul接种96孔板
2 测前4h，更换无血清培养液，同时加入20ul/孔 MTT液（5 mg/ml），37 0c，5%co2，4h
3 吸取上清，加入150 ul DMSO ，震荡15 min
4 37 0c，5%co2，4h（此时间应根据具体的颜色反映来定）
5 490 nm 测OD 值，结果如图：

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我要做的是K562细胞，请指教。谢！

作者: zwsyrt 时间: 2012-9-22 15:04

大家好,我是新来的.
我在原代培养骨髓间质干细胞.遇到一些问题请教:
1.有比较适合干细胞生长的培养基和血清么,
还有什么添加成分,如细胞因子等适合干细胞?
2,分离液用percoll1.073,是自己用原液配制,没有密度计,最终密度不是很精确,分离效果不理想,白膜层不是很明显,产率也不高.有1.073的成品percoll卖么?用ficoll1.077替代,效果如何?
3.提取的细胞混杂有成纤维细胞,如何去除呢?这种细胞生长很快,
谢谢!

作者: dotaaa 时间: 2012-9-22 15:04

大家好，我有一个问题想请教以下：
我在养HT-29（人结肠癌细胞株），刚开始还是单层的，后来不知怎么了，就成团长了，而且很难吹打成单细胞悬液，可我的实验还要用流式检测，很是矛盾，请大家帮忙，谢谢！

作者: kewanqi2011 时间: 2012-9-22 15:04

请教：我在做肝细胞功能方面的实验，买来的几种建系的细胞都没有测到白蛋白和尿素分泌，不知是我的测定方法有问题，还是建系的肝细胞已经失去功能。有谁做过这方面的实验，或有上述功能的肝细胞或肝癌细胞，如果哪位能赐细胞株，非常感谢！

作者: cocacola 时间: 2012-9-22 15:05

有个问题请教一下：
我现在要将淋巴细胞分离出来后进行培养，在分离过程中血液和淋巴细胞分离液以1：1的比例，1800转/分离心30分钟。结果最上面一层颜色为红色，试管壁上贴有似淋巴细胞物。
请教这是为何，先谢过！

作者: kulee 时间: 2012-9-22 15:05

本人根据帖子和自己的经验及书上的方法，总结了一下MSC早期贴壁分离纯化的方法，请大家去提提意见
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=76&id=326300&tpg=1&ppg=3&sty=1')

作者: lixi559 时间: 2012-9-22 15:06

国内外有没有MSC的细胞系卖啊,感谢提供信息

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-22 15:09

看看我养的乳鼠海马神经元，不知这种状态能否进行实验。请发表高见。

培养3天，×600

图片附件: 88012291.gif (2012-9-22 15:09, 45.5 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13891

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-22 15:10

10天光镜 ×600

图片附件: 40322391.gif (2012-9-22 15:10, 49.47 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13892

作者: guagua 时间: 2012-9-22 15:13

各位
我最近在做逆转录病毒转染293细胞实验，两组细胞，一组为高表达目的基因293细胞，一组为转染空载质粒的293细胞，从生长状态来看，高表达目的基因的293细胞明显长得慢，现在我想用流式检测这种客观指标，看看细胞周期的变化，我该如何控制两组细胞的同等生长条件，是保持代数一致，还是不同代数而控制同时传代时间然后取细胞做流式。这个问题困扰我很长时间，也没看到国外文献报道。另外如果我BrdU加入细胞做流式，又该如何设计实验。
请各位老师帮忙了
多谢

作者: 911 时间: 2012-9-22 15:14

C3A细胞到底是不是癌细胞？我觉得它有点象正常细胞？
其生长条件有什么要求？对氧，二氧化碳的要求是不是很高？
HepG2的基本资料有没有？
在那里可以查到相关的东西？

作者: qumm1985 时间: 2012-9-22 15:14

请教专家，吹打在分离细胞时常常用到，具体操作应该如何？
吸有液体的吸管在吹打时应该在液面以下还是离开液面，以免形成气泡，损伤细胞。

作者: DDD 时间: 2012-9-22 15:15

大家好，有谁养过supT1细胞？请提供点经验，怎样才能养好？谢谢！

作者: windy+++ 时间: 2012-9-22 15:16

有谁知道细胞单克隆化用的套环哪里有卖的？英文名字叫什么？

作者: zwsyrt 时间: 2012-9-22 15:17

各位专家，有做小鼠胎肝干细胞培养的吗？消化时用的是什么酶，胰酶还是胰酶加EDTA，浓度是多少，消化多长时间。是一次消化还是分次消化分别取出消化下来的细胞比较好？
望赐教。

作者: rxcc33 时间: 2012-9-22 15:29

听君一席言,胜读十年书!
请教各位,有谁养过家兔鼻腔黏膜上皮细胞(原代正常细胞)?该如何分离上皮?如何避免污染?什么培养液最好?
在下感谢先!

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 15:31

各位专家，有做小鼠胎肝干细胞培养的吗？消化时用的是什么酶，胰酶还是胰酶加EDTA，浓度是多少，消化多长时间。是一次消化还是分次消化分别取出消化下来的细胞比较好？
望赐教。

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一般用0。05%胰蛋白酶+0。025%EDTA消化5~10min

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 15:31

请教专家，吹打在分离细胞时常常用到，具体操作应该如何？
吸有液体的吸管在吹打时应该在液面以下还是离开液面，以免形成气泡，损伤细胞。

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一般都是在液面下避免形成气泡
吹打时注意先吸后吹
就可以避免气泡形成

作者: 911 时间: 2012-9-22 15:32

293还是很好养的，细心与注意无菌观念是个前提条件。我们一般用的0.25％胰酶消化，加入少量胰酶后稍稍摇一摇，然后倒掉多余胰酶。再轻轻摇一摇就可以看到细胞纷纷往下掉，加入适量DMEM终止消化。反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。

细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染哟。

作者: newway 时间: 2012-9-22 15:32

请教一下，哪位同仁养过前脂肪细胞？有没有人知道：有一种成纤维细胞可以分化为前脂肪细胞．怎么获得这种成纤维细胞？多谢！

作者: hold住 时间: 2012-9-22 15:33

请教大家一个问题：
我目前正在做血管平滑肌细胞培养，但需要细胞内的一些指标。想请教各位用什么方法使细胞破碎效果比较好。文献上说可以使用反复冻融，但似乎不太适合我养的细胞，超声效果也不是很好。再加上我所在的实验室条件不是很好，友人告诉我和EP管配套的一种类似研磨棒的东西在细胞悬液离心后使用其研磨效果比较好，请教各位高手有没有用过的，叫什么名字？从哪里可以买到？或者告诉我以下您的方法。
盼望各位高手指教！

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 15:33

请教大家一个问题：
我目前正在做血管平滑肌细胞培养，但需要细胞内的一些指标。想请教各位用什么方法使细胞破碎效果比较好。文献上说可以使用反复冻融，但似乎不太适合我养的细胞，超声效果也不是很好。再加上我所在的实验室条件不是很好，友人告诉我和EP管配套的一种类似研磨棒的东西在细胞悬液离心后使用其研磨效果比较好，请教各位高手有没有用过的，叫什么名字？从哪里可以买到？或者告诉我以下您的方法。
盼望各位高手指教！

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其实只要用磨沙的玻棒和内壁磨沙的玻璃容器就可以
如果没有就自己做把用喷沙机给玻璃喷沙使之粗糙
泡酸洗静后就可以用了你可以试试

其他的方法么
如果超生会破坏你要的大分子的话
化学裂解法是否可行呢
反复冻融比较简单

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 15:38

请教一下，哪位同仁养过前脂肪细胞？有没有人知道：有一种成纤维细胞可以分化为前脂肪细胞．怎么获得这种成纤维细胞？多谢！

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前脂肪细胞到养过
你可不可以说的详细点

作者: 987789 时间: 2012-9-22 15:39

我会试试你说的几种方法。但自己做磨沙的玻棒和玻璃容器也比较困难，一是自己不会做，二是细胞量比较少，容器稍大很容易丢失细胞。不知道反复冻融的细胞破碎效果怎么样，如果比较彻底就好了。还望赐教！

作者: 987789 时间: 2012-9-22 15:45

从哪里可以查到肝素和碱性成纤维细胞生长因子的质量和单位的换算关系，好象商品目录上总是用AU/ml，怎么换算成mg/ml或ng/ml。

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 17:16

我会试试你说的几种方法。但自己做磨沙的玻棒和玻璃容器也比较困难，一是自己不会做，二是细胞量比较少，容器稍大很容易丢失细胞。不知道反复冻融的细胞破碎效果怎么样，如果比较彻底就好了。还望赐教！

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是啊
这种研磨的方法一般是用于组织获得大量细胞时的
冻融比较简单可行可以将细胞悬液在低温冰箱低于负70度以下冻结
37度复稳融化 3~4次即可
据做过的人说可以

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 17:16

从哪里可以查到肝素和碱性成纤维细胞生长因子的质量和单位的换算关系，好象商品目录上总是用AU/ml，怎么换算成mg/ml或ng/ml。

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质量百分数和单位百分数一般通过分子量来换算
可以查药典或者说明书上应该有

作者: junhun 时间: 2012-9-22 17:17

我有几点心得供大家参考：
1、在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
2、细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
3、我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。
4、若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。

作者: vivian4123 时间: 2012-9-22 17:17

从胎鼠肝中获得的细胞培养后发现成纤维细胞特别多，而肝细胞较少，请问有什么办法可以很好的去除成纤维细胞，percoll离心可以吗，具体怎样？

作者: vivian4123 时间: 2012-9-22 17:17

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大,还是贴壁,请问为什么,怎样处理?

作者: gmjghh 时间: 2012-9-22 17:18

1、试试看肝细胞专用培养基，如Gibco的Hepato－ZYME,可有效去除杂细胞。
2、还可试试梯度贴壁法，因成纤维细胞贴壁比肝细胞快，因此培养1小时后，换瓶，再重复一次，看看有无效果，但操作过程中，注意温柔一些，因肝细胞在体外很难培养。

作者: gmjghh 时间: 2012-9-22 17:25

对一般细胞来讲，胰酶就足够了。不知您有无放在37度环境中，这样效果要好一些。另您的胰酶是否是新配的？实在不行，再加用0.2％的EDTA，只是这样的话，仅凭含血清的培养基是不能终止消化的，必须用10倍量的PBS等液来洗涤、终止。

作者: qhyu 时间: 2012-9-22 17:26

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大,还是贴壁,请问为什么,怎样处理?

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肯定是消化的问题啦，不知你的是什么细胞，可试试加上0.02%EDTA看看

作者: qhyu 时间: 2012-9-22 17:27

我要自己配1.077的ficoll分离液，不知哪位大虾有现存的配方吗？请帮帮我吧，谢谢啦

作者: qhyu 时间: 2012-9-22 17:27

细胞给药时间如何确定，铺板后时间长短似乎影响其对药物的敏感性。不知该选择哪个点？

作者: leifengta 时间: 2012-9-22 17:28

各位兄弟姐妹:
我现在在培养卵巢癌细胞，在做MTT时，有药做的效果非常离奇，空白组低于用药组，居然做阳性对照的药都不能呈梯度变化，更别说其它药物了。很惨啊！！一个多月都在摸索，却摸不出什么路途。在下恳请各位施以援手不胜感激！

作者: zhenxin 时间: 2012-9-22 17:30

养的c6/36细胞被污染，原因不明。
倒置显微镜下观察，见串珠状、形态各异的病原体布满真个视野，飘浮于培养液中，有的有分支，数目不一。请教各位高手，这大体是什么病原体？是什么原因（如污染源等）造成的？

作者: greenbee 时间: 2012-9-22 17:33

养的c6/36细胞被污染，原因不明。
倒置显微镜下观察，见串珠状、形态各异的病原体布满真个视野，飘浮于培养液中，有的有分支，数目不一。请教各位高手，这大体是什么病原体？是什么原因（如污染源等）造成的？

——————————————————————————

一般可能是球菌或杆菌感染
可能原因很多
比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等
可以用以下方法排除：
将所有培养液都加在一个培养瓶培养
如果没有细菌生长就是操作的问题
如果有检查每种培养液、环境、培养瓶等情况
逐渐排出
应该可以解决污染问题

作者: greenbee 时间: 2012-9-22 17:35

又学到不少知识,谢谢!只是想问一下流式测细胞周期时如何进行血清饥饿,使细胞周期同步化?一般细胞种好后,就直接在相应的时间点收细胞,然后染色,上机检测.请详细解释一下.万分感谢!!!

作者: chuntian1983 时间: 2012-9-22 17:35

请教高手：
我将要培养角膜成纤维细胞，并用非甾体类药物对其进行干预，对其作用后的结果我应该从那几个方面来检测？

作者: jujuba 时间: 2012-9-22 17:36

请问各位：在用MTT实验测量抗癌药物的作用时，接种96孔板后，多长时间或者细胞达到多少融合后给药。还有在用流式细胞仪测量抗肿瘤药物的促凋亡作用时，给药的时机如何确定。谢谢各位！

作者: hyuu 时间: 2012-9-22 17:36

我做心肌细胞培养，研究细胞因子对其功能影响，可是在更换了无血清培养基后，细胞数量明显减少，生长状态不好。是不是一定要家胰岛素和转铁蛋白等物质啊~！我没有那么多钱啊。。。。。。：（

作者: hyuu 时间: 2012-9-22 17:37

我还有一个问题，请教各位，乳鼠心肌细胞培养离体研究，用IL-1刺激细胞，是用大鼠的还是用人的啊？

作者: xevin 时间: 2012-9-22 17:38

请问，分离细胞原代培养用的胶原酶是哪一型的？

作者: minran_1980 时间: 2012-9-22 17:38

请问，分离细胞原代培养用的胶原酶是哪一型的？

————————————————————

这需要看你消化的什么组织了
对于结缔组织一般选用四型胶原酶

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-22 18:06

请问各位：在用MTT实验测量抗癌药物的作用时，接种96孔板后，多长时间或者细胞达到多少融合后给药。还有在用流式细胞仪测量抗肿瘤药物的促凋亡作用时，给药的时机如何确定。谢谢各位！

——————————————————————————————————————————————————————

我是接踵细胞于96孔板的同时即加入药物，然后根据你的需要终止作用时间检测MTT A值。不知你是否有特殊要求！

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-26 10:56

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大,还是贴壁,请问为什么,怎样处理?

——————————————————————————————————————————————

肯定是消化的问题啦，不知你的是什么细胞，可试试加上0.02%EDTA看看

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-26 10:57

我要自己配1.077的ficoll分离液，不知哪位大虾有现存的配方吗？请帮帮我吧，谢谢啦

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-26 10:58

细胞给药时间如何确定，铺板后时间长短似乎影响其对药物的敏感性。不知该选择哪个点？

作者: yapuyapu 时间: 2012-9-26 11:02

各位兄弟姐妹:
我现在在培养卵巢癌细胞，在做MTT时，有药做的效果非常离奇，空白组低于用药组，居然做阳性对照的药都不能呈梯度变化，更别说其它药物了。很惨啊！！一个多月都在摸索，却摸不出什么路途。在下恳请各位施以援手不胜感激！

作者: 轰轰 时间: 2012-9-26 11:03

养的c6/36细胞被污染，原因不明。
倒置显微镜下观察，见串珠状、形态各异的病原体布满真个视野，飘浮于培养液中，有的有分支，数目不一。请教各位高手，这大体是什么病原体？是什么原因（如污染源等）造成的？

作者: 轰轰 时间: 2012-9-26 11:06

养的c6/36细胞被污染，原因不明。
倒置显微镜下观察，见串珠状、形态各异的病原体布满真个视野，飘浮于培养液中，有的有分支，数目不一。请教各位高手，这大体是什么病原体？是什么原因（如污染源等）造成的？

作者: ALALA 时间: 2012-9-26 11:07

养的c6/36细胞被污染，原因不明。
倒置显微镜下观察，见串珠状、形态各异的病原体布满真个视野，飘浮于培养液中，有的有分支，数目不一。请教各位高手，这大体是什么病原体？是什么原因（如污染源等）造成的？

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一般可能是球菌或杆菌感染
可能原因很多
比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等
可以用以下方法排除：
将所有培养液都加在一个培养瓶培养
如果没有细菌生长就是操作的问题
如果有检查每种培养液、环境、培养瓶等情况
逐渐排出
应该可以解决污染问题

作者: 小野花 时间: 2012-9-26 11:08

又学到不少知识,谢谢!只是想问一下流式测细胞周期时如何进行血清饥饿,使细胞周期同步化?一般细胞种好后,就直接在相应的时间点收细胞,然后染色,上机检测.请详细解释一下.万分感谢!!!

作者: 小野花 时间: 2012-9-26 11:08

请教高手：
我将要培养角膜成纤维细胞，并用非甾体类药物对其进行干预，对其作用后的结果我应该从那几个方面来检测？

作者: qqq111 时间: 2012-9-26 11:11

请问各位：在用MTT实验测量抗癌药物的作用时，接种96孔板后，多长时间或者细胞达到多少融合后给药。还有在用流式细胞仪测量抗肿瘤药物的促凋亡作用时，给药的时机如何确定。谢谢各位！

作者: 大尾巴 时间: 2012-9-26 11:12

我做心肌细胞培养，研究细胞因子对其功能影响，可是在更换了无血清培养基后，细胞数量明显减少，生长状态不好。是不是一定要家胰岛素和转铁蛋白等物质啊~！我没有那么多钱啊。。。。。。：（

作者: 大尾巴 时间: 2012-9-26 11:13

我还有一个问题，请教各位，乳鼠心肌细胞培养离体研究，用IL-1刺激细胞，是用大鼠的还是用人的啊？？？

作者: 小糖块 时间: 2012-9-26 11:14

请问，分离细胞原代培养用的胶原酶是哪一型的？

作者: qqq111 时间: 2012-9-26 11:15

请问，分离细胞原代培养用的胶原酶是哪一型的？

————————————————————

这需要看你消化的什么组织了
对于结缔组织一般选用四型胶原酶

作者: qqq111 时间: 2012-9-26 11:16

请问各位：在用MTT实验测量抗癌药物的作用时，接种96孔板后，多长时间或者细胞达到多少融合后给药。还有在用流式细胞仪测量抗肿瘤药物的促凋亡作用时，给药的时机如何确定。谢谢各位！

————————————————————————————————————————————————————————

我是接踵细胞于96孔板的同时即加入药物，然后根据你的需要终止作用时间检测MTT A值。不知你是否有特殊要求！

作者: yonger 时间: 2012-9-26 11:17

有谁养过WI38细胞，我们从上海细胞所细胞库买的WI38长得很慢，会一个月了，还不能传代，于其他实验室的WI38的性状也大不相同。那位养过，能否传张照片上来？

作者: caihong 时间: 2012-9-26 11:19

我做的是子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离。另外，CD45细胞怎么分离呀？

作者: caihong 时间: 2012-9-26 11:20

我做的是子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离培养，可以用四型胶原酶吗？另外，请问子宫内膜的CD45细胞怎么分离呀？

作者: sunnyB 时间: 2012-9-26 11:21

有人说培养细胞用进口细菌培养皿，自己处理，可以代替进口细胞培养皿，以求降低成本，我认为此方法对于一般，特别是对研究生不是很好，往往因为这个原因，最好浪费好多时间，而得不偿失。
观点：用细菌培养皿代替细胞培养皿还需进一步研究！

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 11:22

我从未养过细胞，准备培养人外周血单个核细胞，并用某一抗原刺激其增殖，然后用刺激增殖后的细胞主要是CTL来杀伤CMV感染的成纤维细胞，MTT法测其杀伤率。
请问：
1、外周血单个核细胞及成纤维细胞是否都可以用PRMI1640培养基？或者有没有更经济实惠的适用培养基可用？
2、CTL杀伤细胞是MHC限制性的，国外文献一般都是取患者皮肤活检分离培养成纤维细胞作为靶细胞，而国内有篇报道是购买的人胚肺成纤维细胞作为靶细胞，请问是何原理？是否因为这种成纤维细胞可表达人类通用的MHC？
多谢各位老师指教！

作者: BUK 时间: 2012-9-26 11:23

这好像不可能，如果接种的细胞生长没有状态没有达到较好的状态，给药有何作用呢？在下冒昧问一句.

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 11:25

刚开始学分离细胞，需要用孔径40um的滤网，不知滤网怎么买，一些试剂公司都不卖这个，这个东西虽是很普通－不好意思问这么一个问题，但的确急需用。希望各位高手可以指点，提供线索，谢谢了！

作者: youyou99 时间: 2012-9-26 11:26

各个公司的细胞株也有差别，我们实验室有加拿大Microbix Biosystems公司及ATCC，还有其他一些地方的，加拿大Microbix Biosystems公司长的较好，易贴壁，所以细胞出处可能也很重要。

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 11:26

做原代培养怎么选胎牛血清，Hyclone有标准级，优等和特级的，这3种怎么选？

作者: yes4 时间: 2012-9-26 11:27

做原代培养怎么选胎牛血清，Hyclone有标准级，优等和特级的，这3种怎么选？

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我觉得用哪一种都可以，但是特级的肯定效果比标准级和优等的要好一些。我的经验是尽量用好一些的，因为如果培养细胞的活性好，以后的实验就好做一些。

作者: yes4 时间: 2012-9-26 11:28

做原代培养怎么选胎牛血清，Hyclone有标准级，优等和特级的，这3种怎么选？

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我觉得用哪一种都可以，但是特级的肯定效果比标准级和优等的要好一些。我的经验是尽量用好一些的，因为如果培养细胞的活性好，以后的实验就好做一些。

作者: gogo 时间: 2012-9-26 11:30

我们实验室主要的一种细胞就包括HEk293细胞。包括A、T及only，很好养啊。用玻璃培养瓶，DMEM高糖细胞培养基，另外加NaCO3 3.7g, pyruvic acid soduim 0.11g, HEPES 2.4g. 消化的话用胰酶就好了，不过我的经验是消化液过滤时一定要小心，容易污染。血清吗用Hyclone的。换液时很随便啦，贴壁的293是吹不下来的。留好种，双抗加不加无所谓

作者: 101010 时间: 2012-9-26 11:30

虑网在浙江上虞有生产的，具体实那个厂家我没有找着，我以前是打上虞的“114”查号台问的，你可以问筛网厂应该可以找到。你要是在北京我就可以帮你联系经销公司了。

作者: 北风那个吹 时间: 2012-9-26 11:30

请教各位高手：成纤维细胞有何特异的鉴定方法，急！！！

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 11:31

虑网在浙江上虞有生产的，具体实那个厂家我没有找着，我以前是打上虞的“114”查号台问的，你可以问筛网厂应该可以找到。你要是在北京我就可以帮你联系经销公司了。

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谢谢！我在这里问了一些仪器公司，说这些要大批量才好订。我只在学校买到了尼龙网，不知效果如何。

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 11:32

这种滤网分离细胞怎么操作呢？是放在滤器里吗？

作者: S6044 时间: 2012-9-26 11:32

有谁作过2阶段造血干细胞体外培养,很难养活,请高手指点

作者: loli 时间: 2012-9-26 11:33

哪位高手知道JEG-3人绒癌细胞株在哪可以买到？我做实验急需，但查了很多公司都没有卖的，希望得到大家的帮助。

作者: greenbee 时间: 2012-9-26 11:33

请教：子宫内膜细胞培养的有关知识？怎样消化和分离内膜组织？谢谢

作者: greenbee 时间: 2012-9-26 11:35

请教：子宫内膜细胞培养的有关知识？怎样消化和分离内膜组织？谢谢

作者: 阿司匹林 时间: 2012-9-26 11:35

请教：我养的是EPO细胞，最近我的细胞不知道为什么传过几次代后发现细胞内有较多黑色的颗粒，而且细胞也长的较瘦长，连刚复苏出来的也这样，这是为什么啊？

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-26 11:36

我是个新手，既往未做过试验，现在养原代血管内皮细胞，但在培养过程中反复遇到霉菌污染问题，试过用酒精和新洁尔灭试擦孵箱，但都不奏效，恳请各位师兄，师姐们不吝赐教，多谢了。

作者: 一叶 时间: 2012-9-26 11:38

我是个新手，既往未做过试验，现在养原代血管内皮细胞，但在培养过程中反复遇到霉菌污染问题，试过用酒精和新洁尔灭试擦孵箱，但都不奏效，恳请各位师兄，师姐们不吝赐教，多谢了。

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孵箱应定期用三氧机消毒或者紫外光照射
并酒精和新洁尔灭试擦孵箱
同时孵箱内的水应是三蒸水
排除孵箱因素后还有超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
每一步都要精益求精
才能避免污染

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-9-26 11:38

有谁能够讲讲血管内皮细胞培养方面的东西
谢谢

作者: TNT 时间: 2012-9-26 11:39

各位同仁，本人马上要进行细胞培养，可有些问题还没弄清，希望得到你们的帮助，在此先谢谢各位了！
1.药物的终浓度如何算？
2.各孔培养板具体用途？
3.培养板，培养皿，培养板在运用方面又有些什么不同，是否与培养的细胞种类有关？

作者: langlang 时间: 2012-9-26 11:39

谁也介绍一下肺毛细血管内皮细胞原代培养的方法。谢谢！

作者: 分子式 时间: 2012-9-26 11:40

C3A细胞到底是不是癌细胞？我觉得它有点象正常细胞？
其生长条件有什么要求？对氧，二氧化碳的要求是不是很高？
HepG2的基本资料有没有？
在那里可以查到相关的东西？

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请问在哪能买到C3A细胞，我在国内的几个细胞库都没有找到？

作者: 分子式 时间: 2012-9-26 11:40

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:
一、上皮细胞培养
上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。
体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。
以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。
2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。
3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。
4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。
6、反复吹打，制成悬液。
7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。
二、内皮细胞培养
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。
三、神经胶质细胞培养
神经细胞（神经元〕不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。

作者: 分子式 时间: 2012-9-26 11:41

养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。
5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。
四、肌组织培养
各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。
（－）骨骼肌细胞培养
1、出生1一2天的乳鼠，引颈处死。
2、无菌取大腿肌组织，切成0.3一0.5cm2小块后，用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。
3、计数调整细胞密度。
4、快接种量2×106/皿入培养基培养。
5、培养基内含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促进分化。
接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用Hanks液配成0.01%明胶。
该细胞接种率约50%，细胞生长开始呈纺锤形，培养50－52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。
（二）心肌细胞培养
心肌细胞是最早的培养材料，Carrel曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，最常用的是鸡胚心肌。
心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。
五、巨噬细胞培养
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。

作者: 分子式 时间: 2012-9-26 11:43

2、引颈处死小鼠。
3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。
6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
7、小心拔出针头，把液体注入离心管。
8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。
9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。
10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。
11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。
六、肾小球分离、移植培养
SD大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡1～2分钟，2次，置超净台内，打开腹腔取出肾脏剪碎，置含Hank’s液的无菌培养皿洗涤，置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网，滤过组织Hank’s液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，滤过物吸至200目不锈钢筛网，轻轻滤过，Hank’s液洗涤1次，收集网上肾小球，镜下观察为分离良好的肾小球。肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化20分钟，加血清终止胰酶反应，离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶，使肾小球大于60个/cm2，加培养基5～10ml（培养基组成：F12—3T3上清1：1；5%马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素5μg/ml；25ng/ml氢化可的松；5μg/ml转铁蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲状腺素0.02ng/ml；D-缬氨酸150ng/ml）肾小球培养8～10天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养24小时，形态学观察：细胞生长成单层多角型细胞，直径约100μm。
七、裸小鼠移植瘤单细胞分离培养
无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成1mm3小块，用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时，再加等体积0.2%胰酶消化5～8分钟，在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置（分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）来回推动注射器吹打组织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。常规方法接种培养收获细胞。

作者: 小糖块 时间: 2012-9-26 11:43

我是新手，从没做过细胞培养。正在准备做人外周血淋巴细胞培养，现在找到了两种培养介质的方案：
一种是：RPMI-1640
20% fetal bovine serum
56ml/L PHA
另一种是：RPMI-1640
20% heat-inactivated human AB serum
non essential amimo acid
100U/ml penicillin
100ug/ml streptomycin
2mM L-glutamine
1mM sodium pyruvate
10mM HEPES buffer
4ug/ml PHA
我要在淋巴细胞培养72h后，进行质粒转染。哪种方案更合理些？请高手赐教！

作者: bongte 时间: 2012-9-26 11:44

对于药物终浓度，一般来说如果用培养板培养最多加入液体量为2ml，而培养液多加入1ml，所以加入药物的量对培养液渗透压影响很大，因此多数加入50ul药物，然后根据加入药物的浓度除以1.05即得药物终浓度。
一般多用24孔培养板：如心肌细胞、神经细胞、甲状腺细胞、肝细胞等。要求细胞接种密度较大时多用6孔培养板，而测MTT多需96孔培养板。培养瓶多用于肿瘤细胞培养，或造缺氧复氧模型。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-26 11:44

细胞系或细胞株的建立

一、概念
1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。
2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
二、建立细胞系（或株）的要求
什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：
1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；
个体性别、年龄；取材的器官或组织。
如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。
2、细胞生物学检测：
了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。
如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。
3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。
三、若干细胞建株的要点及基本过程
（一）肿瘤细胞培养技术要点
1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。
2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。
排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。
3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率
根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-26 11:45

（二）人类淋巴母细胞建株方法
l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。
2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。
3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。
5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。
6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。
7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。
8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。
9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否换液，传代。
10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。

作者: 铜雀 时间: 2012-9-26 11:45

我觉得293细胞很好养，未发现脱落现象，培养基是高糖DMEM +10%胎牛血清（Gibco)，80%融合时传代，一般1瓶传3瓶，次日细胞贴壁，如果脱落，多半考虑是污染（细菌或别人包装的病毒）所致。

作者: feima+ 时间: 2012-9-26 11:46

我想请教各位大侠：如要做小鼠的外周血单个核细胞培养，怎样才能达到无菌操作取血；小鼠的血量又很少，取出后分离单个核细胞层是否比较困难。如不用外周血取材，而用脾脏取材可否？

作者: 二子 时间: 2012-9-26 11:46

请各位高手教我怎样培养大鼠心肌细胞

作者: 二子 时间: 2012-9-26 11:47

请各位高手教我怎样培养大鼠心肌细胞

作者: bongte 时间: 2012-9-26 11:48

我是新手，从没做过细胞培养。正在准备做人外周血淋巴细胞培养，现在找到了两种培养介质的方案：
一种是：RPMI-1640
20% fetal bovine serum
56ml/L PHA
另一种是：RPMI-1640
20% heat-inactivated human AB serum
non essential amimo acid
100U/ml penicillin
100ug/ml streptomycin
2mM L-glutamine
1mM sodium pyruvate
10mM HEPES buffer
4ug/ml PHA
我要在淋巴细胞培养72h后，进行质粒转染。哪种方案更合理些？请高手赐教！
这位仁兄,你的问题我给你一些我的建议:
从培养细胞角度来说,第二种方安要好.因为,淋巴细胞培养要求相对较高,因此,培养条件也要求较高.第二中方安中包含了细胞生长的较高要求条件,如谷胺酰氨,丙酮酸钠,植物细胞凝集素,灭活的人(AB型血 )血清,含有抗生素,缓冲盐HEPES,不知你加不加碳酸氢钠?另一个问题是,培养72小时细胞数量可能不够,你要想到.好了,有问题在交流.

作者: dongdongqiang 时间: 2012-9-26 11:48

本人正进行子宫内膜细胞的原代培养，以前没做过细胞培养，所以没什么经验。做了3次都没成功，细胞的贴壁能力极差。子宫内膜的间质细胞一般接种后3-4个小时即可贴壁，可我们的细胞几天后还没贴壁迹象。开始以为是胰酶消化时间过长，但后来消化时间缩为10min左右后，效果仍不好。我想可能是胰酶的问题。请各位高手帮忙分析分析，介绍一下经验。（我的细胞需要将腺上皮细胞和间质细胞分开分别培养）

作者: leifengta 时间: 2012-9-26 11:48

有没有老兄养过成年大鼠的心肌细胞??
我正在养,想做膜片钳.但是细胞在培养的第二天就没有了横纹.不知道是什么原因.
我用的培养基是DMEM/F12,20%的胎牛血清,HYCLONG的.没有横纹的细胞外形和折光都还好,就是细胞周围好像有东西漏出来.

作者: u234 时间: 2012-9-26 11:49

我想请教一下关于细胞培养的问题。我现在培养肾系膜细胞，但是发现肾小球贴壁很困难，时间也很长，并且贴壁后生长的细胞形态也有些含糊。有哪位师兄或者师姐，可以帮我分析一下呢？
肾小球的分离我用的是1型胶原酶。

作者: 987789 时间: 2012-9-26 11:50

从培养细胞角度来说,第二种方安要好.因为,淋巴细胞培养要求相对较高,因此,培养条件也要求较高.第二中方安中包含了细胞生长的较高要求条件,如谷胺酰氨,丙酮酸钠,植物细胞凝集素,灭活的人(AB型血 )血清,含有抗生素,缓冲盐HEPES,不知你加不加碳酸氢钠?另一个问题是,培养72小时细胞数量可能不够,你要想到.好了,有问题在交流.

我从没培养过细胞，现在的实验方案都是从已有的文献当中收集来的。很多文献都用的是第一种培养介质，而且只培养72h就做质粒的转染。如果每个实验对象采30ml血，要求每个实验对象的淋巴细胞培养后达到4 106个，能达到吗？？

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 11:50

紧急求助！
国内哪里可得到子宫内膜癌细胞株？如HEC-1-A,HEC-1-B,Ishikawa等，花钱也可。请各位前辈，朋友指点迷津，不胜感激。

作者: gogo 时间: 2012-9-26 11:51

请教各位高手：成纤维细胞有何特异的鉴定方法，急！！！

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依赖细胞形态学,免疫组化染色,染色体观察法,即培养的细胞成梭形,胞浆内波形蛋白阳性,能合成1,3型胶原蛋白以及粘连蛋白，正常二倍体。必要时用右旋頡氨酸培养基选择性培养。一般用细胞形态学观察和胞浆内波形蛋白阳性指标。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-26 11:51

请问，哪里有菜青虫细胞系？

作者: 二子 时间: 2012-9-26 11:52

我认为塑料培养皿如果经紫外线照射时间过长容易变黄且底面容易损坏，我的体会以半个小时至一个小时为易。

作者: 二子 时间: 2012-9-26 11:52

请问人的平滑肌细胞系，最好是血管的，谁有，谢谢！
aiweibin@fmmu.edu.cn

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我也是做血管平滑肌细胞培养的。据我所知，国内没有卖的。可以从国外进口，价格也比较昂贵，大约需要6000~7000人民币。你如果有足够的经费可以考虑找公司购买。
cuturl('http://bionon.nease.net') E-MAIL:weiquolu@371.net(鲁先生）

作者: 二子 时间: 2012-9-26 11:52

我想请教各位高手：从哪里可以买到血管紧张素-II和白介素-I（试剂），我是造模型用的。
盼望各位高手指教！

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-9-26 11:53

选用小鼠脾脏淋巴细胞也可以，就是做起来稍微麻烦一点，要把脾脏研碎
过钢网，血淋巴细胞就没有这么麻烦，我是用脾脏做的，得到的淋巴细胞也很多的。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-9-26 11:54

请教各位高人：
本人想做胎肺原代培养，请问是否有成熟的培养方法，步骤如何，预算大概多少，是否可行？

作者: milkdog 时间: 2012-9-26 11:54

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大,还是贴壁,请问为什么,怎样处理?

可以加完胰酶后将培养瓶放在37度2分钟左右，拿出来轻轻晃晃，效果很不错的哟！

作者: wsll 时间: 2012-9-26 11:55

我的细胞培养液变浑浊了，可能是细菌污染，相差显微镜下可以见到细小的颗粒状物质，开始还以为是细胞碎片，但细胞同时也在生长，这样的细胞可不可以用来实验呢

作者: zzzz 时间: 2012-9-26 11:55

我的细胞培养液变浑浊了，可能是细菌污染，相差显微镜下可以见到细小的颗粒状物质，开始还以为是细胞碎片，但细胞同时也在生长，这样的细胞可不可以用来实验呢

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我养细胞时发生过这种情况。但培养液没有象污染时那样浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多。但一旦发生这种情况，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。用这种细胞作实验好象也会影响实验结果吧！要是还有细胞株，我觉得还是再复苏一个细胞株吧。不过在复苏前最好找到发生这种情况的原因。我上次最后怀疑是血清的原因。另外你可以在镜下仔细观察以下看那些点状物是不是在动，如果是，则有可能是原虫污染了，他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-26 11:56

我已经把那些细胞都扔掉了，不然看着心烦。但是也不敢再随便复苏了，因为没有经验，细胞株已经快被我挥霍没了。我又用别的细胞试了试，这次没有污染，我怀疑是我操作的时候不小心污染的，一次传代太多。我的培养液被我过滤了两次，也许双抗失效了也不一定。

作者: yonger 时间: 2012-9-26 11:56

也可以在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。或者用几个大玻璃培养皿乘放，定期补充消毒的蒸馏水，以补充蒸发量。

作者: nn255 时间: 2012-9-26 11:57

本人才开始预备试验,老板同意随便养点细胞就可以了,主要是建立无菌习惯,熟悉过程.一切都由自己安排.这样一来,我太为难了.没有要求就是瞎干了!哪位高手指点一二,养细胞需要什么器械、试剂、条件？

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-26 11:57

本人才开始预备试验,老板同意随便养点细胞就可以了,主要是建立无菌习惯,熟悉过程.一切都由自己安排.这样一来,我太为难了.没有要求就是瞎干了!哪位高手指点一二,养细胞需要什么器械、试剂、条件？

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如果是刚开始培养细胞,最好是去找本"细胞培养"的专业书看看,不是在这里请教几个关于器械\试剂\条件的问题就可以解决的,养细胞不是件简单的事情.建议你最好看一下司徒振强编的<细胞培养>一书,该书对关于细胞培养相关知识讲的比较详细!
祝你好运!

作者: 中国特色 时间: 2012-9-26 11:58

请问有谁知道培养DC2的体系吗？我怎么样才能得到一定数量的DC2呢？
还有刺激树突状细胞成熟用的是CD40L转染的淋巴细胞，请问为什么不能用纯化的rhCD40L因子呢？两者有区别吗？

作者: nn255 时间: 2012-9-26 11:58

哪位有经验的前辈知道玻璃培养瓶大概能用多少次？来回刷洗对细胞生长影响大吗

作者: 969 时间: 2012-9-26 11:59

请问0.25%的胰蛋白酶怎么配,是用双蒸水配,PBS配,还是用Hanks液配,或者别的?

作者: windy+++ 时间: 2012-9-26 11:59

请问0.25%的胰蛋白酶怎么配,是用双蒸水配,PBS配,还是用Hanks液配,或者别的?

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要用PBS配

作者: junhun 时间: 2012-9-26 12:01

细胞贴壁不好的原因有那些

作者: bongte 时间: 2012-9-26 12:01

玻璃培养瓶，可以用很多次，只要洗干净，注意消毒就没有问题。

作者: bongte 时间: 2012-9-26 12:02

胰酶最好购买已经配置好的，这样免去自己配置的麻烦，另外需要多少就买多少，我们实验室一直购买现成的胰酶100ml是￥40元，建议您找相关厂家购买。

作者: loli 时间: 2012-9-26 12:03

我是细胞培养的新手，目前正在自学章静波老师主编的《组织和细胞培养技术》，哪位仁兄见过辛华老师主编的《细胞生物学实验》，感觉如何？哪里有？谢谢！

作者: loli 时间: 2012-9-26 12:03

请教：EDTA2na和EDTA4na在使用时应注意什么？这两者在培养体系中有什么区别？

作者: loli 时间: 2012-9-26 12:04

如果是刚开始培养细胞,最好是去找本"细胞培养"的专业书看看,不是在这里请教几个关于器械\试剂\条件的问题就可以解决的,养细胞不是件简单的事情.建议你最好看一下司徒振强编的<细胞培养>一书,该书对关于细胞培养相关知识讲的比较详细!
祝你好运!

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谢谢你的关照，我手头现在只有一本章静波老师编写的《组织和细胞培养技术》，前一段时间还看了杨志明老师写的《组织工程》。感觉收获挺大，所以也推荐给其他和我一样的新手哦。

作者: wu11998866 时间: 2012-9-26 12:04

取乳鼠海马神经干细胞，培养单个细胞。过滤后仍有很多组织碎片，怎么处理？
是否离心？

作者: nn255 时间: 2012-9-26 12:05

以前做细胞培养时有过同样的经历，如果在显微镜下可以见到有黑点运动，可能是黑焦虫（大概是这个名字，因为时间长了我有些淡忘了，呵呵）污染。办法好象不多，一般是因为血清问题引起的。————————————————————————————————————————————————————————————————

我的细胞培养液变浑浊了，可能是细菌污染，相差显微镜下可以见到细小的颗粒状物质，开始还以为是细胞碎片，但细胞同时也在生长，这样的细胞可不可以用来实验呢

作者: nn255 时间: 2012-9-26 12:05

在培养箱的托盘加入少量的硫酸酮也可以起到防止霉菌污染的作用。不过最重要的当然还是要注意无菌观念的养成。另外注意定期用紫外灯对培养箱进行照射也很重要。
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也可以在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。或者用几个大玻璃培养皿乘放，定期补充消毒的蒸馏水，以补充蒸发量。

作者: nn255 时间: 2012-9-26 12:06

分享到哪里？复制网址新浪微博豆瓣社区腾讯微博开心网人人网用PBS，去离子水或生理盐水都可以的。————————————————————————————————————————————————————

请问0.25%的胰蛋白酶怎么配,是用双蒸水配,PBS配,还是用Hanks液配,或者别的?

作者: nn255 时间: 2012-9-26 12:06

请问0.25%的胰蛋白酶怎么配,是用双蒸水配,PBS配,还是用Hanks液配,或者别的?

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我见过的材料介绍说用不含钙、镁的D-hanks液配制。

作者: misswu61 时间: 2012-9-26 12:24

用PBS或者D-Hanks液配都可以的

作者: biabiade 时间: 2012-9-26 12:25

各位，麻烦能否告诉我Von kossa染色的具体步骤。不胜感激。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-9-26 12:25

0.25%胰酶用D-Hanks液配，还可以与EDTA(0.02%)1:1混合配制。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-26 12:26

请问，何处能购得D-valine?

作者: misswu61 时间: 2012-9-26 12:26

胰酶我们买的是现成配置好的液体，一般情况下胰酶用的是HANKS配置，不过为什么不直接买现成的呢？我们实验室一直是这样用的，100ml才40元人民币，这样用起来很方便啊！

作者: 大尾巴 时间: 2012-9-26 12:28

过几天我就要养K562/A02耐药细胞了，不知哪位养过此细胞，用的什么培养液？国产还是进口？胎牛还是小牛？培养此细胞应该注意什么问题？跟普通的K562有什么区别？麻烦各位说说经验！不胜感激！鞠躬！

作者: DONT 时间: 2012-9-26 12:29

请问在做UVB照射皮肤损伤的课题中，选用什么细胞株比较合适。谢谢

作者: fox_79 时间: 2012-9-26 12:29

我的肺癌细胞，原来还好好的，可是不知是否是因为这阵子对他不够关心，（好象没有啊），还是因为它自己的身体不大好的问题，感觉体重是越来越轻了，而且，传代消化后，细胞甚至不圆啊。哪位是否有同样的经历？我还有希望吗？重新复苏本来是好，可是，问题是我的细胞复苏就更有问题了，它就不沉下去，全是淹死的！

作者: loli 时间: 2012-9-26 12:30

各位学长的水平太高了,对我等新手来说深奥了点,有没有培养人表皮细胞和成纤维细胞的,给点经验,我的成纤维细胞总做不出来,痛苦,大体步骤如下,各位高手看看哪一步不对,望不吝赐教!
表皮细胞:小儿包皮0.25%胰酶冷消化9h,撕下表皮(真皮继续消化30m),pbs冲洗,入小瓶剪碎成糊状,注入DMEM,振荡45m后,过滤,离心1000r/m10m,去上清,表皮培养液打碎细胞团快,一次性培养皿培养.
成纤维细胞:pbs洗,入小瓶,剪碎,吸两滴做组织块法,2h贴壁后加入DMEM;余者加DMEM,振荡45m后,加胶原酶200 U/ml,消化3h(需不需振荡?),此后同表皮细胞,不过培养基改为DMEM.
我的问题是:不知胶原酶消化多长时间合适,3H or 更多?我曾消化过8h,但过滤时仍没有细胞,何故?
如果排除操作失误,此步骤哪里有误?望各位学长指正!!感激不尽!

作者: daod 时间: 2012-9-26 12:30

各位大侠，请问要使原代细胞永生化，有哪些方法可以达到？希望不吝赐教！！

作者: 吴才子 时间: 2012-9-26 12:31

请教关于细胞复苏的问题。
细胞冻存时间：7月份
细胞类型：PA317细胞
复苏过程：从液氮中取出，用冰盒转移到实验室（约10分钟）。放入37℃水浴，
融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。
按此过程复苏了两次，第一次下午3点复苏，第二天上午10点观察细胞已死，
无贴壁，液体中有细胞碎片漂浮。第二次有个别细胞贴壁，两周后观察细胞
不大长。现实验停滞，不胜烦恼。不知复苏过程有何问题？
初来乍到，惭愧之至，切盼各位高手不吝赐教。

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-26 12:31

我想请教一个问题,细胞培养有没有时间限制,比如说超过一定时间,细胞的代谢就会受到抑制,而使细胞凋亡或裂解.还有,细胞的最适生长条件要包括那些方面?

作者: 911 时间: 2012-9-26 12:31

请教一下神经细胞的培养：
我曾用0.25%胰酶消化5MIN，10%胎牛培养，1000—-1500转/MIN 离心，多聚赖氨酸铺底，但有大量细胞，但不贴臂。
也用0.1255胰酶消化20MIN，10%胎牛培养，1000—-1500转/MIN 离心，但好象都是胶质细胞和成纤维细胞
神经细胞培养要注意什么？

作者: yes4 时间: 2012-9-26 12:32

请教各位前辈：本人近期刚刚开始培养乳鼠的心肌细胞，但心肌细胞中混有很多血细胞，无法去除，不知该如何办？此外，请教一下各位，一窝乳鼠大概能培养出多少的心肌细胞，你们采用何种离心速度，能使细胞尽量被收集下来，但又不至于破坏细胞，使细胞被打成碎片。倘若要使六孔板中的细胞融合成细胞团，需多少接种密度？万分感谢！

作者: 阿敏 时间: 2012-9-26 12:32

腹腔巨噬细胞培养一天后，贴壁很紧，怎么才能弄下来？胰酶用过不行，冷冻方法也试，有点作用，但不完全下来。刮芍没试过，怕有损细胞。不知有人做过吗，有好的办法吗？

作者: DDD 时间: 2012-9-26 12:33

我的肺癌细胞，原来还好好的，可是不知是否是因为这阵子对他不够关心，（好象没有啊），还是因为它自己的身体不大好的问题，感觉体重是越来越轻了，而且，传代消化后，细胞甚至不圆啊。哪位是否有同样的经历？我还有希望吗？重新复苏本来是好，可是，问题是我的细胞复苏就更有问题了，它就不沉下去，全是淹死的！

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我想这位朋友没把问题说明白，感觉体重是越来越轻了？它就不沉下去，全是淹死的！？什么意思？偶不懂了！！！

作者: DDD 时间: 2012-9-26 12:33

各位学长的水平太高了,对我等新手来说深奥了点,有没有培养人表皮细胞和成纤维细胞的,给点经验,我的成纤维细胞总做不出来,痛苦,大体步骤如下,各位高手看看哪一步不对,望不吝赐教!
表皮细胞:小儿包皮0.25%胰酶冷消化9h,撕下表皮(真皮继续消化30m),pbs冲洗,入小瓶剪碎成糊状,注入DMEM,振荡45m后,过滤,离心1000r/m10m,去上清,表皮培养液打碎细胞团快,一次性培养皿培养.
成纤维细胞:pbs洗,入小瓶,剪碎,吸两滴做组织块法,2h贴壁后加入DMEM;余者加DMEM,振荡45m后,加胶原酶200 U/ml,消化3h(需不需振荡?),此后同表皮细胞,不过培养基改为DMEM.
我的问题是:不知胶原酶消化多长时间合适,3H or 更多?我曾消化过8h,但过滤时仍没有细胞,何故?
如果排除操作失误,此步骤哪里有误?望各位学长指正!!感激不尽!

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小儿包皮细胞我没做过，只能通过其他细胞的经验来讲，看看下面的因素：1、剪碎的过程：尽量剪碎，后加消化液，吹打几下，然后在显微镜下观察看看剪切效果？一般现在看到的细胞都是死细胞！！
2、胶原酶消化还是振荡比较好，如果不放心，可以分多次消化，以避免消化液对细胞的影响。
3、消化液是不是有问题？失效？

作者: DDD 时间: 2012-9-26 12:34

我想请教一个问题,细胞培养有没有时间限制,比如说超过一定时间,细胞的代谢就会受到抑制,而使细胞凋亡或裂解.还有,细胞的最适生长条件要包括那些方面?

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细胞系一般问题不大，从原代培养的细胞，一般有一个界限－harfflick（可能拼错了）界限，这个与组织年龄有关，更多请看细胞生物学教科书！

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-9-26 12:34

Re:腹腔巨噬细胞培养一天后，贴壁很紧，怎么才能弄下来？胰酶用过不行，冷冻方法也试，有点作用，但不完全下来。刮芍没试过，怕有损细胞。不知有人做过吗，有好的办法吗？

你可以用新鲜配制的浓度高一点的胰蛋白酶（0.25）加上EDTA一起，放置于温箱中消化，应该没有问题能消化下来的，还没听说过有不能消化下来的细胞。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-9-26 12:35

Re:peggy
待心肌细胞贴壁后，用PBS冲洗掉红细胞即可，其实在原代培养的过程中能洗掉大量的红细胞的。一窝乳鼠可不确定多少只，大概是十只左右能做1~2瓶左右吧，看技术了（一次做20只左右的乳鼠可能能得到4瓶左右，十只就比较少了，而且得注意别消化过度了）。一般采用1000-1500转/分，5-8分钟即可，这得根据不同的离心机的离心力大致计算了。各人采取的具体方法不同，很难说需要多少的接种密度，我当时大概是10只能做一块六孔板吧，不过你还得自己摸索一下。消化也是一个关键问题，别消化过了，要不心肌细胞不搏动了。

作者: 2541 时间: 2012-9-26 12:35

提高病毒滴度乒乓的方法是什么方法，让俺也长长见识

作者: 月牙牙 时间: 2012-9-26 12:36

21日下午我给我的细胞加了培养液，m199，在小培养皿里生长，明天观察，现在向各位请教如何判断我的细胞在正常增殖？我的细胞是颗粒细胞．谢谢！

作者: greenbee 时间: 2012-9-26 12:36

请教关于细胞复苏的问题。
细胞冻存时间：7月份
细胞类型：PA317细胞
复苏过程：从液氮中取出，用冰盒转移到实验室（约10分钟）。放入37水浴，
融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。
按此过程复苏了两次，第一次下午3点复苏，第二天上午10点观察细胞已死，
无贴壁，液体中有细胞碎片漂浮。第二次有个别细胞贴壁，两周后观察细胞
不大长。现实验停滞，不胜烦恼。不知复苏过程有何问题？
初来乍到，惭愧之至，切盼各位高手不吝赐教。

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首先,复苏药求快速,所以你不能用冰盒转移,应该从液氮取出后直接放入37℃中,可以放在水中(37℃或水温高些)运输.
其次复苏后要在复苏后4-6小时换液,防止细胞冻存液去除不干净所带成分影响细胞生长.

作者: rxcc33 时间: 2012-9-26 12:37

我最近发现同时给原代培养的细胞和细胞系传代和换液，结果细胞系中出现的死细胞明显比原代的多，不知是为什么

作者: 987789 时间: 2012-9-26 12:37

没有比293更好养的细胞了
介绍以下我的程序，如果我不是这样做的天打雷劈
培养基；GIBCO DMEM粉剂，加双抗，HEPES，NaHCO3
培养瓶；Coring
传代：倒去废液，PBS洗二次，胰蛋白酶（小瓶1ML，大瓶2ML）处理5分钟，需拍打一下。加PBS5-10ML，离心1000转3MIN，加2ML培养基重悬，取0。3毫升到小瓶，0。5毫升到大瓶。瓶子可以不丢，重复使用，就是把酶解后的瓶子用PBS洗两次。我已经重复使用2个月了。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-26 12:38

请教关于细胞复苏的问题。
细胞冻存时间：7月份
细胞类型：PA317细胞
复苏过程：从液氮中取出，用冰盒转移到实验室（约10分钟）。放入37水浴，
融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。
按此过程复苏了两次，第一次下午3点复苏，第二天上午10点观察细胞已死，
无贴壁，液体中有细胞碎片漂浮。第二次有个别细胞贴壁，两周后观察细胞
不大长。现实验停滞，不胜烦恼。不知复苏过程有何问题？
初来乍到，惭愧之至，切盼各位高手不吝赐教。——————————————————————————————————————————

首先,复苏药求快速,所以你不能用冰盒转移,应该从液氮取出后直接放入37℃中,可以放在水中(37℃或水温高些)运输.
其次复苏后要在复苏后4-6小时换液,防止细胞冻存液去除不干净所带成分影响细胞生长.

作者: 园丁## 时间: 2012-9-26 12:38

复苏求快没什么可说的，一般讲要求复苏的细胞在一分钟内迅速解冻，所以同意楼上解冻后再运输的做法。
但是要求4－6小时换液，偶不敢苟同。一般复苏细胞4小时才开始贴壁，若细胞状态不好，自然此时贴壁细胞较少，怎能换液？一般复苏时加10－20冻存液的培养液，原冻存液对细胞影响不大，可以24小时后换液，当然若细胞贴壁较好，也可及时换液。若为去除冻存液影响，可低速离心去除冻存液，再用培养液重复一次。

作者: rxcc33 时间: 2012-9-26 12:39

还想再问一句，楼上兄说的低速离心去除冻存液，是1000转5min吗？再用培养液重复一次是什么意思？不吝赐教。

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-26 12:39

我的细胞刚做出时,镜下满眼都是细胞,可24h后,贴壁者寥寥,请问如何在普通倒置显微镜下鉴定死细胞与活细胞?死细胞除了轮廓增强,胞质中出现黑色颗粒外,还有哪些特征?另外,今天观察培养液混浊,镜下呈细沙状,模糊不清,初步判断为细菌污染,已弃掉,重做,想请教一下胶原酶的浓度200U/ml,如何掌握?先谢谢啦

作者: greenbee 时间: 2012-9-26 12:40

楼上群友你好！谢谢你的回复，还有几个问题想请教一下。在原代培养过程中如何洗去血细胞，我每次离心下来离心管底都有很明显的血细胞沉淀，不知如何去掉，想用破血细胞的方法，不知会不会对心肌细胞有影响？还有，不知你消化细胞时细胞团有没有变得很粘，我用的是0.125％的胰酶，加了DNase，但照例很粘。这算不算消化过度，我用过0.06％的胰酶，也会变得很粘。你接种时有没有碰到细胞聚集到孔中心的现象，该如何解决呢？我的心肌细胞现在会跳，但好似上面覆盖了很多圆形的细胞，显得很杂，不知是怎么回事？顺便请教一下，用什么样的装置给心肌细胞保温比较经济又实用（目前有些商品化的保温装置，我怀疑到时焦距会调不好，太厚了）。

作者: DDD 时间: 2012-9-26 12:40

如果使用多聚赖氨酸处理盖玻片后，进行细胞爬片，这样爬上去的细胞可否经得住做原位杂交，因为做原位杂交要用胃酶或者微波等处理，请问那位做过？

作者: windy+++ 时间: 2012-9-26 12:43

我的细胞刚做出时,镜下满眼都是细胞,可24h后,贴壁者寥寥,请问如何在普通倒置显微镜下鉴定死细胞与活细胞?死细胞除了轮廓增强,胞质中出现黑色颗粒外,还有哪些特征?另外,今天观察培养液混浊,镜下呈细沙状,模糊不清,初步判断为细菌污染,已弃掉,重做,想请教一下胶原酶的浓度200U/ml,如何掌握?先谢谢啦

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贴壁不好的原因一般有两方面的考虑：一是细胞本身的原因，细胞状态不好，我现在的判断标准和你上面提到的基本相同，其实普通的消化传代细胞肯定会死掉一部分，关键是活着的细胞可以继续增殖传代！
二是培养环境的问题,包括培养液，培养瓶等因素。

胶原酶的配制需要看你的说明书，不同纯度的配制不一样的！

作者: 131415 时间: 2012-9-26 12:45

前一阵做的不太理想,我现在想缓缓,重新思考一下,多看看各位高手的经验,争取再做时一步到位,我的胶原酶不多了,乖乖,这东西死贵,浪费不起啊,真的很茫然啊,好在这里还有高人可以指点一下,我不敢麻烦导师她老人家呀,见笑了!

作者: 131415 时间: 2012-9-26 12:47

前一阵做的不太理想,我现在想缓缓,重新思考一下,多看看各位高手的经验,争取再做时一步到位,我的胶原酶不多了,乖乖,这东西死贵,浪费不起啊,真的很茫然啊,好在这里还有高人可以指点一下,我不敢麻烦导师她老人家呀,见笑了!

作者: gogo 时间: 2012-9-26 12:48

我正在进行大鼠骨骼肌原代培养,目前出现了培养的细胞不能被胰酶+EDTA消化的情况,以至于我不能对我的细胞进行传代和收集冻存,也无法进行以后的实验.我试国不同浓度的胰酶和不同批次的产品,均无效.希望大家给我点建议.

作者: yychen 时间: 2012-9-26 12:49

有从骨髓干细胞中培养出内皮前体细胞的前辈吗？晚辈诚恳请教这方面的问题，包括：可行性，方法，应用前景等。

作者: birdfish 时间: 2012-9-26 12:50

那位老兄做过兔子的血管内皮细胞，能指教指教吗？
我现用胶原酶消化法
可细胞到第二天，总是死光光
减少消化时间又不行
真是快疯了

作者: 莲花白 时间: 2012-9-26 12:51

求助：我要把质粒大量的扩增，那位仁兄仁姐能告诉我，我应该选择什么样的细胞系？应该用什么办法去转染？谢谢！

作者: bling 时间: 2012-9-26 12:51

请教：兔胆管平滑肌的原代培养
我现在用胶原酶1消化，但是成功率低，效果不好，
平滑肌的消化是否可以用胶原酶1？
如何可以使其贴壁？

作者: biabiade 时间: 2012-9-26 12:52

紧急求助！
有没有哪位大侠有比较好的破碎细胞的方法？本人要测定细胞内一氧化氮合酶量，不能用反复冻融的方法。
希望得到大家的帮助！

作者: biabiade 时间: 2012-9-26 12:52

那位老兄做过兔子的血管内皮细胞，能指教指教吗？
我现用胶原酶消化法
可细胞到第二天，总是死光光
减少消化时间又不行
真是快疯了

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我做的是兔子的血管平滑肌细胞，用1型胶原酶消化也是很难摸浓度。最后改用贴块法做的。

作者: dongdongqiang 时间: 2012-9-26 12:54

紧急求助！
有没有哪位大侠有比较好的破碎细胞的方法？本人要测定细胞内一氧化氮合酶量，不能用反复冻融的方法。
希望得到大家的帮助！

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超声波破碎

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-26 12:55

请问与植物细胞培养相比，动物细胞培养有什么区别和特点么？

作者: S6044 时间: 2012-9-26 12:56

超声波破碎

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具体参数是多少？烦请指教！多谢！

作者: yhz1973 时间: 2012-9-26 12:57

我用培养瓶带回来的瘤细胞长势良好，但用我自己的培养液传代后细胞全死了，我想应该是血清生产厂家不同引起的吧，因为我养我自己的细胞没什么问题的。但我不知道除过这个原因，还会有那些原因会导致细胞死亡？细胞经培养瓶运输带回来后，应该做何处理才能使它适应新的培养液？谢谢各位指点！！

作者: 阿k 时间: 2012-9-26 12:57

我把培养瓶内的细胞消化后用PBS洗，结果第一遍细胞粘乎乎的，第二次干脆怎么也离不出细胞来了，镜下也找不到了。不知有谁遇到这种情况没有，应该是PBS的问题还是消化时间过长了呢

作者: kuohao17 时间: 2012-9-26 12:58

我养的骨髓间充质干细胞才接种3、4天（换液1、2次）后几乎不再生长，不知是何原因（远未长满）？

作者: zhezhe 时间: 2012-9-26 12:58

我在养牙髓细胞，一个克隆形成能力非常低的细胞，稀释到一定密度后基本停止生长，因此很难得到它的单细胞克隆，因此我想加入饲养层，不过我手头上现在没有3T3细胞，不知道用其他的成纤维细胞可以么？
另外：有什么其他的方法可以增加细胞的克隆形成能力么？

多谢

作者: zhezhe 时间: 2012-9-26 12:59

我把培养瓶内的细胞消化后用PBS洗，结果第一遍细胞粘乎乎的，第二次干脆怎么也离不出细胞来了，镜下也找不到了。不知有谁遇到这种情况没有，应该是PBS的问题还是消化时间过长了呢

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应该是细胞碎了,细胞核内的DNA出来了,是消化的问题

作者: @STAR@ 时间: 2012-9-26 13:00

我准备做人外周血树突状细胞的培养，希望各位介绍一下有关的注意事项

作者: caihong 时间: 2012-9-26 13:01

请问你传代时为什么不用EDTA？
据我所知EDTA传代时鰲合Ca、Mg离子，对细胞损伤较小，尤其是细胞表面抗原，在测细胞表面抗原时我一般用0.04%EDTA 37度消化25分钟左右，效果不错。

作者: cocacola 时间: 2012-9-26 13:02

谁养过MCF-7细胞吗？我刚从上海买回的细胞，可细胞长得非常慢，每天都有一层死细胞？是怎么回事？希望各位高手不吝赐教！

作者: superboy 时间: 2012-9-26 13:03

还想请教一下各位养细胞的前辈，我想记录心肌细胞搏动的频率、振幅，用什么样的仪器比较方便，不知目前市场上有没有能记录心肌细胞搏动的光电换能装置。

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-26 13:05

我也很想知道你说的那些。可能有比较好的显微镜和摄像头以及图像处理系统，可以考虑采用视频捕获法记录心肌细胞搏动的频率和振幅，但是那是图像，我还想不出是否能有软件记录其频率和振幅的定量方法。你要有什么新招，一定告诉我，咱们可以好好切磋一下。

作者: birdfish 时间: 2012-9-26 13:05

据我养间充质干细胞的体会，第一次接种24小时后，观擦细胞情况，看细胞贴壁如何，再去悬浮。先不要着急换液，如果细胞没长起来的话，培养液的消耗很少的

作者: ALALA 时间: 2012-9-26 13:06

请教关于细胞复苏的问题。
细胞冻存时间：7月份
细胞类型：PA317细胞
复苏过程：从液氮中取出，用冰盒转移到实验室（约10分钟）。放入37水浴，
融化后取出，未离心，将液体转移至培养瓶中。
按此过程复苏了两次，第一次下午3点复苏，第二天上午10点观察细胞已死，
无贴壁，液体中有细胞碎片漂浮。第二次有个别细胞贴壁，两周后观察细胞
不大长。现实验停滞，不胜烦恼。不知复苏过程有何问题？
初来乍到，惭愧之至，切盼各位高手不吝赐教。

1、复苏要求快速,书上一般采用将细胞冻存管从液氮取出后直接放入37℃水浴中,但冻存管内温度肯定达不到37℃，文献上有报道可以放在水中50-60℃水浴中约1分钟.
2、冻存液多用DMSO，在常温时对细胞有害，而在4℃几乎无害，帮我采用冻存管在水浴中还有少许冰块时就取出水浴，酒精擦洗瓶口后吸至离心管加入冷培养液低速离心后弃上清再加入培养液。复苏后细胞一般不到一天就可贴壁，细胞活力还不错。

作者: superboy 时间: 2012-9-26 13:07

另外骨髓间充质细胞贴壁牢不牢固？我今天在第二次换液（距接种5天）时，因为觉得培养瓶壁上有较多的圆形死细胞（胞内有很多空泡）贴俯，想把它们冲洗掉，结果冲洗换液完发现培养瓶里几乎看不到任何细胞。换液时是不是不能冲洗得太厉害？还有我发现初次换液后骨髓间充质细胞状态不好（胞内有空泡），不知道是什么原因？请各位高手指教，谢谢！

作者: yychen 时间: 2012-9-26 13:08

引产胎儿的组织做细胞培养，一般能养活吗？

作者: 987789 时间: 2012-9-26 13:09

QUOTE:

原帖由 yychen 于 2012-9-26 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
引产胎儿的组织做细胞培养，一般能养活吗？

1.最好在引产4小时内取材
2.最好水囊引产。药物引产不一定成功。

作者: 生物迷 时间: 2012-9-26 13:09

我用培养瓶带回来的瘤细胞长势良好，但用我自己的培养液传代后细胞全死了，我想应该是血清生产厂家不同引起的吧，因为我养我自己的细胞没什么问题的。但我不知道除过这个原因，还会有那些原因会导致细胞死亡？细胞经培养瓶运输带回来后，应该做何处理才能使它适应新的培养液？谢谢各位指点！！

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我认为不是血清的原因（至少不是主要原因）。
因为在运输过程中一般是用培养基充满培养瓶的，这时细胞处于类似缺氧休眠状态，所以回来后一般不要急于换液，而是吸出多余的培养基（这些培养基还可以用！），余下正常培养时所需要的培养的量（千万不要用PBS洗！因为这里边还有一个培养基同化的过程），进行培养，等一天后宝贝细胞“醒”过来后再换液。

作者: bling 时间: 2012-9-26 13:10

请问有没有养过新生大鼠视皮层的，请教诸位可用些什么样的培养基，用trpsin消化合适吗，还是用papain的好？为什么我培养的时候总觉得杂质（可能是死细胞）挺多，我用的是MEM/F12加５％HS,10%FBS，换液用MEM/F12/N２　但就觉得细胞的状态不好，总有一团一团的絮状物飘在上面，但也不漂动，（但肯定不是污染）而且常附在神经元的胞体上，无法清楚观察．换液也不太有用．不如用胎鼠的效果好，诸位有何建议，谢谢！！！

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-26 13:11

我用Gibco无血清培养液(defined keratinocyte-SFM)培养人角质形成细胞，原代培养非常漂亮，但很难传代，请诸位老师指点迷津，致谢！

作者: 生物迷 时间: 2012-9-26 13:11

我用Gibco无血清培养液(defined keratinocyte-SFM)培养人角质形成细胞，原代培养非常漂亮，但很难传代，请诸位老师指点迷津，致谢！

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一般取自成人的组织都很难传代，如果是取自胚胎，可以传有限的代数。

作者: bgf5 时间: 2012-9-26 13:12

大家好！看了你们的帖子，学了不少，我是新手，现在要养淋巴细胞（甲状腺内），不知如何养？请各位高手前辈指教！

作者: langlang 时间: 2012-9-26 13:12

请问如何培养卵巢颗粒细胞？

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-26 13:13

我从贫血病人的骨髓细胞中分离单个核细胞培养，遇到一些问题：
1、以Ficoll分离单个核细胞，但总有一些红细胞搀杂在单个核细胞里无法去除，我就再加入红细胞裂解液，最后以PBS洗。请教：这样对单个核细胞的生长有无影响，能否直接加入红细胞裂解液以去除红细胞？
2、我用GIBCO的STEMPRO无血清培养液培养，但细胞的生长状态非常不好，是否与未加入生长因子有关？

作者: BUK 时间: 2012-9-26 13:13

有没有做淋巴细胞增殖实验的前辈?请介绍一下经验
谢谢

作者: 987789 时间: 2012-9-26 13:14

求购国产层粘连蛋白和纤维粘连蛋白。或请告知联络方法。谢谢

作者: sunnyB 时间: 2012-9-26 13:15

本人最近急需NRK细胞，买了几次都养不好，以前都很好养的呀，估计是买来的细胞株有问题，谁有呀，救救急吧，已经耽搁了一学期了，等不起呀，都要喊救命了！

作者: wmp1234 时间: 2012-9-26 13:16

加入红细胞裂解液对BMNC没太大影响，如不加入RBC裂解液那些红细胞也会慢慢死去。

作者: langlang 时间: 2012-9-26 13:17

我也在养293细胞，我感觉不是很难养的，第一批细胞可能是冻存的时候出了问题，没有成功，第二批细胞一下就好了。我用的只是国产（成都）的小牛血清，浓度为10％，DMEM培养基里也没有另外加谷氨酰氨，只是在复苏时要耐心，刚复苏的293贴壁很慢的，我的经验是加双倍的DMEM培养基，这样DMSO就被稀释了，不必一定在24小时后换液（如果复苏细胞时没有离心的话），我是等了48小时，293才大量贴壁，然后换液，成活率较高。
当细胞只有30％－40％满瓶时（常规是80％－90%),我发现细胞很多成团生长，分布不均匀，于是提前传代，在传代过程中，很重要的一点是胰酶消化不能过度，我加入胰酶后，只在孵箱中放置了1分钟，期间不断观察，现在细胞长的还不错。
通过比较，我也觉得，293在塑料培养瓶中比在玻璃培养瓶中长的要好些。
总之，我认为，试验最重要的，是要理解其原理，在规范操作的前提下，可以灵活运用。

作者: langlang 时间: 2012-9-26 13:17

至于为什么大瓶子要好些，我觉得可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取，个人之见：）

作者: langlang 时间: 2012-9-26 13:18

我们实验室的一次性培养瓶回收处理方法：
1。自来水冲洗干净
2。肥皂水冲洗（超声洗涤器），冲干净以后，烘干。
3。浸酸过夜（4－6小时以上），冲洗干净
4。75％消毒酒精浸泡过夜
5。倒去酒精。使用前以紫外线照射4－6小时。
我都是这样处理的，很好用：）

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-9-26 13:19

请问0.25%的胰蛋白酶怎么配,是用双蒸水配,PBS配,还是用Hanks液配,或者别的?

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用D-HANKS配效果很好！

作者: 04906 时间: 2012-9-26 13:20

0.25的胰酶用PBS D-HANKS 都行。神经系统最好用无钙镁的HANKS

作者: 一叶 时间: 2012-9-26 13:21

请问0.25%的胰蛋白酶怎么配,是用双蒸水配,PBS配,还是用Hanks液配,或者别的?

用D-HANKS配效果很好！

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不要用双蒸水，
PBS配,还是用Hanks液配都可以，但是最后要看看PH值，因为胰蛋白酶在稍碱性的条件下作用最好，同时注意不要反复冻融！

作者: 一叶 时间: 2012-9-26 13:21

骨髓基质细胞我养过兔子的，一般取2-3斤重的兔子，用骨髓穿刺针从胫骨平台或者大转子穿刺，注意穿刺的落空感，小心不能穿透了，穿刺到位的话，是比较好抽的，一般取1到2ml就可以了，然后是离心，1000rpm10分钟，弃去上清，用含10%的胎牛血清的DMEM培养液重悬，接种于培养瓶中。次日要及时换液，除去飘浮的红细胞。

至于鼠，我不知道有没有那么小的穿刺针，或者你可以把股骨两端剪断后，用PBS冲洗髓腔内部，得到的冲洗液再离心，其他步骤同上。

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我现在也在做兔子的，前面步骤与你的一样，但首次换液时间在第三天，且为半量换液，（我用的是玻璃培养瓶），曾做过对比，在第五天时，继续半量换液者，贴壁细胞明显多于第五天时全量换液者。有此现象吗？希望听听你的经验。

作者: 一叶 时间: 2012-9-26 13:22

各位高手，关于细胞培养过程中的污染问题，想听听大家的经历，最好能发几张照片，好有个感性认识。不胜感激！

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-26 13:22

我发表一些个人见解：
细胞培养的基础之基础在于无菌，就像作为一个外科医生刚上临床一样，特别对于新手是如此。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-26 13:23

有一问题请教：
灭活前后，用倒置显微镜观察，见有黑色“小虫”，国、螺旋状运动，不知是何物？

作者: bongte 时间: 2012-9-26 13:23

在此小生想请教关于细胞三维培养的相关问题，事无具细，望清囊相授

作者: BUK 时间: 2012-9-26 13:24

最简单的方法：加蒸馏水30秒，立即加等体积的1.8% NaCl ，即可，对单个核细胞的生长无影响。

我从贫血病人的骨髓细胞中分离单个核细胞培养，遇到一些问题：
1、以Ficoll分离单个核细胞，但总有一些红细胞搀杂在单个核细胞里无法去除，我就再加入红细胞裂解液，最后以PBS洗。请教：这样对单个核细胞的生长有无影响，能否直接加入红细胞裂解液以去除红细胞？

作者: 101010 时间: 2012-9-26 13:24

我今天第一次进这个网站，大家好！我想请教一下哪里有骨髓瘤细胞系（人类）卖，目前只听说中国协和医科大学有RPMI8226,不知哪里还有更多的！谢谢！

作者: 大白菜 时间: 2012-9-26 13:25

大家好！我最近在做转染COS-7细胞，在暑假的时候细胞长势很好，每天都需换液，但一个月来细胞的状态很差，不论我怎么复苏，还是从别的试验室拿新的细胞，都养不好，表现死细胞增多，贴壁不牢，悬浮颗粒多，细胞打板，DMEM培养基的配方都没变动，小牛血清也没变化，如有高手请指点迷津！

作者: u234 时间: 2012-9-26 13:25

请教：我刚养BT-325细胞，由于运输时间出了问题，细胞状态很差，养了三天，发现它的形态象荷包蛋，不知是否正常？急！！！！！！！

作者: glass 时间: 2012-9-26 13:26

请教：
神经胶质细胞培养完全培养基用20％的血清，其中10％的胎牛血清，那么另外的10％用马血清还是小牛血清好？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-9-26 13:26

请教：
神经胶质细胞培养完全培养基用20％的血清，其中10％的胎牛血清，那么另外的10％用马血清还是小牛血清好？

请教：
星形胶质细胞接种到24孔培养板，每孔接种密度是多少？如果我做细胞增殖，是否密度应低些？

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直接用10％的胎牛血清就行，密度不超过104/孔！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-9-26 13:27

请教：
神经胶质细胞培养完全培养基用20％的血清，其中10％的胎牛血清，那么另外的10％用马血清还是小牛血清好？

请教：
星形胶质细胞接种到24孔培养板，每孔接种密度是多少？如果我做细胞增殖，是否密度应低些？

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直接用10％的胎牛血清就行，密度不超过104/孔！

作者: DONT 时间: 2012-9-26 13:27

请问哪位师兄师姐栽秧骨髓基质细胞？请多多赐教！谢谢！

作者: TNT 时间: 2012-9-26 13:28

ACS grade 的DMSO是何等级?分子生物学吗?可否用于细胞冻存?

作者: tuuu2 时间: 2012-9-26 13:29

请教各位：胶原酶反复利用，即离心时未终止其消化作用会否对心肌细胞膜表面的β受体产生损伤，本人在用异丙肾上腺素对心肌细胞进行造模时，心肌细胞的频率未见加快，不知是何原因，不知是否有人做过此方面的实验，请赐教。

作者: DNA 时间: 2012-9-26 13:29

药物纯品用于细胞培养时需要用什么来稀释?
仅用培养基稀释即可或者需要加入其他如DMSO？如需要用ＤＭＳＯ，需要多少的浓度？请不吝赐教，谢谢。

作者: wmp1234 时间: 2012-9-26 13:31

有哪位做过大鼠骨骼肌细胞的原代培养？请指导我一下，我做了多次都不成功。谢谢了。

作者: ending 时间: 2012-9-26 13:32

请教各位：我要用MTT法检测化疗药物对肿瘤细胞的毒性，在96孔板中加样时是不是除了有一孔只加培养基不加细胞外，还要有一孔只加细胞不加药物处理？还有，IC50怎么求出呀？用什么公式？我不知大概什么书上有IC50的求法？药理书上没看见。帮帮我吧！谢谢！

作者: zzzz 时间: 2012-9-26 13:33

请问大家一个问题吧, 我的hela细胞以前都是很好的,最近复苏了n次,都完蛋了,请诸位帮帮我呀!!!

细胞离心2分钟后去除冻存液,换培养液后置于孵箱,过几个小时后贴壁(还是圆的),第二天呈梭形贴壁(很正常).

问题出在第三天! 细胞都已悬起, 但好像形态还算完整!

已经排除了1.冻存问题2.造作失误3.培养瓶问题(塑料的一次性)

问题在哪里呢???

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-26 13:34

大家好！因为实验不太顺利，难以进行下去，请大家多多帮忙，谢谢！
我现在做的是心肌细胞的提取与培养，但不知为何提取后细胞生长的状态不好，不见细胞的搏动，而且感觉它的皱缩，像是凋亡的特征，用MTT方法检测存活的确实不多。提取用的是出生1到3天的大鼠，用D-hanks液做缓冲液，二型胶原酶消化，含20%FBS的高糖DMEM原代培养。大家快来帮我分析分析，到底哪儿出了问题？

作者: qqq111 时间: 2012-9-26 13:35

<blockquote>felyh write:
 药物纯品用于细胞培养时需要用什么来稀释?
仅用培养基稀释即可或者需要加入其他如DMSO？如需要用ＤＭＳＯ，需要多少的浓度？请不吝赐教，谢谢。 </blockquote> 

用可以溶解药物的溶剂溶解，为了防止溶剂对细胞生长的影响，尽量使用对细胞损伤较小的溶剂，并且浓度尽可能配得高一些，再用培养基稀释。如果浓度配得不够高，可用2X培养基对倍稀释后再用培养基稀释，可防止再用培养基被稀释而影响实验结果。

作者: qqq111 时间: 2012-9-26 13:35

大家好！因为实验不太顺利，难以进行下去，请大家多多帮忙，谢谢！
我现在做的是心肌细胞的提取与培养，但不知为何提取后细胞生长的状态不好，不见细胞的搏动，而且感觉它的皱缩，像是凋亡的特征，用MTT方法检测存活的确实不多。提取用的是出生1到3天的大鼠，用D-hanks液做缓冲液，二型胶原酶消化，含20%FBS的高糖DMEM原代培养。大家快来帮我分析分析，到底哪儿出了问题？

可能：1、二型胶原酶不能用FBS终止，要离心去除；
2、消化时间太长
3、我的方法（结果良好）：
小鼠心肌细胞原代培养
㈠、概述
整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。

㈡、[试剂]
1、  培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%小牛血
清、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素。
2、  消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原酶II
（活力为150U/mg） 0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
3、  D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g , KH2PO4 0.06 g , NaCl 8.00g , NaHCO3 0.35 g , Na 2HPO4•7H2O 0.09 g , 酚红 0.01 g 1L

㈢、[实验步骤]
1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3 大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min 后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000 rpm 5min ，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。（为节约时间，以下步骤可省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃ 5%CO2）培养。

㈣、培养结果
在二氧化碳培养箱中（37℃ 5%CO2）培养24 h后可见搏动的单层心肌细胞。

作者: TNT 时间: 2012-9-26 13:36

我马上按照你的方法试一试，真希望能出来好结果，再像我这样就毕不了业了。我还有一事请教，我用的胶原酶是264unit/mg的，是否按比例稀释即可，消化液中既有胰酶又有胶原酶，配制时是否放在一起，不用单独配制，使用时也一样？
再一次表示感谢！

作者: TNT 时间: 2012-9-26 13:36

reply:我还有一事请教，我用的胶原酶是264unit/mg的，是否按比例稀释即可，消化液中既有胰酶又有胶原酶，配制时是否放在一起，不用单独配制，使用时也一样？

胶原酶和胰酶可以放在一起！配制时注意PH值，胰酶在溶解时会很酸，它消化时又需要偏碱。
另：biglee510和你使用同一电脑？是的话就可能了，使用丁香园后注意 sign out 。

作者: caihong 时间: 2012-9-26 13:37

请问各位老师：

我养的是293细胞，最近细胞老长不好，养了3天还长不满，而且死细胞很多，请问各位老师我养的细胞是什么原因

作者: 小糖块 时间: 2012-9-26 13:37

这是我的96孔板加样图，原来发到药学板快，但没人响应，所以在这再发一次。
这是我做实验的时候加样的情况，供参考：
刺激正常小鼠脾脏淋巴细胞实验96孔板加样图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A L
B ① ② ② ② ② ② ② ②
C ③ ④ ④ ④ ④ ④ ④ ④
D ⑤ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥ ⑥
E ⑦ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧ ⑧
F ⑨ ⑩ ⑩ ⑩ ⑩ ⑩ ⑩ ⑩
G
H
其中：
L 调零对照：270 µL超纯水；
①空白对照1：100 µLRPMI-1640培养液+50 µLRPMI-1640培养液；
②正常对照组：100 µL淋巴细胞+50 µLRPMI-1640培养液；
③空白对照2：100 µLRPMI-1640培养液+50 µL药1剂量；
④药1剂量剂量组：100 µL细胞+50 µL药1剂量；
⑤空白对照3：100 µLRPMI-1640培养液+50 µL药2剂量；
⑥药2剂量剂量组：100 µL细胞+50 µL药2剂量；
⑦空白对照4：100 µLRPMI-1640培养液+50 µL药3剂量；
⑧药3剂量组：100 µL细胞+50 µL药3剂量；
⑨空白对照5：100 µLRPMI-1640培养液+50 µL ConA ；
⑩阳性对照组：100 µL细胞+50 µL ConA 。
在实验的过程中，你可以将96孔板尽量加满，有效利用。

作者: 911 时间: 2012-9-26 13:38

各位,我按照文献介绍的方法怎么得到的内皮细胞这么少?长不起来,
有什么诀窍吗>

作者: xingyi08 时间: 2012-9-26 13:38

293细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞293中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善293细胞的大规模培养技术具有越来越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞特性
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾细胞。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型成上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞为人亚三倍体细胞系。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
转瓶培养
转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。与传统静止单层培养相比，转瓶具有三大优点：为细胞提供较大的生长表面；轻微的转动可以防止培养液中形成的某些成分对细胞生长可能产生的影响；细胞大部分时间仅覆盖一薄层培养液，有利于气体交换。我们已成功实现293细胞的转瓶培养。由于293细胞对生长环境的改变较为敏感，细胞容易成团，因此维持稳定的温度、酸碱度和转动速度对细胞正常均匀生长至关重要。
现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两部分。293细胞接种后，维持适当的转速培养。不同的细胞转速略有不同。细胞的均匀分散贴壁情况与培养液温度、瓶子的转动速度和细胞特性有关。在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍。
反应器贴壁培养
此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。
CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞的贴壁培养时可使用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6毫米的无纺聚酯纤维圆片，具有很高的表面积与体积比（1200cm2/g），有利于获得高细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多的方式，除用于293细胞的培养外，还用于杂交瘤细胞培养、Hela细胞培养、CHO细胞培养及其它细胞培养。此种方式培养293细胞，细胞接种后贴壁快，接种1小时后细胞贴壁率可达98%以上，采用灌流培养。整个培养周期约7-10天，细胞增殖25-50倍。
微载体培养
微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。常用商品化微载体有三种：Cytodex?，Cytopore和Cytoline。
使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
微载体培养293细胞，首先要选择合适的微载体类型和搅拌速度。接种细胞可用1L spinner微载体培养系统或是其它贴壁培养方式准备，采用灌流培养，培养周期10-15天，能达到的细胞密度为5-10×106/ml。
无血清悬浮培养
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。要实现293细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养293改造为悬浮培养293S细胞并寻找适合高密度无血清培养的培养液配方。
悬浮培养时，由于缺少血清和蛋白的保护作用，293S对剪切力的敏感度增加，难以达到高密度培养，导致293S产生病毒的数量比贴壁培养低5-10倍左右。细胞接种后，灌流培养7天，达到细胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。
结论
不管是哪种培养方式，首要的一点是必须操作规范、防止污染；其次根据需要选择合适的293细胞培养方式，对细胞生长状况实行有效的监控，以便获得稳定的蛋白或病毒产物。

作者: rxcc33 时间: 2012-9-26 13:39

科學家證明可以在實驗室中將人類的神經幹細胞轉變為具有功能的腦細胞，且這些細胞能夠產生多巴胺 ( Dopamine ) . 此研究的成果最終可能可以達到治療帕金森氏症 (Parkinson's disease ) 的目的。

Thomas Jefferson University 的 Lorraine Iacovitti指出，使用含有 fibroblast growth factor 1 ( FGF1 ) 配合dopamine, TPA, IBMX, forskolin 的培養環境，可以使由 NT2 cell line（這種細胞是胚胎幹細胞株）分化而成的神經細胞表現出兒茶酚胺 ( catecholamine ) 的生合成酵素 ( biosynthetic enzyme ): tyrosine hydroxylase ( TH ), 此 TH 正是合成多巴胺過程中的重要酵素。

同時研究人員也觀察到了低量的多巴胺以及此過程中產生的代謝物 DOPAC. 這證明了觀察到的 TH 是確實有酵素活性的。且這些細胞在除去特殊的培養環境以後還能夠繼續製造 TH.

Lorraine Iacovitti 希望接下來能夠純化出這些具有功\能的神經細胞並且移植入帕金森市症的模式動物。或許\有朝一日能夠研發出帕金森氏症的治療方法。

作者: rxcc33 时间: 2012-9-26 13:40

科學家證明可以在實驗室中將人類的神經幹細胞轉變為具有功能的腦細胞，且這些細胞能夠產生多巴胺 ( Dopamine ) . 此研究的成果最終可能可以達到治療帕金森氏症 (Parkinson's disease ) 的目的。

Thomas Jefferson University 的 Lorraine Iacovitti指出，使用含有 fibroblast growth factor 1 ( FGF1 ) 配合dopamine, TPA, IBMX, forskolin 的培養環境，可以使由 NT2 cell line（這種細胞是胚胎幹細胞株）分化而成的神經細胞表現出兒茶酚胺 ( catecholamine ) 的生合成酵素 ( biosynthetic enzyme ): tyrosine hydroxylase ( TH ), 此 TH 正是合成多巴胺過程中的重要酵素。

同時研究人員也觀察到了低量的多巴胺以及此過程中產生的代謝物 DOPAC. 這證明了觀察到的 TH 是確實有酵素活性的。且這些細胞在除去特殊的培養環境以後還能夠繼續製造 TH.

Lorraine Iacovitti 希望接下來能夠純化出這些具有功\能的神經細胞並且移植入帕金森市症的模式動物。或許\有朝一日能夠研發出帕金森氏症的治療方法。

作者: junhun 时间: 2012-9-26 13:40

我按照你的实验方法试做了一下，刚做完，但在做时出现了一个问题，希望再一次得到你的帮助。消化剪碎的组织20分钟，吹打后组织非常粘，而且均匀分散，根本无法吸出剩余的组织，也无法吸出消化液，我采用了200目的筛网过滤，然后滤液800转离心10分钟，发现离下的细胞数很少，上面的液体不很澄清，在镜下观察液体里细胞数也很少，本想继续消化剩余的组织，但不能从筛网上洗下，不知道你有没有出现类似的情况，是怎样解决的？
希望得到你的帮助！谢谢！

作者: vcve 时间: 2012-9-26 13:40

请教各位，CO2孵箱内被霉菌污染后该怎么处理才能彻底清除真菌呢？在水盘里放上硫酸铜就可以了吗？还是需要用什么抗生素擦隔板

作者: 园丁## 时间: 2012-9-26 13:41

我没碰到过这种情况！你的消化液是用D-Hanks液配的吗？“吹打后组织非常粘，离下的细胞数很少”，是不是细胞破碎了？！可能是消化液的渗透压或pH值不对，也可能是吹打细胞太用力了。

作者: misswu61 时间: 2012-9-26 13:42

刚开始学分离细胞，需要用孔径40um的滤网，不知滤网怎么买，一些试剂公司都不卖这个，这个东西虽是很普通－不好意思问这么一个问题，但的确急需用。希望各位高手可以指点，提供线索，谢谢了！

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上海实生公司有卖

作者: misswu61 时间: 2012-9-26 13:42

我现在在做滋养细胞的分离，请教各位大虾，有谁做过panning（盘化）法细胞分离，具体步骤是怎样的，请指教。

作者: DDD 时间: 2012-9-27 09:45

请教各位，CO2孵箱内被霉菌污染后该怎么处理才能彻底清除真菌呢？在水盘里放上硫酸铜就可以了吗？还是需要用什么抗生素擦隔板。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-27 09:45

我没碰到过这种情况！你的消化液是用D-Hanks液配的吗？“吹打后组织非常粘，离下的细胞数很少”，是不是细胞破碎了？！可能是消化液的渗透压或pH值不对，也可能是吹打细胞太用力了。

作者: 泡泡 时间: 2012-9-27 09:47

那位菩萨手上有ECGS （endothelial cell growth supplement)
能否借用一点，当10倍偿还。
因为疯牛病问题， ECGS 订了3个月后被告知道不能从海关进
急用，望那位大侠帮忙！

作者: qqq111 时间: 2012-9-27 09:48

请问 MTT具体操作是怎样的？请指教。

作者: mickeylin 时间: 2012-9-27 09:49

请教:QBSF-60培养基的配方,能够定购吗?万分感谢!

作者: 中国特色 时间: 2012-9-27 09:50

请问有哪位高手培养过破骨细胞？可否指点一二？不胜感激！！！

作者: 蒲公英 时间: 2012-9-27 09:53

有没有人内皮细胞培养的高手？

作者: jkobn 时间: 2012-9-27 09:54

『讨论』关于复苏后第三天细胞大面积脱壁漂浮的原因

情况如下：复苏RAW细胞，1640培养基，进口小牛血清（GIBCO),
消化液：胰蛋白酶＋EDTA；消化时间约2－3分钟；

第一管复苏，开始两天换液还好，到约第三天上午观察细胞，发现细胞全部崩解，漂浮，像海藻似的白色悬浮物。

第二管复苏，同样也是一天半换液时还好，到约第二天半观察细胞，又发现细胞全部崩解，漂浮，像海藻似的白色悬浮物。

现在措施：洗细胞，更换培养液，补救极少量残存贴壁的细胞。

可能性分析：
1 排除培养基污染，血清污染：因为是新配的培养基，（血清是去年的），二者分别取样放在培养箱中，至今均未发现浑浊。

2 似乎排除霉菌，支原体污染：把握也不是很大

3 似乎排除体系问题：CO2刚换的，培养箱消过毒，（只有CUSO4是去年的）
培养箱里培养的小鼠原代细胞生长正常

4 怀疑消化液与消化时间问题：一是消化液成分,有人说消化液里还要加上NACL,KCL，较好，有没有战友知道具体作用及配方。二是消化时间，由于贴壁牢，消化3分钟，吹的效果也不太好，以后遇到类似情况怎么办？

复苏的种子已经还有一管，现在细胞崩解原因又不清楚，不敢轻易在复苏，但由于实验又急，还请各位战友讨论讨论

该问题带有一定普遍性，细胞崩解均出在第二三天，以下是其它战友的帖子：
xhui_wang 2004-02-13 11:00
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请问大家一个问题吧, 我的hela细胞以前都是很好的,最近复苏了n次,都完蛋了,请诸位帮帮我呀!!!

细胞离心2分钟后去除冻存液,换培养液后置于孵箱,过几个小时后贴壁(还是圆的),第二天呈梭形贴壁(很正常).

问题出在第三天! 细胞都已悬起, 但好像形态还算完整!

已经排除了1.冻存问题2.造作失误3.培养瓶问题(塑料的一次性)

问题在哪里呢???

作者: jkobn 时间: 2012-9-27 09:55

养细胞养得我好郁闷，刚开始还以为长势喜人，结果没几天，瓶子里附着像海藻似的白色悬浮物，重新PBS冲洗，加大双抗后（拼命往瓶子里加，估计浓度有n倍），那东东没消失，我的贴壁细胞全没了，。。。。。。。：）
真是命苦啊

作者: junhun 时间: 2012-9-27 09:57

在此发表一下我个人拙见，楼上几位的情况基本类似，都是前几天细胞生长良好，但第三天以后就会出现悬浮，我做贴壁细胞HOS-CD4也出现过这种问题，
我个人认为可能是以下原因：
1.细胞培养液，不知各位用的是多大浓度的小牛血清，我用10％与20％的试过，小牛血清浓度过大可能会影响细胞贴壁，而且如果营养丰富，培养三天后，细胞密度过大，不及时传代，会造成细胞脱落。
2.胰酶消化的问题，可能在传代时胰酶消化过量，造成细胞不能贴壁。
出现类似情况，可以把上层悬浮的细胞丢弃，留下贴壁的继续培养，注意及时传代，可以补救！我遇到这种情况时曾经就从十几个细胞养到成规模。

作者: 缘yuan 时间: 2012-9-27 09:58

我也是！开始两天换液还好，到约第三天上午观察细胞，没有发现pigeon2003909 所说的“细胞全部崩解，漂浮，像海藻似的白色悬浮物”，但有黑色小虫样的东西在细胞周围、表面蠕动，如果再培养一段时间，就会出现pigeon2003909 所说的“细胞全部崩解，漂浮，像海藻似的白色悬浮物”。
基本排除培养液污染的可能，因为用同样的培养液培养其他细胞，其生长良好！
最大的怀疑就是细胞冻存的时候句已经有了轻微的污染。所以无论你外界条件怎么变化都会有三天后的“细胞全部崩解，漂浮，像海藻似的白色悬浮物”问题。

作者: TAT 时间: 2012-9-27 09:58

楼上分析得有道理，
海藻似的白色悬浮物，（我们这里不能拍照），其实这些物质就是崩解的细胞成分，肉眼可见

作者: 101010 时间: 2012-9-27 09:59

哦，我明白了。以前我们从中科院上海细胞所购买的细胞就是这样，养了几天突然崩解，不过没有楼上两位说的那么明显罢了。现在看来，你们的细胞很可能是污染了网友们常说的胶虫了。

作者: langlang 时间: 2012-9-27 10:00

今晚发现补救的细胞也都没戏了。
我们的RAW是从上海细胞所买的，不过已经用了快一年了，都还好；
黑胶虫主要来源好像是血清吧，而我们的血清是几个月前分装的，养其它细胞一直没出现问题啊。

作者: 缘yuan 时间: 2012-9-27 10:00

最大的怀疑就是细胞冻存的时候句已经有了轻微的污染。
也许也有这种可能，但这种病原体是什么呢？细菌污染，培养液一般会变黄，繁殖速度也快；而我们的培养液不浑浊；霉菌污染，菌丝一般可能观察的到吧，我没发现；支原体吧也不大象，园子里支原体讨论区讨论的现象我都没观察到。
请一位牛人过来看，她说不像污染了，怀疑我消化液和消化时间有关系，并且指出消化液里除TYPSIN-EDTA外，最好还加些NACL,KCL，具体什么作用和配方都没说。有没有知道的战友啊？

作者: jujuba 时间: 2012-9-27 10:01

可怜我的Hela细胞啊，刚传完代好好的都贴壁了（3.1），到了3.3号看了一下很多都脱落，但不是很成片的，培养基中漂浮的差不多都是单个的细胞，赶紧换液，还是有很多细胞漂浮。瓶底只有几块小区域的细胞长的还象样子，其它贴壁的还都是单个的，没形成梭形。哪位知道是怎么回事啊？？

作者: lixi559 时间: 2012-9-27 10:01

各位大虾,小弟就要开始养MFC小鼠前胃癌细胞,不知道它的特性和培养条件,请各位大虾多多指点!

作者: 911 时间: 2012-9-27 10:03

请教一下：培养液过滤以后的ph到底是升高还是降低？？？GIBICO的DMEM外包装上好象写着过滤后会升高0.1－0.3，可我在这里看到有同学说会下降！哪位兄弟知道啊？

作者: 小螺号 时间: 2012-9-27 10:03

各位前辈：
有无乳鼠皮肤细胞的提取及培养方法？万分感谢！

作者: glass 时间: 2012-9-27 10:04

不知你是否用滤网过滤消化过的组织块，我用的是200目的筛网，在买五金的地方就可卖到，象纱窗一样的，不过材料是不锈钢或铜制的，把它剪成小圆形，放在小滤器里用很方便。

作者: glass 时间: 2012-9-27 10:05

DMEM过滤后pH值会增大，所以初滤后把pH值调得稍低一点比较好，一般加过FBS后会偏酸一点，但我用的血清加入后偏碱，建议用之前再调一下。

我也有一事请教大家，我想知道心肌细胞的鉴定方法，应该使用α-actin ，我想知道具体的步骤，希望得到大家的帮助！

作者: loli 时间: 2012-9-27 10:05

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

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我的培养箱前一星期也被污染了，但是我们实验室没有过氧乙酸，所以我用甲醛熏蒸，碘氟、酒精消毒不知道效果会怎样，希望也能把霉菌、黑胶虫全部杀死。我熏了已经两天了，一进去眼睛都受不了，希望那些该死的细菌全部被杀死

作者: 911 时间: 2012-9-27 10:06

列位大侠，请教了：培养箱干了3天水，二氧化碳超标，大约是6％多一点。结果我的细胞共六只全军覆没，是不是二氧化碳的原因？只超了这么一点，就至于此吗？

作者: duoduo 时间: 2012-9-27 10:06

各位战友：
大家好，有谁在做心肌细胞培养的时候用过Brdu，一般文献上记载在DMEM的浓度是0.01mmol/l,我不太明白，Brdu是粉末状的，它是直接溶在DMEM中吗？是不是需要抽滤啊？我明天要配药，很着急，请各位不另赐教。万分感谢！

作者: duoduo 时间: 2012-9-27 10:07

我仔细拜读了牛人写的心肌细胞培养过程，我培养时只用0.08%的胰酶（1：250），经过7-8次在磁力搅拌器上反复消化，每次10分钟最后消化的非常完全，且最后不用过滤，只要注意在接种时吹打均匀即可，细胞搏动的也很有力。另外细胞搏动与否还于取心脏的熟练程度，整个操作过程的时间长短也有很大关系，有一次我做实验取了30只，结果由于时间过长，细胞搏动的就很少，但不影响成活率。

作者: BUK 时间: 2012-9-27 10:07

BrdU需要配在DMSO中(10mM)成储备液，然后加到培养基中使终浓度为10uM.

作者: join 时间: 2012-9-27 10:08

加急！我培养的贴壁细胞表层突然出现了一团不明物体，周围散开些细小颗粒，培养液两天没有变混。起初怀疑细菌污染，加大了抗生素的用量，情况稍改善。将细胞上清用LB来培养，37度，过夜，无浑浊。请问这是怎么回事？

图片附件: 56354277_snap.jpg (2012-9-27 10:08, 56.12 KB) / 该附件被下载次数 34
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13898

作者: youyou99 时间: 2012-9-27 10:08

用环氧乙炔灭菌。

作者: zhezhe 时间: 2012-9-27 10:10

有哪位做过大鼠骨骼肌细胞的原代培养？请指导我一下，我做了多次都不成功。谢谢了。

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这位朋友，不知道现在做得如何，我也要开始做，如果有什么心得请指教，如果没有，我们可以互相帮助，好吗

作者: zhezhe 时间: 2012-9-27 10:10

这位朋友，不知道你现在细胞养的怎么样了，我才开始培养骨骼肌细胞，也不太成功，能否告诉我你是如何操作的，有什么心得。谢谢！

作者: 薄荷侠 时间: 2012-9-27 10:10

急急急
我现在正在原代培养子宫内膜细胞,要加处理因素(雌激素,孕激素),看其相应当指标的变化情况.
请教各位高手,在加处理因素过程中应怎样培养细胞.例:加因素前的24小时内是否用无血清无酚红的培养基培养,加因素同时换成加2%血清的无酚红培养基培养吗?常规是否培养3-4天即可?
望各位帮忙指教!!

作者: tuuu2 时间: 2012-9-27 10:11

请问对于悬浮细胞如白血病HL-60该如何判断传代时间，传代时旧的培养液该怎么祛除，请详细谈谈。谢谢。

作者: 薄荷侠 时间: 2012-9-27 10:11

请问对于悬浮细胞如白血病HL-60该如何判断传代时间，传代时旧的培养液该怎么祛除，请详细谈谈。谢谢。

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将培养瓶中悬浮细胞转移到离心管中离心(一般1000转,5-10min即可),再移去上清(即旧的培养基),加入新的培养基制成细胞悬液分装到相应地培养瓶即可.

作者: 薄荷侠 时间: 2012-9-27 10:12

我原代培养子宫内膜细胞已有半年时间了,现在已有一点经验,愿与大家分享讨论.下面是我总结的一点东西,望各位多多指教!!!
取标本：
1 准备两个小瓶（一般一个病号用一个小瓶即可，可多准备几个作为备用，以防特殊情况出现）。高压消毒：小瓶带盖子拧松放在铝盒中，吸管筒（用于加D-HANKS液）, D-HANKS液100ml。此时操作台进行紫外灯消毒半个小时。
2 加D-HANKS液：将D-HANKS液及抗生素放到操作台上，洗手进入操作间，消毒台面和手后，将酒精灯点燃。取出吸管，按上吸管冒。打开D-HANKS液及抗生素，加入青链霉素分别50ul，两性霉素B 2.5ul。（青链霉素一般分装成20万u/ml）。打开小瓶，用吸管将D-HANKS液加到瓶中，约10ml。（放在4度冰箱保存，备用）（注抗生素不能高压灭菌，这样抗生素就被灭活了。）
3 准备好泡沫盒和冰袋。将装有D-HANKS液的小瓶放在装有冰袋的泡沫盒中，带入手术室取标本即可。
注:取标本时,只用手术刀即可，将子宫纵行切开，再将宫底的两角切开。用刀片刮取子宫内膜放到准备好小瓶中。(先用刀片的背面将宫腔的黏液除去,再用刀片刮取标本.(这样才能取到想要的子宫内膜,否则可能取到黏液,消化后接种的细胞,全不帖壁.(是血细胞))
取标本这一步是很重要的,它是成功的第一步,我开始养了几个月都不理想,后来才发现是标本的问题.所以标本一定要亲自认真的做.
处理标本：
1 准备：镊子剪刀：用医用酒精泡（时间），放在高压锅里蒸。
消化酶、培养液、血清前一天先放在4度冰箱中融化，处理标本当天再放在室温下，使其温度达到室温水平。
高压灭菌：离心管5个，枪头盒（蓝和黄），吸管筒（尽量多准备一些），培养瓶（2个，若取得标本多，可多准备几个）（盖子要拧松）（一般放在铝盒蒸），小瓶3个（两个用于冲洗组织，一个用于过滤(大滤网)），小滤器4个（150um的2个，38um的2个）。
操作台紫外灯消毒1个小时：此时台面上放大培养皿（可用于盛杂质），12孔的培养板（用于观察组织的消化程度。），两把枪（1ml，100ul），消毒好的D-HANKS液。
2 处理：
离心法：
（1）将取回的标本放到操作台上，用镊子将标本在小瓶中冲洗一下，去除组织血液和黏液。反复冲洗3次。（2）在小培养皿中剪刀剪碎组织（因内膜组织比较散可以用刀片拍碎，这样可减少细胞损伤的机会）。（3）转入玻璃离心管中（约2ml，一般2ml的组织可接种一瓶），再按1:3的体积加入0.1％胶原酶溶液（若组织为2ml则消化液为6ml），混匀后放在超净台上进行消化，这样可以减少污染的机会。（若在37度水浴中持续慢速振荡消化，被污染的机会增加）约消化40-60min(消化时间多是40min-2h)。(40min后可用吸管吸取少量放在12孔的培养板中在镜下观察消化的程度)。（4）消化好后，加入10倍体积的D-HANKS稀释消化液（若是2ml的组织，则加入8ml的D-HANKS液体，即总体积为8.8ml。）。将此离心管进行离心，800rpm，2－3分钟。（5）将离心管放到操作台中，用枪头吸取上清（主要为间质细胞），加到另一离心管中，1000rpm，5-10min，弃上清。用培养液调整细胞种植浓度为1×105/ml（若取得组织为2ml则加4吸管的培养液即可），接种到培养瓶中（多用塑料的,因塑料的易于贴壁）（每瓶约5ml），(培养3-4小时即可贴壁)（6）往（4）中的离心管的沉淀中加入少量的D-HANKS液体，吹打制成细胞悬液，转移到另一离心管中500rpm，5min，弃上清。反复进行2次。将沉淀用培养液制成细胞悬液，再将细胞悬液转移到培养瓶中（塑料的）。（培养过夜后才会贴壁）（7）细胞贴壁后，进行细胞换液，去除没有贴壁的杂质。
此时即制成了原代培养的细胞。

作者: 薄荷侠 时间: 2012-9-27 10:14

滤膜法：
将取回的标本放到操作台上。洗手进入操作间，双手用风吹干。消毒台面和双手。点燃酒精灯。用镊子将标本在小瓶中冲洗一下，去除组织血液和黏液。反复冲洗3次。（在盛有D-HANKS液的小瓶中进行冲洗）（2）在培养皿中用刀片拍碎组织。（3）加入0.1％胶原酶溶液约10ml，混匀后放在37度水浴中持续慢速振荡消化，约消化40-60min。40min后可用吸管吸取少量放在12孔的培养板中在镜下观察消化的程度。消化期间可将血清加入培养液中。取出吸管，按上吸管冒；将离心管放到试管架上；打开要用的小滤器及注射器；打开小瓶。(4)将消化好的组织加入含有血清的培养液制成细胞悬液（含有血清的培养液可以终止消化），过150um（即100目）的不锈钢网，以除去未消化尽的组织。（过滤到小瓶中，用小滤器过滤）。再将小瓶中细胞悬液过38um的不锈钢网分离腺上皮细胞和间质细胞,(过滤到离心管中，离心管中的为间质细胞，拿去离心。不锈钢网上的为腺上皮细胞，用HANKS液在大培养皿中冲洗，收集冲洗液吸到离心管中进行离心)。（5）间质细胞的离心处理：将富含间质细胞的悬液以1200r/min,离心10min，弃上清液，将沉淀用1ml的培养液混悬后,将悬液加到培养瓶中培养即可（可将离心管用培养液冲洗一下，将冲洗液也加到培养瓶中（以增加培养的细胞数）。腺上皮细胞的处理：将38u的不锈钢网放在大培养皿中，用D-HANKS液进行冲洗，将冲洗液吸到离心管中，离心500r/min，5min，弃上清，将沉淀用D-HANKS液进行冲洗，再进行离心，反复进行2次。离心好后，用培养液制成细胞悬液，接种到培养瓶中。（7）细胞贴壁后,换液，将未贴壁的杂质去掉。
注: 子宫内膜原代培养,多选用胶原酶消化,浓度0.1%-1%,消化时间40min-2h.不贴壁的大量的小细胞是血细胞,可用0.8%NH4CL去除,也可用逐次换液法去除.

作者: dongdongqiang 时间: 2012-9-27 10:15

列位大侠，我是新手。前几天在师兄的殷切指导下，自己单独完成了生平第一次细胞传代，浪费了师兄不少培养液和胰酶不说，今天一看，我的妈呀，一个培养皿被真菌污染了，另一个被细菌污染。残存的几个还奄奄一息。希望各位指教。

作者: yes4 时间: 2012-9-27 10:16

列位大侠，我是新手。前几天在师兄的殷切指导下，自己单独完成了生平第一次细胞传代，浪费了师兄不少培养液和胰酶不说，今天一看，我的妈呀，一个培养皿被真菌污染了，另一个被细菌污染。残存的几个还奄奄一息。希望各位指教。

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你的细胞该是贴壁的吧!下面是我们传细胞的过程,你可参考一下!
(1)准备：(A)将要用的物品进行高压灭菌，操作台紫外灯照2个小时，若前面有人用过则只照半个小时即可，通风10分钟。(用肥皂洗手，在操作台上用风吹干。（C）用酒精喷洒台面，再用酒精棉球擦一遍台面。（D）用酒精把手擦洗一遍。（E）点上酒精灯。
（2）  把铝盒打开，取出吸管，按上吸球。打开铝盒时要将盒口进行酒精灯消毒，然后用酒精灯消毒过的镊子取出吸管。
（3）  将培养液及培养瓶的盖子打开，开启的瓶盖勿朝上放置。打开时用镊子且都要酒精灯消毒，将瓶子、盖子都放在左边无菌区。
（4）  用在酒精灯上消毒过的吸管吸取培养瓶中旧液体。(移去旧培养基后也可用dhanks或pbs冲洗一下,这样有利于胰酶的作用)加入胰蛋白酶进行消化（贴壁生长的要先使其悬浮后，再进行传代）。在显微镜下看到细胞分离后（2-3分钟），加入适量的培养液，用吸管吹打混匀后分装到相应的培养瓶中（用吸管吹打细胞时应尽量不免气泡的产生）。（可按不同的需要进行传代，1:3-1:6）一般细胞生长达到80－90%时进行传代。

作者: biabiade 时间: 2012-9-27 10:18

本人在做细胞培养的过程中曾遇到不少问题，经过不断得失败，不断的探索总结出一些教训；现将我养细胞中的一些心得给同道们一同分享：1.在细胞换液、传代的操作过程中一定要注意无菌观念，切忌污染。2.细胞培养基及消化液要定期检查PH和活性。3.试验要有计划性以避免繁复操作对细胞的影响。4.经常检验培养基、培养液是否污染，有没有沉淀。5.作好预防补救措施。
以上只是一些纲领性的方法，具体细节还须自己把握。如有不当，请各位批评指正。

作者: plaa 时间: 2012-9-27 10:21

现在我用的是0.1%的二型胶原酶来消化心肌组织，我觉得不知为何提出的细胞质量很不稳定，有时好有时坏，让我非常苦恼，谢谢你给我提供的新方法，我一定会试试的，再一次谢谢你！
我使用Brdu时，用双蒸水溶解过滤膜，配成10mmol/l的溶液，分装，在-20度下储存，使用时加到细胞悬液中，使终浓度为10umol/l。
以后有好的经验大家一起交流吧！

作者: DDD 时间: 2012-9-27 10:22

我准备养人脐动脉平滑肌细胞，不知列位大侠是否可以给予指教？
不胜感激

作者: 04906 时间: 2012-9-27 10:23

各位好，请问有没有人在培养WISH细胞。我们实验室的WISH细胞与新买的的细胞形态不一样，明显细胞个大。另外，新买的细胞传了几代后，生长状态也不好了，个体变大，边缘模糊，对VSV病毒也不敏感。若有哪位高人可以指教，不胜感激。sun_girl001@163.com

作者: 盼盼 时间: 2012-9-27 10:24

本人刚开始用组织块法养瘢痕成纤维细胞，据说，古老的组织块法简单，成纤维细胞也好长，但所谓会者不难，难者不会，请教各位有培养经验的同道，在实验的具体细节上或关键要点上或个人体会上给与赐教，致谢！！！

作者: bohe221 时间: 2012-9-27 10:25

我按照你的方法配制的Brdu，正常培养心肌细胞后，细胞第二天换液时发现死的很多，而且成纤维细胞还是有很多，但比每次少些，是不是浓度偏小些，你试过比这大些的浓度吗？且DMSO不是细胞培养专用的，是不是也影响细胞存活率？

作者: duoduo 时间: 2012-9-27 10:26

293细胞我养过，感觉还是比较好养的。关键是培养液要新鲜，我每次只配1000ml，而且分为2-4瓶，不用的培养液，我就冻存在-20度，感觉效果和新鲜的差不多。我用的是国产四季青的胎牛血清，对细胞的生长与无明显差别。
再有，细胞千万不能长得太老，要及时传代，早期状态好时，多冻存几只。

作者: sunnyB 时间: 2012-9-27 10:28

请教各位高手，做CTL 实验的脾细胞如果是放在-80度冰箱里三个月左右，可否养活并顺利进行实验？如何培养才能成活？谢谢！

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-27 10:29

我是养间充质干细胞的,细胞在-80冰箱存放半年后仍可以.这和细胞种类有关.
但冻存及复苏时的操作细节很重要,稍有不慎就可能全军覆灭哦
动存时要将细胞往现配的动存液中一滴一滴地加,每加一滴就要混匀,速度也不能慢,最好在冰上进行.
复苏时可把水浴锅的温度调到41度,一分钟内溶解完,需摇晃,但不可剧烈,否则会造成较大的机械损伤.
若需当时就去除动存液,则最好把细胞加入预冷的培养液中,后离心去除.
仅个人经验之谈.

作者: 2541 时间: 2012-9-27 10:29

大家好！我是新手，有很多问题想请教。如果培养喉鳞癌细胞用啥消化比较好？胶原酶Ⅰ还是Ⅳ好？谢谢！

作者: jkobn 时间: 2012-9-27 10:30

由于刚做此实验，没经验，我的细胞没有经过处理就放入冰箱。细胞取出的后期工作是否能挽回一些呢？比如培养条件的改善？谢谢。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-27 10:30

没有经过处理就冻存的细胞肯定不能再存活，如果你冻存时没有加培养液，只冻了细胞团，你可以用它做PCR或Western blot。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-27 10:31

我按照你的方法配制的Brdu，正常培养心肌细胞后，细胞第二天换液时发现死的很多，而且成纤维细胞还是有很多，但比每次少些，是不是浓度偏小些，你试过比这大些的浓度吗？且DMSO不是细胞培养专用的，是不是也影响细胞存活率？

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刚看到你的留言。BrdU通常不会用来和细胞共同培养很长时间的，因为BrdU本身是诱变剂。BrdU标记一般用pulse法，即与细胞共同培养若干短时间后(比如20-30分钟）将未与DNA整合的BrdU洗去。当然如果是用来测DNA synthesis的可长些，8-16hr都有记录。10mM stock稀释到10uM整整稀释了1000倍，所以DMSO的影响可忽略不计。

我做的都是肿瘤细胞，做过20uM BrdU浓度，没事儿，但是心肌细胞没做过。

最后提醒一小点，操作BrdU的整个过程都要避光，在弱光环境中操作最合适

作者: bohe221 时间: 2012-9-27 10:32

谢谢你的解答，消除了我的疑惑，我用Brdu和心肌细胞一起孵育了48小时后才换液，难怪细胞死了好多，吓的我这次培养都没加，再一次谢谢你，使我少走了很多弯路。

作者: bohe221 时间: 2012-9-27 10:32

各位战友，有做过用羟自由基系统诱导出心肌细胞凋亡的吗？一般有下列几种系统 1、次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶 2 、FeSO4/H2O2 3 FeSO4/半胱氨酸我现在用第3种造模，一般文献都是FeSO4终浓度50umol/L,半胱氨酸终浓度200umol/L,可我测LDH时正常组和损伤组根本无区别，我用的浓度梯度是FeSO4终浓度20，40，50，60umol/L，cys终浓度固定200umol/L,是不是梯度太小了，我用的FeSO4是国产分析纯，500g一瓶的那种，能透过0.22um的滤膜吗？要不然怎么能滤过除菌呢？我现在很着急，快开题了，我还没摸索出条件呢。请大家不吝赐教，有相关的资料提供一下参考也不胜感激。

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-27 10:33

请教各位大师，有没有养过横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）的，我用0.25%胰酶消化，置5％CO2孵箱5分钟，已看到很多细胞脱落，但未脱落的细胞仍未变形，吹打时又很容易脱落，其最佳消化时间是多少，出现这种情况的原因是什么，有谁能告知一二吗？

作者: yonger 时间: 2012-9-27 10:33

TPH-1 人单核细胞经过PMA刺激后贴壁后，贴壁细胞是否可以继续养活？

作者: rxcc33 时间: 2012-9-27 10:34

人外周血单一核细胞培养是否必须需要用人AB血清？我现在用的一种无血清培养基，培养总是失败。我想放弃了。想试试换成RPMI培养基培养。到底人PBMC是否好养？很多人说好养，我怎么感觉不好养啊？

作者: bling 时间: 2012-9-27 10:34

毒接种细胞最佳时机和如何观察CPE，和带毒传代

作者: join 时间: 2012-9-27 10:35

人外周血单一核细胞培养是否必须需要用人AB血清？我现在用的一种无血清培养基，培养总是失败。我想放弃了。想试试换成RPMI培养基培养。到底人PBMC是否好养？很多人说好养，我怎么感觉不好养啊？

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我用的1640 加的是小牛血清，还可以。没有用双抗（有人说加双抗后不好养）。
希望你养活

作者: gogo 时间: 2012-9-27 10:35

各位有没有培养胃癌细胞的经验，最近养了一段时间的胃癌细胞，效果不佳，有同志有成功的经验，可以谈谈。多谢

作者: bling 时间: 2012-9-27 10:36

目前软骨组织工程用什么支架比较好呢?
另:各位兄弟养软骨细胞的多多指教啊,谈谈经验.
BOWING

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-27 10:36

教大家:
我在培养细胞时,出现两次同样的污染:培养基混浊,黄色。高倍镜下：一片小米粒样圆形物体，重叠，掩盖细胞。细胞死亡。请赐教什么类型的污染？该怎样去预防？

作者: windy+++ 时间: 2012-9-27 10:37

我想向各位请教一下淋巴细胞怎样培养。我培养了一次鸡的外周血淋巴细胞，但压根就没长。

作者: zzzz 时间: 2012-9-27 10:38

这种污染我也遇到过，就是普通的细菌污染，原因就是在操作过程中存在不规范的地方，仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！
下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！

作者: biabiade 时间: 2012-9-27 10:38

求助！
我养人腹膜间皮细胞两个多月了，每次细胞转板（24or96孔板）同步（有时是两天，长达4天）都没什么问题，只要加药（胰岛素、葡萄糖）后就一定污染，包括空白对照组。而用相同的培养基同时培养的培养瓶里的细胞根本没问题，这是为什么？？？我找了很多不同的原因，如配药的器皿、房间消毒、器皿消毒等等，可是为什么培养瓶里的细胞又没有污染呢？都是相同的条件啊！有没有什么细菌在无血清的培养基里反而生长的好呢？我马上就要毕业了，现在试验做不下去了，我都快疯掉了！！

作者: bohe221 时间: 2012-9-27 10:39

我是新手，向各位请教培养小鼠子宫内膜细胞时应注意什么问题？谢谢！！

作者: yhz1973 时间: 2012-9-27 10:39

原来有这样一个好地方，唉，怎么现在才知道？！
请教两个问题：MTS中文名？从哪里可以买到？
利用BrdU掺入流式细胞仪检测细胞增殖的具体方法？

作者: yhz1973 时间: 2012-9-27 10:40

请问有没谁用过IV型胶原蛋白作细胞贴附，该用什么配？什么浓度比较好？谢谢!

作者: 小螺号 时间: 2012-9-27 10:40

请教大家：
原代大鼠肝细胞怎样培养？

作者: greenbee 时间: 2012-9-27 10:41

各位战友：
有谁做过Fe2+和半胱氨酸造心肌细胞羟自由基损伤，各自的浓度是多大？我做过两次用60umol/lFe2+,CYS200umol/l造模，效果不太明显。很着急，快开题了，实验还没有着落呢？请大家帮帮忙呀！！

作者: 四福晋 时间: 2012-9-27 10:42

我是新新手，作了一些皮肤成纤维细胞的培养，但原代细胞贴壁和省长都很差，都说成纤维细胞很容易养的，请大家指导。
培养基；含10%的DMEM（Hyclone）。
消化液：0.25%胰酶（没有用胶原酶，不知何处有卖？）。
培养瓶：新的进口塑料瓶（NUC）和玻璃瓶都试过。
皮源：年轻患者断层皮片（75%酒精消毒）。
消化时间：4℃过夜分离真、表皮，37℃1~2小时消化植被细胞悬液。

多多指教，不胜感激！

作者: bamboo16 时间: 2012-9-27 10:42

求救！！
请问各位高手能否告诉我有关人乳腺癌MCF-7细胞的一些知识。我查的文献有限，只知道MCF-7有一种是雌激素受体阳性的类型，但不知道还有没有其他类型。实验紧迫，盼回复！！

作者: bamboo16 时间: 2012-9-27 10:43

小米粒样圆形物体有可能是衣原体或者是支原体污染，很顽固的，希望要注意无菌操作哦

作者: hyuu 时间: 2012-9-27 10:43

请教大家：
细胞裂解液有很多种，应该怎样进行选择。我做的是内皮细胞，想做细胞内的一种酶的活性，不知采用什么样的方法进行细胞的破碎。

作者: hyuu 时间: 2012-9-27 10:45

不好意思，想请教哪位同仁，在不同的培养板中细胞密度应怎样进行选择（如96也，24孔，12孔，6孔）。先谢谢了。

作者: yychen 时间: 2012-9-27 10:45

我培养的HCT 116 出现一道一道的现象，象波纹。请问为什么？

作者: BUK 时间: 2012-9-27 10:47

请教各位高手，怎样对付霉菌污染，如培养箱怎样清洗，灭菌等？急！
流感病毒除了MDCK细胞外，还有什么培养细胞？
谢谢。

作者: toy 时间: 2012-9-27 10:49

请教大家：
神经细胞原代培养应注意哪些问题？谢谢！！！

作者: nn255 时间: 2012-9-27 10:51

请问哪些老兄培养HepG2细胞？向你们学习，请问细胞培养常用的培养基DMEM外还可用其他什么？用G418选择该怎么用？还有什么其他特别的要求吗？先谢了!

作者: glass 时间: 2012-9-27 10:52

我做的是维甲酸对细胞凋亡的放疗增敏作用,但是做的凋亡率很低,各位朋友哪位能帮我一把,我在这里多谢了

作者: toy 时间: 2012-9-27 10:53

我最近也在养293细胞，我的感觉是293有些娇嫩，一旦长多了就很容易浮起，老化，所以掌握传代的时机很重要，一般如果等到长的都挤在一起了就已经开始老化了，传代后效果和活力也会下降，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
当然，还有一个关键的地方是消化下来后能否吹打散也是决定细胞能否长好的重要地方，我的一个师兄教了我一个很好的方法，传统都是加胰酶，温箱37度2-5分钟后取出再拿培养液中和，吹打后分瓶，但是他的方法是从4度冰箱把胰酶事先取出在室温先放放，使其恢复活力，加了胰酶后就不放温箱，就一直放在室温下，准确的是说在显微镜下持续观察，一旦细胞变圆，边界收缩了就立刻把胰酶倒掉，这样的消化效果是最好的，而且不容易导致消化不够或者消化过头，因为不同时间配置的胰酶，不同温度，不同情况下胰酶的作用和消化能力会有差别，所以一般很难掌握在温箱里的时间，所以在显微镜下观察是最直接的，也最方便~~~虽然说胰酶在37度是效果最好，但是因为事先就把胰酶取出放在室温复温后效果也不会相差太大的~~~呵呵
大家有兴趣的话可以试试看这个做法，至少我们这里用的是很好的的（而且这个方法是以前到上海的某个实验中心去偷拳头学来的哈哈`~~）

作者: gogo 时间: 2012-9-27 10:53

各位，求教神经细胞（神经元和胶质细胞）的培养时注意要点，神经元和星形胶质细胞都可以用DMEM和F12（1：1）+双抗的培养液吗？在星形胶质细胞的分离、纯化时应注意什么？

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 10:54

恳求各位援助！怎样对付霉菌污染？培养箱，塑料皿外壁应该如何处理？急急！
还请问，流感病毒有哪些培养细胞？感激不尽！

作者: dongdongqiang 时间: 2012-9-27 10:54

你们好！请问谁培养过视网膜色素上皮细胞吗？哪儿有卖？谢谢！

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:55

Copyright American Thoracic Society Mar 1, 2004

abstract
It is controversial whether mutations in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator intrinsically dysregulate inflammation. We characterized passage 2 human tracheobronchial epithelial cell cultures morphologically and physiologically and determined whether cytokine production or nuclear factor-[kappa]B activation was systematically altered in cystic fibrosis (CF) cells. Non-CF and CF cells originating from a total of 33 and 25 lungs, respectively, were available for culture on plastic or at an air-liquid interface until well differentiated. Forskolin-stimulated short-circuit currents were present in representative polarized non-CF cultures and were absent in CF cultures, whereas uridine 5''-triphosphate-stimulated currents were present in both. Constitutive or interleukin (IL)-1[beta]-induced IL-8 or IL-6 secretion or nuclear factor-[kappa]B activity was not significantly different between non-CF and CF cells. The cytokines regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) and IL-10 were not detectable. Stimulation with tumor necrosis factor-[alpha] or a synthetic toll-like receptor 2 agonist or variable doses and times of Staphylococcus aureus culture filtrate revealed a single dose- and time-dependent difference in IL-8 production by CF cells. Interestingly, although IL-8 secretion after stimulation with Pseudomonas aeruginosa filtrates was not greater in CF cells in the absence of human serum, it was variably greater in its presence. Thus, although exaggerated responses may develop under certain conditions, our results do not support an overall intrinsically hyperinflammatory phenotype in CF cells.

Morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) are largely due to chronic endobronchial bacterial infection with severe neutrophilic inflammation. Ongoing infections result from impaired mucociliary clearance subsequent to defective ion transport, which depletes the periciliary liquid layer and raises mucus viscosity (1). Defects in antimicrobial activity (2), diminished binding and uptake of Pseudomonas aeruginosa by epithelial cells (3), or defective neutrophil phagocytosis (4) may also contribute. The efficacy of antiinflammatory therapies (5, 6) underscores the importance of inflammation to cause loss of lung function. Increased interleukin (IL)-8 and neutrophils found in CF bronchial lavage fluid without apparent infection (7, 8) or when normalized for bacterial burden (9, 10) suggest that defective CF transmembrane conductance regulator (CFTR) might directly dysregulate inflammation. It is reported that fetal human CF airways and lung tissues, even when sterile, accumulate more leukocytes compared with non-CF airways when implanted in immune-deficient mice (11, 12). However, the notion of inflammation without infection as a primary defect in CF infants has been challenged (13).

Several cell culture studies support the concept of dysregulated inflammatory responses in CF epithelial culls. IL-8 and IL-6 secretion in response to P. aeruginosa was elevated and more sustained in CFTR mutant cell lines (14, 15), and higher baseline nuclear factor-[kappa]B (NF-[kappa] activation was reversed by the introduction of normal CFTR or by culture at permissive temperature (16). Excessive cytokine production may reflect a cell stress response caused by mutant, misfolded CFTR accumulation in the endoplasmic reticulum, but cells with the G551D mutation, which express and traffic inactive CFTR to the cell surface, also had enhanced Ca^sup 2+^ signaling and greater NF-[kappa]B activity (17). Similarly, two groups (18, 19) found that CF tracheal gland cells exhibit elevated basal and stimulated levels of IL-8 and IL-6. The CF gland cells had reduced levels of the inhibitor of nuclear factor [kappa]B[alpha] (I[kappa]B[alpha]), which was reversed by genistein, presumably because of enhanced delivery of mutant CFTR to the cell surface (20). Hypertonic stress also had a greater IL-8-inducing effect on CF gland cells (21), perhaps indicating a lower "stress threshold." Furthermore, a recent report showed equal baseline but higher tumor necrosis factor-[alpha] (TNF-[alpha])-stimulated NF-[kappa]B activity and IL-8 production in a CF cell line that was ascribed to altered I[kappa]B[beta], rather than I[kappa]B[alpha], activity (22).

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:55

Other studies suggest no or only small differences related to inflammation in CF cells. In primary human epithelial cells or cell lines on plastic, release of regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) was dependent on CFTR expression, but basal or stimulated secretion of IL-8 or monocyte chemoattractant protein-1 was independent of CFTR status (23). No differences between CF and non-CF derived cell lines were observed for secretion of IL-8 or IL-6 induced by a variety of stimuli, including P. aeruginosa products (24). Similarly, no differences between CF and non-CF cell lines were found for IL-8 production in experiments in which correction of the CFTR defect normalized Cl" secretion and P. aerugmoi« adherence (25). Still another study failed to detect differences in TNF-[alpha]-stimulated IL-8 secretion between paired cell lines where CFTR deficiency was corrected by an adenoviral vector (26). Reduced, as opposed to increased, IL-8 production by CF cell lines was reported that was reversed by the introduction of wild-type CFTR (27). Cells freshly harvested from inflamed CF lungs showed evidence for enhanced cytokine production (28), but no difference in baseline or stimulated IL-8 secretion due to CFTR status was detected after time in primary culture (26). No significant differences in basal IL-8 production or NF-[kappa]B activation were observed in primary nasal epithelial cells from CF versus non-CF donors, but P. aeruginosa adhered more readily and thus elicited a greater IL-8 response in CF cells (29). Thus, it remains controversial whether intrinsically exaggerated inflammatory responses result from mutations in CFTR.

Passaged and cryopreserved primary human tracheobronchial epithelial (hTBE) cells can be grown at an air-liquid interface (ALI), where they become well differentiated, resembling the in vivo morphology. We sought to establish whether passaged CF and non-CF hTBE cells grown at an ALI until well differentiated were similar morphologically and displayed physiologic properties consistent with their genotype. We then examined whether cytokine production or NF-[kappa]B activation was systematically altered in CF cells at baseline or in response to several relevant challenges, including IL-1[beta], sterile culture filtrates of Staphylococcus aureus and P. aeruginosa, a synthetic toll-like receptor (TLR)-2 agonist or TNF-[alpha].

METHODS

Cell Culture

Human lung tissue was procured under an institutional review boardapproved protocol, and epithelial cell harvest and culture were performed using established procedures (30, 31). Samples originated from a total of 33 non-CF and 25 CF lungs (Table 1). Cryopreserved passage 1 cells were cultured in bronchial epithelial growth medium on Vitrogencoated plastic dishes. At 75-90% confluence, passage 2 cells were transferred to type IV collagen-coated Snapwells (Corning Costar, Cambridge, MA) for use in Ussing chambers or 0.4-µm T-Clear (Corning Costar) or Millicell CM membranes (Millipore, Bedford, MA) in low-endotoxin ALI medium (32). Beginning at Days 7-10, cells were maintained at an ALI. Histology was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded cells at Day 21. Passage 2 cells were also cultured on 96-well plastic plates (35,000 cells/well) in bronchial epithelial growth medium. For all experiments, the minimum sample size was cultures from four individuals, but the sample size ranged up to 11. Samples were obtained from triplicate culture wells.
TABLE 1. DEMOGRAPHICS OF AIRWAY TISSUE DONORS AND GUIDE TO EXPERIMENTAL USE OF CELLS

Bioelectric Properties

Six and 21 days after formation of an ALI, Snapwell inserts were mounted in Ussing chambers (Physiologic Instruments Inc., San Diego, CA). The epithelium was voltage clamped, and short-circuit current (I^sub sc^) and transepithelial resistance measured (Physiologic Instruments). Data were analyzed using Acquire and Analysis (version 1.2) software (Physiologic Instruments). Solutions and compound additions are given in the online supplement.

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:56

Bacterial Filtrates

S. aureus strain ATCC 29213 and P. aeruginosa strain ATCC 27853 were grown in trypticase soy broth for 72 hours at 37° with shaking at 250 rpm. Cultures were centrifuged at 5,500 × g (4°C) for 30 minutes, and supernatants were 0.45 µm filtered, aliquoted, and stored at -20°C.

Cell Stimulation and Biochemical Measurements

Well differentiated cells on membranes and poorly differentiated cells grown on plastic were challenged with IL-1[beta], S. aureus, or P. aeruginosa filtrates, the TLR-2 agonist S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2-RS)-propyl]-N-palmitoyl-(R)-Cys-(S)-Ser-Lys4-OH, trihydrochloride (Pam3Cys), or TNF-[alpha] as indicated. Cytokines, lactate dehydrogenase (LDH), and DNA were assayed as described in the online supplement.

Electrophoretic Mobility Shift Assays

hTBE cells on 24-mm inserts were treated with buffer or IL-1[beta] (5 ng/ml) for 1 hour, and nuclear extracts were prepared from three replicate wells and processed as described previously (32). Loading of gels was normalized for the protein content of the nuclear extracts.

Statistical Analysis

Data are presented as the means ± SEM. Raw cytokine concentrations, fold changes versus control subjects, or values normalized for DNA are given as indicated. Log transformation was used to achieve a normal distribution, and analysis of variance with standard weighted means was performed using VassarStats software (cuturl('http://faculty.vassar.edu./') lowry/VassarStats.html). Where appropriate, significance between groups was determined using Tukey's lest and was accepted if p was less than 0.05.

RESULTS

It is controversial whether the CF defect intrinsically alters the production of inflammatory mediators by airway epithelial cells. Although many prior investigations used cell lines, our approach was to study well differentiated, passaged, primary non-CF and CF hTBE cells.

Morphologic and Electrophysiologic Properties of Well Differentiated hTBE Cells

In an initial experiment, we simultaneously thawed cryopreserved primary epithelial cells derived from six non-CF and six CF airway specimens. All 12 cultures were initiated simultaneously, thus minimizing one source of experimental variability, and all cultures grew well as passage 1 cells on plastic and were transferred to porous supports as passage 2 cells. All passage 2 cells became confluent within 7-10 days, at which point an ALI was established. By 21 days after ALI, both CF and non-CF hTBE cells differentiated into a pseudostratified mucociliary epithelium resembling the in vivo phenotypc. Although there was some variability in the thickness of the cell layer, the percentage of mucous goblet cells, and the extent of ciliation, there were no systematic morphologic differences related to derivation from non-CF versus CF airways. Representative photomicrographs are shown in Figure 1.

Using replicate cultures from the same 12 individuals, we determined whether polarized hTBE cells were physiologically consistent with their CF versus non-CF genotype. We performed Ussing chamber studies of all specimens at 6 days after ALI and in five of six CF and four of six non-CF specimens at 21 days after ALI. Representative tracings and the mean data are given in Figure 2 and Table 2. At Day 6, forskolin did not stimulate I^sub sc^ in any of the CF cultures but did in all six of the non-CF cultures, whereas both cell types responded to uridine 5''-triphosphate. At 21 days after ALI, CF and non-CF cells demonstrated similar basal I^sub sc^, and the I^sub sc^ from the CF cells had a significantly larger amiloride-sensitive component compared with normal subjects. Similar to the earlier time point, forskolin did not stimulate I^sub sc^ in CF cells but did in non-CF cells, whereas both cell types responded to uridine 5''-triphosphate. Thus, the electrophysiologic properties of the polarized cultures reproduce important features of the CF airway epithelial phenotype.

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:56

Figure 7. Representative histology of non-cystic fibrosis (CF) (A) and CF ( well differentiated Day 21 air-liquid interface (ALI) human tracheobronchial epithelial (hTBE) cell cultures. Both cell types reproduced a pseudostratified mucociliary epithelium that resembled the in vivo phenotype. The T-Clear porous support is visible below the cells. Original magnification ×200, hematoxylin and eosin stain.

Cytokine Secretion at Baseline and in Response to IL-1[beta]

Excessive basal or stimulated cytokine secretion has been implicated in the pathogenesis of CF airway inflammation. Therefore, we quantitated IL-8 or IL-6 secretion by replicate wells of the same set of cultures that we had characterized morphologically and electrophysiologically (Figure 3). We used 5 ng/ml of IL-1[beta] a commonly used dose shown to be just beyond the beginning of the plateau response level in preliminary dose-response experiments (data not shown). Unstimulated non-CF and CF cultures produced similar amounts of IL-8 (2.3 ± 0.5 and 1.6 ± 0.4 ng/ml, respectively). Sham treatment (phosphate-buffered saline [PBS] instead of PBS plus IL-1[beta]) did not increase IL-8 secretion in either type of culture, whereas stimulation with IL-1[beta] increased the levels of IL-8 nearly 10-fold. However, there were no statistically significant differences in IL-8 secretion between non-CF and CF cells (13.9 ± 1.8 and 16.1 ± 1.6 ng/ml, respectively), even when expressed as fold changes (8.26 ± 1.65 and 12.26 ± 3.81, respectively). In this experiment, baseline secretion of IL-6 was undetectable in most cultures, and stimulation with IL-1[beta] increased IL-6 somewhat more in CF than in non-CF cultures (417 ± 80 and 183 ± 63 pg/ml, respectively), but the change was not significant by analysis of variance of logtransformed values (p = 0.16). Fold change comparisons for IL-6 were not possible because so many of the starting values were 0. Neither IL-10 nor RANTES was detectable in these cultures.

Activation of NF-[kappa]B at Baseline and in Response to IL-1[beta]

Because the promoter region of several important inflammatory mediators, including IL-8 and IL-6, contain NF-[kappa]B consensus sites and because of reports of constitutive activation of NF-[kappa]B in CF cells, we performed NF-[kappa]B electrophoretic mobility shift assay in the same set of CF and non-CF hTBE cultures in which morphology, physiology, and cytokine release were studied (Figure 4). Both CF and non-CF nuclei contained low levels of NF-[kappa]B that were increased substantially after IL-1[beta] stimulation. There was no evidence that CF hTBE cells expressed higher levels of the active p65/p50 heterodimer (upper band) than non-CF hTBE cells, either before or after stimulation. The unlabeled NF-[kappa]B consensus but not the mutant oligonucleotide competed binding with the labeled oligonucleotide, demonstrating the specificity for NF-[kappa]B, and antibodies against p50 and p65 produced the expected supershifts.

Figure 2. Representative tracings and summary data from Ussing chamber studies of Day 6 (A and C) and Day 21 (B and D) hTBE cell cultures. At Day 6, a forskolin (Forsk)-stimulated current was present in all six of the non-CF cultures but was absent from all CF cultures, whereas both cell types responded to uridine 5''-triphosphate (UTP). At Day 21, a greater proportion of the baseline I^sub sc^ was amiloride (Amil) sensitive in CF cells, and a forskolin response was present only in non-CF cells, whereas both cell types responded to UTP. In C, n = 6, except for the UTP bars, where n = 2 and 1 for CF and normal subjects, respectively. In D, n = 5 and 4 for CF and normal subjects, respectively, except for the UTP bars, where n = 3 and 4 for CF and normal subjects, respectively. I^sub sc^ = short-circuit current.

Cytokine Production in Response to Exogenous Stimuli

Because airway infection is a hallmark of CF, we performed experiments in which hTBE cells were exposed to soluble products from relevant bacterial pathogens. To model in vivo exposure, we added sterile filtrates of late stationary phase S. aureus or P. aeruginosa cultures, or similarly treated bacterial growth medium (trypticase soy broth) as the control, to the apical surface of polarized cells. Doses were chosen based on preliminary studies showing lack of overt toxicity of S. aureus and P. aeruginosa filtrates up to 10% and 20%, respectively, as indicated by maintenance of a patent ALI. S. aureus filtrates appeared more damaging to the cultures as manifest by fluid leak upon 48-hour exposure to the 20% dose. The S. aureus filtrates caused modest dose-dependent cellular cytotoxicity, as measured by LDH release, and non-CF cells seemed more susceptible (see Figure E1 in the online supplement). Forty-eight-hour treatment with P. aeruginosa filtrate, at any tested dose up to 20%, did not cause LDH release over control values. Thus, 10% S. aureus or 20% P. aeruginosa doses were chosen for most subsequent experiments. During a 24-hour exposure, 10% S. aureus or 20% P. aeruginosa filtrate both induced an approximately fourfold increase in IL-8 secretion (Table 3). There were no statistically significant differences between non-CF and CF cells (Table 3, experiment 3.1). Human serum, as a source of LPS binding protein and soluble CD14, greatly enhances the response of human monocytes to the TLR-4 agonist LPS (33). Culture filtrates from the Gram-negative organism P. aeruginosa likely contain LPS among other active components. Therefore, we stimulated well differentiated hTBE cell cultures from seven non-CF or seven CF individuals with P. aeruginosa filtrates or the bacterial medium control (trypticase soy broth) in the presence of 10% human serum (Table 3, experiment 3.2). Human serum alone increased IL-8 levels (compare Table 3, experiments 3.1 and 3.2), but there was still an approximately fourfold increase after P. aeruginosa exposure.

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:57

TABLE 2. BASAL ELECTROPHYSIOLOGIC CHARACTERISTICS OF NONCYSTIC FIBROSIS AND CYSTIC FIBROSIS CELLS MEASURED IN USSING CHAMBERS AS DESCRIBED
Figure 3. Box plot representation of interleukin (IL)-8 (A) and IL-6 ( production by Day 21 hTBE cells as measured by ELISA. Basal medium was sampled before and after a 17-hour IL-1[beta] exposure. Sham treatment was performed with phosphate-buffered saline (PBS) instead of PBS plus IL-1[beta]. The top, middle, and bottom lines of the boxes correspond to the 75th, 50th, and 25th percentiles, and the whiskers are the 90th and 10th percentiles. The filled rectangle is the arithmetic mean. Triplicate wells were used, and each sample was assayed in duplicate (n = cells from six different individuals). After log transformation to achieve normality, analysis of variance indicated that the differences between non-CF and CF cells were not significant.

Figure 4. Nuclear factor-[kappa]B (NF-[kappa] electrophoretic mobility shift assay. Nuclear extracts were prepared from well differentiated non-CF and CF cells with or without IL-1[beta] stimulation. Each lane originated from an equal amount of nuclear protein extract. The bands were specific for NF-[kappa]B, as demonstrated by competition with nonradioactive consensus NF-[kappa]B oligomer and the lack of competition by a mutant consensus sequence. Antibodies specific to p50 and p65 NF-[kappa]B subunits resulted in a supershift. Both CF and non-CF cells exhibited low basal levels of nuclear NF-[kappa]B. After stimulation with IL-1[beta], both CF and non-CF cells shifted NF-[kappa]B to the nucleus, and the predominant band was composed of p50/p65 heterodimers.

In this experiment, there was great variability in the range of both baseline values and fold increases, and there were no significant differences between non-CF and CF cells. The bacterial supernatants contain a mixture of compounds that can activate cells through TLRs and other mechanisms. Because our previous mRNA analysis indicated that hTBE cells express TLR-2 (32), we also exposed the cells to the synthetic TLR-2 agonist Pam3Cys. To accommodate a more extensive comparison between CF and non-CF cultures (n = 11 each), we chose the inactive OH3Cys analogue as the control rather than media alone. IL-H levels in the OH3Cys-treated cells were higher than in previous control cultures. Nevertheless, hTBE cells responded specifically to Pam3Cys with robust IL-8 production, and the difference between non-CF and CF cells was insignificant (Table 3, experiment 3.3).

TABLE 3. INTERLEUKIN-8 SECRETION (ng/ml OR AVERAGE FOLD INCREASE AS INDICATED) IN RESPONSE TO BACTERIAL PRODUCTS OR A SYNTHETIC TOLL-LIKE RECEPTOR 2 AGONIST

Secretion of IL-6 in response to bacterial supernatants was examined in the absence or presence of human serum (Table 4, experiments 4.1 or 4.2, respectively). In accordance with the IL-8 data, human serum alone increased IL-6 secretion, and P. aeruginosa or S. aureus filtrates further increased IL-6 secretion at least threefold under all conditions. Interestingly, secretion of IL-6 in the trypticase soy broth control was substantially lower in the CF groups, resulting in a greater fold increase in IL-6 in CF cells. However, because of variability between donors, the difference between CF and non-CF cultures was not significant.

Cytokine Production in Poorly Differentiated hTBE Cells in Response to Endogenous and Exogenous Stimuli

Because many previously reported studies involving non-CF versus CF cytokine production were performed using poorly differentiated cells or cell lines, we determined whether differences were detectable in primary cells before they assumed a mucociliary phenotype. For this purpose, hTBE cells were cultured on plastic until confluence and then exposed to media alone, the endogenous cytokines IL-1[beta], TNF-[alpha], or the synthetic TLR-2 agonist Pam3Cys and its control, OH3-Cys. As indicated in Figure 5, there were no statistically significant differences in IL-8 production between poorly differentiated non-CF and CF cells.

Dose- and Time-dependent IL-8 Production in Well Differentiated CF and non-CF hTBE Cultures

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:57

A study comparing CFTR-deficient with CFTR-sufficient cell lines indicated that hyperinflammatory responses in CF cells became more apparent on prolonged stimulation (15). Because our previous studies might have missed dose- and/or time-dependent differences between non-CF and CF cells, we stimulated well differentiated hTBE cultures with varying concentrations of bacterial filtrates, sampling the basolateral medium at 8, 24, and 48 hours. IL-8 secretion is presented as fold increase over the trypticase soy broth control at 8 hours (Figure 6). S. aureus treatment was performed in the absence of human serum, and P. aeruginosa challenges were performed in both the absence and presence of 10% human serum. Control IL-8 secretion was not different between non-CF and CF cultures, and similar increases were observed over time (note the different scales at 8, 24, and 48 hours in Figure 6). Except for the 20% group at 8 hours, S. aureus filtrates elicited similar IL-8 secretion in nonCF and CF cells at all time points; 20% P. aeruginosa filtrate in the absence of serum stimulated 10- to 20-fold increases in IL-8 at 24 and 48 hours, respectively, and there were no statistically significant differences between non-CF and CF cells. In contrast, when P. aeruginosa was added in the presence of human serum, in this experiment, IL-8 secretion by CF cells was significantly greater at all time points. The differences became most apparent at the 48-hour time point where only modest increases in IL-8 over control values were seen in non-CF cells, compared with a doubling at the higher P. aeruginosa doses in CF cells. Because cell proliferation during 48 hours of culture may differ between non-CF and CF cells, we measured the DNA at the end of the 48-hour exposure and normalized IL-8 levels for DNA content (Figure 7). Again, CF versus non-CF differences were not significantly different, except for P. aeruginosa stimulation in the presence of human serum. Thus, normalization for DNA content did not alter the results.

TABLE 4. INTERLEUKIN-6 SECRETION (PG/ML OR AVERAGE FOLD INCREASE AS INDICATED) IN RESPONSE TO BACTERIAL PRODUCTS

DISCUSSION

Evidence for excessive neutrophil dominated inflammation in bronchial lavage fluid from CF patients when compared with non-CF individuals has been documented (6-8), but the cause is not clear. In vitro studies performed with nasal or bronchial epithelial cells from CF or non-CF individuals or with immortalized cell lines in which CFTR status has been manipulated give conflicting results, ranging from increased NF-[kappa]B activation and production of IL-8 to no changes or even decreased levels of inflammatory cytokines (14-17, 22-27). Thus, it is controversial whether excessive pulmonary inflammation is an intrinsic property of the CFTR defect or whether it is secondary to the unique environment of the CF lung.

Figure 5. IL-8 production by poorly differentiated hTBE cultured on plastic. hTBE cells were treated with media alone, stimulated as described with OH3Cys (inactive analogue of Pam3Cys, 25 µg/ml), Pam3Cys (25 µg/ml), tumor necrosis factor-[alpha] (TNF-[alpha]) (25 ng/ml), or IL-1[beta] (10 ng/ml) for 24 hours when supernatants were collected for IL-8 quantitation by ELISA. The data are means ± SEM from triplicate wells of cells derived from 11 different non-CF and CF lungs. Statistically significant differences between non-CF and CF groups were not present as indicated by analysis of variance.

Our studies focused on primary airway epithelial cells. The culture methods employed included an expansion to a second passage. Samples from a total of 33 non-CF and 25 CF lungs were available for comparison. When cultured at an ALI until well differentiated, the cells mimicked many features (polarity, I^sub sc^, cAMP-sensitive Cl conductance, fluid absorption, mucus transport) expected of normal and CF airway epithelium (Figure 1) (1). Unlike transfected cell lines, these passage 2 hTBE cells are likely to express physiologically relevant numbers of mutant and normal CFTR channels, as manifested by their electrophysiologic properties. Under these conditions, there was no evidence that CF-derived cells contained more activated NF-[kappa]B or secreted more IL-8 than non-CF cells, either in their basal state or when stimulated with IL-1[beta]. IL-10 or RANTES was not detectable in these cultures. IL-6 production in CF cells stimulated with IL-1[beta] was somewhat greater than in non-CF cells, but the difference was not statistically significant.

Airway epithelial cells express m RN A for many of the TLRs, including TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, and TLR-6 (32). The bacterial products used in our studies likely stimulate hTBE cells through these receptors, activating characteristic downstream signal transduction pathways. In the absence of human serum, neither S. aureus or P. aeruginosa filtrates (with exception of the 20% S. aureus dose at 8 hours) nor a synthetic TLR-2 agonist revealed any differences in IL-8 or IL-6 secretion in well-differentiated hTBE derived from non-CF or CF lungs. The lack of differential sensitivity to relevant proinflammatory agents was not a result of prolonged culture to achieve a mucociliary phenotype, as poorly differentiated cells on plastic did not show differences in cytokine- or TLR-2 agonist-stimulated IL-8 secretion due to CFTR status.

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:58

Interestingly, when hTBE cultures were exposed to P. aeruginosa filtrate in the presence of human serum, significant differences sometimes became apparent between non-CF and CF cells. IL-8 secretion by both cell types continued to increase over time. CF cells demonstrated continuous dose responsiveness to P. aeruginosa filtrate, whereas the stimulatory effects of P. aeruginosa on non-CF cells seemed to wane, especially at the 48-hour time point. An initial experiment failed to reveal significant differences between CF and non-CF hTBE cells to P. aeruginosa filtrates at 24 hours even when human serum was present (Table 4). It is possible that variability between donors, including coincidentally clustered hyperresponders in the non-CF group, masked any differences in this particular experiment. Non-CF versus CF differences may have become apparent if this initial experiment was extended to 48 hours. However, there was a clear increase in P. aeruginosa-stimulaled IL-8 production by CF cells in the presence of human scrum in a second experiment. Overall, our data indicate that inflammatory responses of non-CF and CF cells are not globally different but that exaggerated responses may develop in CF cells under specific conditions. The significant differences in our experiments were never greater than 2.5-fold. CF cells may be more sensitive to synergism between serum and P. aeruginosa-derived factors, and it is possible that when multiple proinflammatory pathways are activated, non-CF cells are more capable of limiting their responsiveness than CF cells. As the studies presented here were under review, data were published comparing intercellular adhesion molecule-1 upregulation or IL-8 secretion in response to TNF-[alpha], IL-1[beta], killed whole Haemophilus influenzae or P. aeruginosa in primary hTBE cells from eight non-CF and eight CF donors (34). These studies support our findings that differences between non-CF and CF cells are apparent only under specific conditions and that donor-to-donor variability complicates their detection.

Figure 6. IL-8 production by well differentiated non-CF and CF hTBE cells. Time course and dose response to 5. aureus (S. a.) or P. aeruginosa (Ps. a.) in the absence of human serum (top) or P. aeruginosa in the presence of 10% human serum (bottom). ALI hTBE cell cultures were apically challenged with the indicated concentrations of bacterial filtrates. IL-8 in the basolateral media was measured by ELISA at 8, 24, or 48 hours. All data are presented as the means ± SEM of fold increases over the corresponding control value (0% bacterial filtrate, 20% trypticase soy broth) at 8 hours. Absolute levels are indicated on the 8-hour panels, n = 8 for the non-CF group and 9 for the CF group except for the 2.5% and 20% doses of 5. aureus, the 20% P. aeruginosa dose without serum, and the 2.5% and 10% dose of P. aeruginosa with serum where n = 4 and 5 for non-CF and CF, respectively. Differences between non-CF and CF groups were determined by analysis of variance and Tukey's-post hoc test and are denoted by *p < 0.05 or **p < 0.01, respectively.

Figure 7. IL-8 production in well differentiated non-CF and CF hTBE cells after normalization for DNA content per culture well. ALI hTBE cell cultures were apically challenged with 10% S, aureus or P. aeruginosa in the absence of human serum or 20% P. aeruginosa in the presence of 10% human serum as indicated. IL-8 in the basolateral medium and DNA in the cell layer was measured by ELISA and a fluorescence-based kit, respectively, n = 8 for the non-CF group and 9 for the CF group except for P. aeruginosa without serum where n = 4 and 5, respectively. Statistically significant differences between non-CF and CF groups were determined by analysis of variance and Tukey's post hoc test and are denoted **p < 0.01.

It is important to note that all in vitro cell culture systems are only an approximation of the actual in vivo physiologic state. The electrophysiologic properties of the CF epithelium in vivo include a higher baseline potential difference thought to represent hyperactivity of epithelial sodium channels and higher I^sub sc^ responses to calcium mobilizing agonists such as uridine 5'-triphosphate (35, 36). Although the non-CF and CF passage 2 cultures we studied were absolutely faithful to their genotype regarding the absence or presence of cAMP stimulated currents, the CF cells did not exhibit higher baseline potential differences or exaggerated uridine 5'-triphosphate responses. One could argue that the intrinsic hyperinOammatory defect is linked to the sodium channel and calcium-activated chloride channel abnormalities. In vitro cultures displaying hyperactivity of sodium and calcium activated chloride channels will be necessary to resolve this question.

Studies using cell lines offer the attractive feature of manipulating CFTR status on an isogenic background. The exact cause for paradoxical results between the many reports using different paired CF and non-CF cell lines is unknown. In the recently published study of Aldallal and colleagues (34), significant differences in IL-8 secretion ascribed to CFTR correction could be demonstrated in one but not another set of paired cell lines. The differences may relate to altered gene expression patterns or changes in signal transduction pathways induced during the generation of the specific cell lines. Many cell lines are unstable and ancuploid because of the action of the transforming oncogenes used in their creation. In many cases, cell lines may be separated by many passages and may have accumulated differences other than CFTR status.

In summary, IL-8 secretion and NF-[kappa]B activation, at baseline or in response to a diverse set of relevant stimuli, were generally similar in a representative sample of passaged primary CF and non-CF hTBE cells that morphologically and physiologically reproduce many features of the in vivo bronchial epithelium. Only under certain conditions, such as P. aeruginosa in the presence bul not in the absence of serum, was there an exaggerated and sustained but somewhat variable IL-8 response in CF cells. Our results suggest that intrinsic baseline differences in inflammation due to mutant CFTR per se are not a primary cause for the hyperinflammatory status of the CF lung. More likely, severe inflammation occurs in response to bacteria, their products, and host factors that accumulate in the unique environment created by defective mucociliary clearance in the CF lung. Under these circumstances, it is possible that CF cells are less capable of downregulating proinflammatory responses.

作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:58

Conflict of Interest Statement: M.N.B. has no declared conflict of interest; M.S.S. has no declared conflict of interest; M.S.M. has no declared conflict of interest; A.J.H. has no declared conflict of interest; Q.W. has no declared conflict of interest; M.W.V. has no declared conflict of interest; S.H.R. serves as a consultant for Vertex Pharmaceuticals and has received a speaking fee for work not related to the subject of this manuscript.

Acknowledgment: The authors thank the Tissue Procurement/Cell Culture and Histology Cores of the University of North Carolina CF/Pulmonary Research and Treatment Center for excellent service. They also thank Dr. Harry Hurd of the University of North Carolina Department of Statistics for expert consultation.

[参考]
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作者: tieshazhang 时间: 2012-9-27 10:59

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[作者单位]
Marie N. Becker, Mariam S. Sauer, Marianne S. Muhlebach, Andrew J. Hirsh, Qi Wu, Margrith W. Verghese, and Scott H. Randell
Cystic Fibrosis/Pulmonary Research and Treatment Center, Department of Medicine; Department of Cellular and Molecular Physiology; and Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina

[作者单位]
(Received in original form July 29, 2002; accepted in final form December 9, 2003)
Supported by the Cystic Fibrosis Foundation and National Institutes of Health grants HL58345, HL 60280, and HL 51818.
Correspondence and requests for reprints should be addressed to Scott H. Randell, Ph.D., UNC CF Center, CB 7248, 4011 Thurston-Bowles, Chapel Hill, NC 27599. E-mail: randell@med.unc.edu
This article has an online supplement, which is accessible from this issue's table of contents online at cuturl('www.atsjournals.org')
Am J Respir Crit Care Med Vol 169. pp 645-653, 2004
Originally Published in Press as DOI: 10.1164/rccm.200207-765OC on December 11, 2003
Internet address: cuturl('www.atsjournals.org')

作者: bling 时间: 2012-9-27 10:59

我想问一下能不能用MTT法测悬浮的细胞的活性，请尽快回复，不胜感激！

作者: 04906 时间: 2012-9-27 11:00

请问那位高手在培养视网膜色素上皮细胞？能否切磋一下？谢谢！

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:00

楼主看了你的帖子，是不是悬浮的细胞也可以用MTT法检测细胞活性的。是不是每次换液都需要离心，特别是最后加入MTT后就需要离心祛除含有MTT的培养液，然后加DMSO，请指导，我想用MTT法测悬浮细胞的活性！

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:01

您好，我看到你说的关于MTT法测悬浮细胞的方法，提到可以不用离心板的方法，但是你发的附件的文献是要用到离心的，可否提供一篇不用离心的文献参考。我想知道具体的操作步骤。特别是加MTT后，如果不离心加SDS溶解过夜后，在用酶标仪测前，里面的液体也不用倒出来，而是直接测吗？望指导！

作者: one 时间: 2012-9-27 11:02

在读临床专业硕士,毕业课题只做细胞培养,能符合毕业论文要求不?

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:02

我想你如果只做细胞培养，但是毫无目的，根本没有什么意义，我想是不符合要求的，虽然硕士研究生对实验的质要求很低，只是要求量大，但是我认为细胞培养只是基础，不管怎样应该更深入一点。不然毫无疑义。不过如果是做很难培养的原代培养的细胞，如神经干细胞，并作其鉴定也许可以达到毕业要求！

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:03

楼主：
您好，我看到你说的关于MTT法测悬浮细胞的方法，提到可以不用离心板的方法，但是你发的附件的文献是要用到离心的，可否提供一篇不用离心的文献参考。我想知道具体的操作步骤。特别是加MTT后，如果不离心加SDS溶解过夜后，在用酶标仪测前，里面的液体也不用倒出来，而是直接测吗？望指导！

作者: duoduo 时间: 2012-9-27 11:03

我做悬浮细胞转染，也做MTT，我打算用改良MTT法，有人已经介绍过这篇文献了。评价抗癌物质活性的改良MTT方法，周建军乐秀芳等，中国医药工业杂志.1993.024(010).-455-457

作者: ffooll 时间: 2012-9-27 11:04

请教各位高手，我准备做视网膜神经节细胞的培养，请问用什么培养液较好，如何分离、纯化？

作者: junhun 时间: 2012-9-27 11:05

我是一细胞培养的新手，有问题想请教各。在培养293细胞时细胞贴壁不久，但培养基颜色变得特黄，于是我就给细胞换了液，在倒掉培养基之后，我用PBS将细胞洗了两次（觉得操作还是特小心的），换上了新鲜培养基，后镜检发现培养瓶内残留的细胞很少，请问各位在这种情况下给细胞换液需注意那些方面？

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:05

我想请教这个配方应该怎么配，10%SDS-5%异丁醇-0.012mol/lHCL(w/v/v)，是不是说SDS占总质量的10%，但是后面又是体积比，HCL怎么样计算体积比呢？望指教！

作者: DNA 时间: 2012-9-27 11:06

最近我在培养星形脚质细胞，老是不成功，免疫荧光鉴定结果是阴性，请问各位大侠星形脚质细胞原代培养方法及免疫荧光鉴定方法。多谢了！

作者: yonger 时间: 2012-9-27 11:07

用悬浮培养的细胞做MTT时，加入MTT继续培养4h后如何吸去上清再加入DMSO？

作者: gogo 时间: 2012-9-27 11:07

293细胞贴壁不是很牢靠，所以用PBS洗涤或者每次换新鲜培养基时都很容易造成细胞脱落。我的建议就是在加入PBS或者培养基时将吸管不要对准培养瓶的下壁，加到培养瓶的侧壁或者上壁，再让其缓慢接触细胞，很好用的。

作者: 铜雀 时间: 2012-9-27 11:08

请教各位高手，怎样对付霉菌污染，如培养箱怎样清洗，灭菌等？急！
流感病毒除了MDCK细胞外，还有什么培养细胞？
谢谢。

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我们的培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照（按说明书操作）。约3个月洗一次吧。
预防霉菌污染，我们在培养基里加3u/ml的两性霉素。如果已经污染，有人认为加10倍量的抗生素可挽救，但我们试过一次，效果不是很好。

作者: 831226 时间: 2012-9-27 11:09

我昨天第一次做尝试作悬浮细胞的MTT法，我做的是肝癌细胞。今天中午我加了MTT后也正犹豫不知道该不该吸培养液，然后加DMSO,所以我先做了对照。我将多余的对照孔里面的培养液吸出来后，发现并没有吸出来晶体，在显微镜下观察晶体紧贴着孔壁，和没有吸出培养的孔对照，细胞晶体没有减少。所以我觉得可以直接吸出来但是要小心点。最后酶标仪测出来得结果也不错。
还有就是主任上次提供给我看了一篇这样文献，不过具体步骤没有详写，发给你看看评价抗癌物质活性的改良MTT方法，周建军乐秀芳等，中国医药工业杂志.1993.024(010).-455-457

作者: 987789 时间: 2012-9-27 11:10

请问293细胞冻存如何进行？
是先用胰酶消化分散之后用冻存液稀释保存吗？

作者: 铜雀 时间: 2012-9-27 11:10

加了G418筛选稳定转染的SMMC-7721细胞系,细胞长的非常慢,真是伤脑筋,请问有无同道?

作者: kulee 时间: 2012-9-27 11:12

求教哪里有cell invasion assay kit.谢谢

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:13

主任好：
我准备做人脐静脉内皮细胞培养，我想问一下如果在医院拿到脐带，通过什么保存方法将其拿到实验室呢，医院距离实验室有大概半小时的路程，是不是随便装在袋里就行，还是需要带个保温瓶装上冰带回。请尽快回复，万分感激！

作者: lixi559 时间: 2012-9-27 11:14

我是一细胞培养的新手，有问题想请教各。在培养293细胞时细胞贴壁不久，但培养基颜色变得特黄，于是我就给细胞换了液，在倒掉培养基之后，我用PBS将细胞洗了两次（觉得操作还是特小心的），换上了新鲜培养基，后镜检发现培养瓶内残留的细胞很少，请问各位在这种情况下给细胞换液需注意那些方面？

回复：估计是细胞被你给洗掉了，加入PBS洗细胞时，不要对着细胞加。加入之后轻轻晃动培养瓶来洗细胞，而不要用吸管去冲，PBS温度太低也会影响细胞帖壁，而且我觉得洗一次就可以了，如果实验没有特殊要求的话。单纯的细胞换液可以不用洗的。

作者: 白白的 时间: 2012-9-27 11:15

本人因课题更改，今年2月底购买BD公司的有关B细胞流式抗体，有以下几种：CD19,CD27,CD40,IgD,IgM,IgG。我购买的是79折，谁要更优惠，绝对保证质量

作者: 白白的 时间: 2012-9-27 11:16

请问293细胞冻存如何进行？
是先用胰酶消化分散之后用冻存液稀释保存吗？

首先推荐你去看看《细胞培养》这本书，里面什么都有，呵呵
细胞冻存的步骤一般是这样的：
1，细胞用胰酶消化，注意消化的程度，消化过头或者消化不够都不利于细胞保存
2，吹打后用1500转离心3-5分钟
3，弃去上清液，加冻存液，一般冻存管是1.5ML的，所以估计一下你要装几支，加相应的冻存液，吹打
4，分装到冻存管内，注意不要加满，因为液体变固体后会膨胀~~
5，-4度保存半小时，-20度保存2小时，-80度过夜，然后放入液氮罐就可以拉~~

作者: daod 时间: 2012-9-27 11:17

大家好：我现在在培养成纤维细胞，目前遇到霉菌污染的问题，怀疑是CO2温箱的风轮所致，可又不能拆下，这是出售温箱公司的事，请问用紫外灯照射有杀霉菌的作用吗？还有什么好的办法可以避免污染呢？以前的一个师兄在这儿做细胞培养也总是被霉菌所污染。

作者: ha111 时间: 2012-9-27 11:18

我的亲身体会就是咱们在实验室只能接受实验室规模的培养基产品信息，实际上我几个哥们借给我看得工业标准的培养基，和驯化培养方案会更好操控，比如日本的**，和美国的***牌子。原因可能是工业技术更具有普及意义。

还有一个重要的原则是要守旧如新，但兼顾与时俱进。不要忘记现在的种种专门针对性地培养基也都是从classical来得

作者: ha111 时间: 2012-9-27 11:20

上传一篇细胞培养的手册，希望对刚接触细胞培养的战友有所帮助！

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我培养细胞已有多日，但是发现操作失误的地方很多。比如，NBS的处理我一般都是放于4℃，且超过一个月。所以到来发现悬浮物较多。所以你那贴中的分装冻存的方法不错。
thank u very much !!!

作者: 911 时间: 2012-9-27 11:21

293细胞换液时没有脱壁,但过一段时间又脱掉了，之后有很难贴壁，请问是怎么回事？

作者: TAT 时间: 2012-9-27 11:21

心肌细胞中混有很多血细胞处理办法一般是第一次用胰酶消化时吸取的细胞要弃掉，第二次的上清才离心，收集总管。离心1000转，10min ,每次加0.08%胰酶5ml消化10min就行，我今天作了10只，按7-8*105算，24孔板能接种3板，6孔板每孔接种4ml,密度达到106就可，有不懂得再给我发邮件吧

作者: bongte 时间: 2012-9-27 11:22

293细胞换液时没有脱壁,但过一段时间又脱掉了，之后有很难贴壁，请问是怎么回事？

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293细胞在传代后24-48小时内贴壁，在48小时内一般尽量不要去动它，不然的话刚贴壁的细胞很容易会浮起来，到时候再贴就会分布不均匀或者贴壁不好。还有可能就是你的细胞本来就活力不好，因为细胞在长到80%左右的时候传代是最有活力的，到长满了细胞都比较老，长的也不好，而且293比较难弄就是一旦老化了就很难再抢救回来（我以前就因为过了时机所以最后全军覆没呵呵）~~
你可以从下面的一些方面找找原因：
1，细胞是否本身由过老的传代过来的
2，培养液是否已经不大好（比如颜色已经变化，偏碱；存放时间过长；有否污染）——我用的是10%小牛血清的DMEM，还不错，有人建议用1640或者是加胎牛的培养液呵呵
3，实验操作是否正规，有否污染
4，培养液在使用前可以在室温先放置一会，或者37度水温热一下，可以减少对细胞的刺激~~

我觉得养细胞最重要的是要关心它拉~~你要是两天不去看的话它就要造反了，呵呵~~用点心，我现在细胞长的很茂盛啊~~：）

作者: glass 时间: 2012-9-27 11:22

各位同仁：我正准备培养干细胞，有哪位培养过此类细胞，请多少提供一点经验，在下万分感激！

作者: 四福晋 时间: 2012-9-27 11:23

我刚买的293细胞因污染全军覆没了，请问有没有朋友能支援一些?我在武汉。谢谢大家了！

作者: 四福晋 时间: 2012-9-27 11:27

本人近期要做小鼠胚胎心肌细胞的培养，各位同仁可否提供有关的实验方法，不甚感激！胚鼠太小，不知取其心脏是否较困难。

作者: DNA 时间: 2012-9-27 11:28

哪位知道心肌成纤维细胞的原代培养如何进行?麻烦详细告之.

作者: 131415 时间: 2012-9-27 11:28

293细胞几乎全部裂解了，请问支原体污染或黑胶虫污染会引起这种情况吗？

作者: 气泡 时间: 2012-9-27 11:29

各位高手，我刚刚要养细胞，DC and NK,有这方面经验的同仁能否交流一下？cuifeng0915@hotmail.com，另外有人手里有小鼠黑素瘤细胞系B16/F10（C57BL/6 origin)以及C57BL/6 小鼠（我可能需要免疫分型）吗？对一个新手来说，要急死了，先谢谢各位喽

作者: jujuba 时间: 2012-9-27 11:32

有没有人养BHK-21和VERO细胞的，请过两招来。

作者: bongte 时间: 2012-9-27 11:37

请问不用细胞培养的是否能直接用Annexin v和PI染色流式做细胞凋亡

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-27 11:39

我一直在养293细胞，其实我感觉很好养的。只要注意无菌操作和培养液条件，应该没问题的。除了fanruifang提供的经验外，我还觉得：
1。细胞传代后，不要轻易频繁的触动它，不要经常的观察，
2。有一些293细胞传代后的前几天生长缓慢是很正常的，一般细胞看出明显增多的可能要一周左右，所以不要心急。
3。对PH值要求较高，要注意。

另外，我这里有一些国外进口的原代的293细胞，质量很好，有意者可以提供，具体再商谈。

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-27 11:40

请教各位大侠:
我们养的是sf-9昆虫细胞，在从-70℃或液氮拿出来，复苏后，发现细胞总是死掉的！我们是-70℃或液氮拿出来----37℃水浴30sec----加入20MLSF-II培养基，1300r,5min----细胞沉淀加入10MLSF-II培养基---27℃、70转在摇箱摇----第二天换液,(细胞离心,悬浮方法同前)----3-4天后观察发现细胞几乎都是死的？？
还有想请各位,在震荡培养方式细胞复苏过程中是否应加入F-68(pluronic F-68),是否是必须的???

作者: 987789 时间: 2012-9-27 11:40

近来开始做我的研究生课题，但在取大鼠血管平滑肌细胞进行原代培养时出现困难，请各位有经验的大虾给点指教，先谢谢啦!!!!

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-27 11:42

看样子细胞培养方面的高手很多啊！！！
以后要多向各位学习！
有谁做过肌细胞培养（或相关）方面的？？？
请指导！！谢

作者: zhezhe 时间: 2012-9-27 11:42

我正计划做小鼠脾细胞的增殖实验，有没有什麽办法可以使离体的脾多保持几天活性，以便逐渐处理；另外，在处理脾细胞时还应注意什麽问题；
在处理小鼠的胸腺时发现其特别不容易分离，易碎，如何能获得完整的胸腺而便于称重

作者: zhezhe 时间: 2012-9-27 11:43

用悬浮培养的细胞做MTT时，加入MTT继续培养4h后如何吸去上清再加入DMSO？

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离心

作者: lixi559 时间: 2012-9-27 11:44

请问，什么是“air-liquid interface culture system”，如何找到中文资料？操作复杂吗？谢谢答复！

作者: ending 时间: 2012-9-27 11:44

我于4.14复苏两管细胞, 细胞24小时内帖壁.但生长缓慢,今天已经26号,还没长满.
我想问复苏细胞生长速度是否与以前相比会减慢?什么时候恢复正常?我应该做哪些工作?
我现在培养的条件是20%的胎牛血清,是否应该恢复到10%?
我新配置的培养基,颜色变得特别快,不到24小时就偏黄了,是否是因为我加的血清过多的原因?或者由于我配的时候缓冲碱不够?如果是后者我应该怎样补偿?
谢谢各位,帮帮忙!

作者: caihong 时间: 2012-9-27 11:45

用悬浮培养的细胞做MTT时，加入MTT继续培养4h后如何吸去上清再加入DMSO？

也可以不离心，用甩板的方法，即加入MTT继续培养4h后细胞绝大部分都沉下去了，你抓住96孔板迅速翻过来又翻回去，这样上面的液体去掉，但下面的细胞影响不大。你可以在做前用练习一下，掌握一下轻重。在学校时我们因为没有水平离心机大家都这样做，效果很好。

作者: birdfish 时间: 2012-9-27 11:46

主任和各位高手好，我第一次养细胞，请你们多指教，能指点一下豚鼠或大鼠BALF的操作及AM的培养具体过程！多谢！

作者: mickeylin 时间: 2012-9-27 11:47

大家好，我想请教一下血管平滑肌细胞的培养方法。我养的平滑肌细胞为什么总是喜欢收缩成团，仅仅是因为平滑肌细胞有收缩特性么？还是另有原因促使其收缩呢？

作者: 周伯通pp 时间: 2012-9-27 11:47

白血病L1210如果要冻存的话，它的冻存液怎样配置比较好？
DBA/c与BALB/C那种小鼠接种效果好？

作者: 周伯通pp 时间: 2012-9-27 11:48

白血病L1210如果要冻存的话，它的冻存液怎样配置比较好？
DBA/c与BALB/C那种小鼠接种效果好？

作者: 周伯通pp 时间: 2012-9-27 11:49

白血病L1210如果要冻存的话，它的冻存液怎样配置比较好？
DBA/c与BALB/C那种小鼠接种效果好？

作者: rxcc33 时间: 2012-9-27 11:49

请问，我最近在养干细胞，从别的实验室拿回来，更换培养基后第一天，细胞长得很好，可第二天，出现大片细胞死亡，没有细菌感染的表现，不知为什么？我用的培养基是DMEM/F12（1：1），PH值7.2，小牛血清10%，别的实验室使用的是10%胎牛血清，（而其他培养成分与我的相同），是否与此有关？谢谢！

作者: sunnyB 时间: 2012-9-27 11:50

请问，我最近在养干细胞，从别的实验室拿回来，更换培养基后第一天，细胞长得很好，可第二天，出现大片细胞死亡，没有细菌感染的表现，不知为什么？我用的培养基是DMEM/F12（1：1），PH值7.2，小牛血清10%，别的实验室使用的是10%胎牛血清，（而其他培养成分与我的相同），是否与此有关？谢谢！

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我的建议是最好和以前的培养条件一致，而且小牛血清和胎牛血清的确不同，即使胎牛血清，生产厂家不同，加工方式也不同，所以质量也不见得相同。

更何况有的细胞很娇贵，只有用胎牛血清才可以，小牛血清是不行的，试试吧。

作者: lgm 时间: 2012-9-27 11:52

请问：在加入血清后，培养基的PH值有没有变化？依各位的经验，在加血清之前，培养基的PH值一般应调到多少才好？

作者: 101010 时间: 2012-9-27 11:52

请问：在加入血清后，培养基的PH值有没有变化？依各位的经验，在加血清之前，培养基的PH值一般应调到多少才好？

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在加入血清后PH基本不会有太大变化。如果你想让PH值更加稳定的话，请用HEPES调至7.2左右，以后基本不会变化的。

作者: 101010 时间: 2012-9-27 11:53

有人给我提供一份细胞培养的基本步骤吗？谢谢！

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你有两个问题没说清楚，第一，你的细胞是什么细胞，贴壁？OR 悬浮？？第二，是原代培养还是传代培养？？？

所以我无法具体回答你的问题。不过，见下帖：：

作者: 101010 时间: 2012-9-27 11:53

有人给我提供一份细胞培养的基本步骤吗？谢谢！

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其实在DXY中有许多介绍细胞培养基本步骤的地方，你可以自己找找呀。要自己努力的。

作者: flyxx05 时间: 2012-9-27 11:54

在加入血清后PH基本不会有太大变化。如果你想让PH值更加稳定的话，请用HEPES调至7.2左右，以后基本不会变化的。

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我的DMEM培养基HEPES浓度为25mmol/l,NAHCO3加到1。8克，PH值调至7.22左右，-20度保存几天后，用于培养细胞，引起细胞很快死亡，测PH值发现已升到7。68左右，真不知道什么原因？

作者: wanglaoshi 时间: 2012-9-27 11:54

请问有人培养过兔股静脉内皮细胞吗？能否指点一二，不甚感激。

作者: 101010 时间: 2012-9-27 11:55

我的DMEM培养基HEPES浓度为25mmol/l,NAHCO3加到1。8克，PH值调至7.22左右，-20度保存几天后，用于培养细胞，引起细胞很快死亡，测PH值发现已升到7。68左右，真不知道什么原因？

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7。68，已经超出细胞的生存耐受值。“-20度保存几天后”这是没有问题的，放几个月都没问题。你查以下原因：
1。你的PH酸度计有没有问题？如果没有酸度计，可以肉眼观察PH值的，一般培养液在桔红色，再稍稍偏黄的时候为培养用PH，一般在7。0---7。4之间。

作者: 101010 时间: 2012-9-27 11:55

2。NAHCO3的量是差不多的，但是你用的HEPES量好象有些出入。因为我按照你的25mmol/l计算（HEPES分子量为238），你用了0.59g就调至7。22，这和我一般的经验有出入，我一般用至2-3g才能调至7。22，你可以将你的培养液配置过程详细说一下吗？或者你的培养基中加的什么？？等等。
3。你的小牛血清有没有问题？尤其在灭活时？？
4。你的培养箱的CO2浓度有没有问题？？

作者: 101010 时间: 2012-9-27 11:57

这是你在另一个讨论区写的帖子：
tigerzhong wrote:
谢谢dxb77 ，
我判断细胞死亡是根据细胞形态变小，透光度明显增加，原正常细胞全成为小而圆的小亮点，部分细胞飘浮。我的PH值调节在7。21左右，会不会是主要原因？毒素因子包括哪些？

首先，PH没问题。你所说的现象实际上是细胞营养不良的现象，所以我觉得就是血清的问题，可能你的细胞对血清要球高。而你更改了血清的要求，把胎牛血清换为小牛血清，你要知道这是营养的大幅度减低。所以你试试换回胎牛血清，而且用20%的浓度来挽救。我觉的最好重新复苏更好。

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:57

请教HEPES缓冲液的配方，谢谢！

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 11:57

我准备做原代的血管内皮细胞培养，用脐静脉做，但是我最担心的一个问题就是污染问题，我想请教各位高手，需要注意哪些来避免污染，谢谢请多指教。
而且听说内皮细胞长得很慢，传代几次后就更慢了，是不是这样，有什么方法可以让它长快点？
谢谢，请执教！

作者: toy 时间: 2012-9-27 11:58

〔摘　要〕流式细胞技术在细胞定量检测方面是最先进检测技术,流式细胞仪在临床和科研领域得到广泛运用。〔关键词〕流式细胞技术细胞检测　　概述:分析细胞学是细胞定量分析的学科,流式细胞技术(ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ,ＦＣＭ)是分析细胞中的一个重要领域,该技术为细胞学研究手段之一,能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个染色体的分析,而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式)测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较,具有速度快,精度高,准确性好的特点,可以说ＦＣＭ是目前最先进的细胞定量分析技术。该仪器在医学和基础生命科学中得到广泛应用。也就是说流式细胞术已应用于免疫学,生物学等临床医学和基础医学研究领域。下面做一简单介绍。细胞凋亡是当前研究的热点之一,检测凋亡有多种方法,ＦＣＭ的优点是1)能快速客观高灵敏度地进行多参数地测定样本细胞中的生物学变化。(2)定量测定凋亡指数,可同时测定凋亡细胞与细胞周围的关系。(3)同时测定细胞增殖率与死亡率,从而可了解肿瘤的增长速度。(4)测定单细胞为基础的凋亡相关基因蛋白的变化以探讨凋亡分子机制与细胞周期的关系。(5)从治疗过程中肿瘤细胞死亡速率可早期了解药物的疗效。随着ＦＣＭ凋亡检测方法的敏感性和特异性不断的提高,有望做到更客观地反映凋亡这一复杂的现象。血液学研究的主要内容是血液和骨髓,而这两者均为天然的单细胞悬液,并且易于反复采集,这正符合ＦＣＭ的标本要求。细胞流式术在这里起的作用是1)对细胞内部参量的检测,利用细胞对光的散射,可获得有关细胞大小(与前向角散射有关)和粒度的信息(与侧向角散射有关)。(2)细胞外部参量的检测。待测细胞经荧光染成标记后,主要检测:ＤＮＡ含量,ＲＮＡ含量,总蛋白含量,细胞原构成,酶活性及定位小细胞钙离子,细胞内ｐＨ细胞膜定位,细胞膜流动性或微粘度等。(3)细胞分选内部参量或外部参量的不同。ＦＣＭ可将某一特定亚群从细胞总体分选出来,以待做进一步的研究,这一功能在克隆方面有重要的意义。细胞抗原表型分析,这是ＦＣＭ在血液病学中应用最广泛的领域。流式细胞术在该领域里显示出其快速大量检测细胞和多色标记的优点,使免疫表型分析更加快速、客观、准确。用ＦＣＭ技术分析和分选标本染色体是分子生物学,遗传学研究的一个非常有效的方法。采用双激光的方法,研究者可进行核型分析和鉴定,分离纯化某号染色体并构建染色体特异性ＤＮＡ文库。后者在遗传病基因定位、基因克隆方面发挥重要作用。其实流式细胞术在生物学中的发展,主要得益于克隆抗体技术的发展,这两者的发展是相辅相成的。流式细胞仪主要部件及其作用:光源:光源有相干光源和非相干光源。非相干光源一般来自灯和汞灯。此类弧光灯的发光是电流经过气体时,造成气体电离所产生的。它能提供最佳的激发波长。选择汞灯和灯的原则是能提供最大的荧光激光能量。但弧光灯在单一谱线上能量较弱且功率不稳,己逐步被激光光源代替。相干光源常用Ａｒ+激光,Ｈｅ—Ｎｅ及染料激光,其中氩离子激光器在紫外范围也可激发染料,适合ＤＮＡ分析和使用特殊荧光染料情况。因此成为流式细胞仪中使用最广泛的激光源。它在488ｎｍ时呈兰色激光。此光源能提供极高的照射光强,稳定性高,发射散角小,能聚焦到细胞大小的线度范围内。常用的还有Ｈｅ—Ｎｅ激光器(633ｎｍ),用于光散色的测量。由于染料激光器的波长能连续调6ＭｅｄｉｃａｌＥｑｕｉｐｍｅｎｔＶｏｌ 13,Ｎｏ 5

作者: c86v 时间: 2012-9-27 11:58

单克隆抗体标记步骤

MONOCLONAL ANTIBODY STAINING PROCEDURE
I. SAMPLE – one or more of the following preparations
A. Suspension of single cells from tissue (e.g., lymph node, spleen, bone marrow, placental cells)
B. Tissue culture cells
C. Ficoll – hypaque separated mononuclear cells
II. REAGENTS
A. Antibodies
1. Primary antibodies: usually purchased or your own monoclonals
a. if these are conjugated with a fluorochrome (e.g., FITC or PE) use the DIRECT STAINING PROCEDURE
b. if the primary antibody is not conjugated to a fluorochrome, use the INDIRECT STAINING PROCEDURE
2. Secondary antibodies: fluoresceinated polyclonal antibodies
B. BUFFER: Phosphate-buffered saline (PBS Ca 2+ and Mg2+ free) + 2 % newborn calf serum (or 0.2% BSA) + 0.1% sodium azide.
C. Formaldehyde preservative: 2% solution in protein-free PBS
D. PBS: protein and azide free
Buffer and formaldehyde solution can be provided by the FLOW CYTOMETRY CORE LAB if they are not routinely used by the investigator.
III. TUBES
A. Use appropriate 12 x 75 mm polystyrene/polypropylene tubes. Please note that Falcon snap-cap tubes are the only ones that fit on the Becton Dickinson flow cytometer for certain. If you want to stain in another tube type, please transfer the cells finally to those specified here.
B. Mark all tubes with easily readable numbers which correspond to your protocol sheet (see below).
C. Use 1% formaldehyde solution for re-suspension of all potentially biohazardous specimens and cap them.
IV. PROTOCOL
A. Obtain protocol sheets from the FLOW CYTOMETRY CORE LAB (sample attached – please Xerox)
B. Fill out a sheet each time you do an experiment. Include all of the information requested.
SINGLE COLOR PROTOCOL SHEET (Excel required)
DUAL COLOR PROTOCOL SHEET (Excel required)
DIRECT STAINING PROCEDURE
1. Prepare your cells as a suspension of single cells in a manner appropriate for the specimen you wish to examine. Make sure the cells are viable. As the final step, wash at least once with 1 ml of cold BUFFER. Resuspend the cells at 107 cells/ml (thus 50 microliters = 5 x 105 cells) in cold BUFFER.
2. Meanwhile add 50 microliters of BUFFER and then the appropriate amount of monoclonal antibody to the bottom of tubes. Note: For multi-color staining, add all your fluorochrome-conjugated antibodies at the same time.

作者: c86v 时间: 2012-9-27 11:59

3. Add 50 microliters of the cell suspension to the bottom of the tubes.
4. Vortex briefly and incubate 30 minutes at 4° C in the dark.
5. Wash twice with 1 ml of buffer; centrifuge at 250g for 5 minutes.
6. Resuspend samples in 1 ml of buffer and hold at 4°C in the refrigerator (or on ice) prior to analysis.
INDIRECT STAINING PROCEDURE
1-5. Process cell samples as above using a working dilution of unlabelled monoclonal antibody.
6. Resuspend cell pellet in 100 microliters of working dilution of the fluoresceinated second antibody.
7. Vortex briefly and incubate for 20 minutes in the refrigerator.
8. Wash twice with ~ 1 ml of buffer; centrifuge at 250g for 5 minutes.
9. Resuspend samples in 1 ml of buffer and hold at 4°C in refrigerator (or on ice) protected from light prior to analysis.
NOTE: If your samples are Ficoll-Hypaque separated whole blood cells you might still have residual red blood cells in your preparation. These red cells interfere with flow cytometric analysis of lymphocytes and have to be removed by NH4Cl lysis. See attached recipe and procedure.
PRESERVING PROCEDURE
If cells are not going to be read on the flow cytometer the same day, or they are considered potentially biohazardous, do not re-suspend them after the staining procedure. Stop at Step 5 of DIRECT STAINING or at Step 8 of INDIRECT STAINING, and continue as below.
1. Add to the pellet 0.5 ml of cold protein-free PBS, and vortex; then add 0.5 ml of cold formaldehyde solution (see attached recipes).
2. Vortex again and incubate in the refrigerator. Make sure to keep cells in the dark as exposure to light may cause loss of fluorescence.

AMMONIUM CHLORIDE LYSING SOLUTION – 10X
Reagents  Amount:
Ammonium Chloride, ACS 82.9 g
Potassium Bicarbonate, USP  10.0 g
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) disodium salt  0.37 g
Water, glass distilled  qsad 1.0 liter
Adjust pH to 7.2 and keep in tightly closed container at 4°C. To prepare a 1X working solution (to be used at room temperature), dilute 10X 1:10 with glass distilled water. Keep tightly closed and discard at the end of the day.

LYSING PROCEDURE FOR LYSIS OF RESIDUAL RED BLOOD CELLS
IN FICOLL-HYPAQUE SEPARATED MONONUCLEAR CELLS
1. After the staining procedure, take off as much of the washing buffer as possible without disturbing the pellet.
2. Vortex briefly and add 1 ml of room temperature 1X NH4Cl lysing solution to your cells, vortex again and expose your cells to it for 2-3 minutes at room temperature. Note: do not exceed this time.
3. Centrifuge for 5 minutes at 200g. Remove the lysing buffer completely and resuspend in BUFFER or 1% formaldehyde solution for analysis.

PREPARATION OF 2% FORMALDEHYDE STOCK SOLUTION (2 METHODS)
METHOD 1:
Formaldehyde preservative – 2% formaldehyde solution in protein-free phosphate-buffered saline (PBS).
Prepare as follows:
Add 2 g paraformaldehyde powder (e.g., Sigma, St. Louis, MO) to 100 ml of 1 X PBS. Heat to 70°C (do not exceed this temperature) in a fume hood until the paraformaldehyde goes into solution (note that this happens quickly as soon as the suspension reaches 70°C). Allow the solution to cool to room temperature. Adjust to pH 7.4 using 0.1 M NaOH or 0.1 M HCl, if needed. Filter and store at 4°C protected from light.

METHOD 2:
Formaldehyde preservative – 2% formaldehyde solution in protein-free PBS.
Prepare as follows:
10% formaldehyde*  20 ml
10 x PBS  10 ml
Distilled water  70 ml
* 10% formaldehyde solution (e.g., Polysciences, Warrington, PA, Ultrapure, Cat.#04018), depolymerized paraformaldehyde, EM grade, methanol-free solution.

作者: u234 时间: 2012-9-27 12:00

有个问题想请教版主和各位高手
我培养的是原代的兔RPE细胞，然后做了凋亡相关基因bcl-2的免疫组化检测，在这个过程中用到DAB显色，但是DAB的颜色和RPE细胞内的色素颗粒的颜色有些相似，两者能否混淆，用什么办法可以区分开。我听说使用传代后的RPE细胞由于色素颗粒较少，可以避免染色过程中燃料与色素颗粒的混淆，是不是必须用传代后的细胞。我的时间很紧，还有细胞培养时间太长以后生长状态就不是很好，所以测定指标时想用原代的细胞。请您帮助解答一下。
十分感谢。
还有就是用过一次的多聚赖氨酸能否收集起来再次使用，有人说用过的多聚赖氨酸有效成分已经沉积下去，不能再用了。多聚赖氨酸应该孵育多长时间，是几个小时还是过夜？
谢谢。我的邮箱hcmonkey@tom.com

作者: BUK 时间: 2012-9-27 12:00

本人正在做MC53细胞的培养，请教大家用何种物质刺激它增殖比较合适？脂多糖内毒素？TNF-a?con-A?最佳浓度？需不需要预实验？他的增殖检测用什么方法好？H-Tdr 掺入？MTT？还是MTS？还有什么其它指标可以检测？恳求各位赐教：myovid@hotmail.com

作者: 园丁## 时间: 2012-9-27 12:00

因没有所需的 B precursor ALL 细胞株，故考虑自己建系培养，请教该白血病细胞建株培养的具体的protocol，不胜感激！

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-27 12:01

各位大虾：
我养的是人胚肺成纤维细胞，现在培养过程中出现了很多黑点，很象是污染，但培基并没有变浑浊，培基颜色也变化过慢，细胞形态不好，生长缓慢，请教各位出现此种情况的可能原因是什么，该如何补救？谢谢

作者: toy 时间: 2012-9-27 12:01

你说的象是支原体污染，具体原因和补救办法，你看看支原体污染的讨论专区吧，对你应该有效。

作者: bs4665 时间: 2012-9-27 12:02

请教做MTT的朋友们，我加MTT后也用SDS-DMF裂解细胞，加入SDS-DMF后，用枪头吹打均匀，所产生的气泡再用针头扎破，很是麻烦。请问你们是怎么做的，有必要吹打吗？加入SDS-DMF后放培养箱内孵育1小时直接去测OD行吗？

作者: 911 时间: 2012-9-27 12:02

本人觉得293细胞好养呀，只要注意培养条件，不要污染（可能是本人初次涉及细胞培养，经验少少，也不知难易，只是拿293来练兵了），还是很容易培养的。本人现在养原代肝细胞，才叫难养呀（少量还可以，但大量养就不理想，郁闷ing)。呜呜呜。。。。特别是原代冻存解冻后培养，贴壁率很低噢。革命尚未成功，同志仍需努力。

作者: S6044 时间: 2012-9-27 12:03

啊，我要养3t3l1细胞，这些日子邪了们的污染，而且没有污染的也是圆圆的，但是贴壁，啥原因啊？？？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-27 12:03

有关细胞冻存方法，说法不一。《现代分子生物学实验技术》上说4度4-5小时或过夜，移至-20度冰箱2小时，再悬于液氮罐颈口1小时，最后浸入液氮。而我们版块上说冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。
** 註：-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞死亡。亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍盒內，直接放入-80℃冰箱，但存活率會降低。
请问各位大虾是如何操作的？

作者: loli 时间: 2012-9-27 12:04

你说的象是支原体污染，具体原因和补救办法，你看看支原体污染的讨论专区吧，对你应该有效。

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在培养过程中出现了很多黑点，很象是污染，但培基并没有变浑浊，培基颜色也变化过慢，细胞形态不好，生长缓慢，会不会是所谓的“黑胶虫”，我没有见过，只听说过，你知道这种东西吗？

作者: wood533 时间: 2012-9-27 12:04

培养的是大鼠NRK肾细胞，有能提供我一些详细的培养方法及注意事项吗，拜托了

作者: 2541 时间: 2012-9-27 12:05

1、在发酵罐中进行微载体培养时，接种量应以多少为好？
2、在发酵过程中主要监测哪几个指标？
3、细胞长到什么浓度开始感染；感染时病毒的量是多少？
4、感染后一般培养多久为好；如何检测病毒复制与否？

作者: loli 时间: 2012-9-27 12:07

在培养过程中出现了很多黑点，很象是污染，但培基并没有变浑浊，培基颜色也变化过慢，细胞形态不好，生长缓慢，会不会是所谓的“黑胶虫”，我没有见过，只听说过，你知道这种东西吗？

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你所说的问题在支原体污染这个专区都有答案的。你看看吧。

作者: loli 时间: 2012-9-27 12:08

请问 MTT具体操作是怎样的？请指教。

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1. 将一定密度的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内,然后加入药液10μl/孔,每种药5个浓度(每个浓度相差10倍),一个浓度设4个复孔。每块板设一个空白调零孔,内加培养液，不含细胞与药物。每种细胞设6个正常对照孔,加样100μl/孔，不含药物。接种完毕后在37℃， 5%CO2条件下孵育培养48小时。
2.加MTT：
加MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔,混匀后37℃，5%CO2 条件下孵育4小时。
3.加三联液：（三联溶解液：SDS 10g，异丁醇 5ml ， 10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液）
加溶解三联液100μl/孔，混匀后37℃放置过夜以溶解甲臢。
4．吸光度（A）测定：
用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，校正波长为630nm。
5.计算：肿瘤抑制率=（对照组A值－治疗组A值）／对照组A值×100%， IC50值用Logit法计算。
这是我从丁香园里面下载的，具体是哪位战友记不清了，反正挺好用的，供你参考

作者: loli 时间: 2012-9-27 12:09

请教HEPES缓冲液的配方，谢谢！

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HEPES（1mol/L）
HEPES 23.83g
三蒸水至100ml

作者: loli 时间: 2012-9-27 12:09

读临床专业硕士,毕业课题只做细胞培养,能符合毕业论文要求不?

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当然可以，我们学校很多临床专业的都是在做细胞培养啊，没有听说谁毕业不了的，细胞培养也是一门很有学问的技术啊

作者: 小荷尖尖 时间: 2012-9-27 12:09

哪位高手可以告诉我羊输卵管上皮细胞的传代培养一些技巧和注意事项,谢谢!!

作者: mysmdbl 时间: 2012-9-27 12:10

我在原代培养血管平滑肌细胞，失败了5次，哪位细胞培养高人能指点迷津？thank you!
也请那些与我培养同一种细胞的朋友，共同商讨，共度难关

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:12

细胞培养的一般过程

一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。
培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
四、冻存及复苏
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:12

培养细胞的细胞生物学

一、体内、外细胞的差异和分化
1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。
2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
二、体外培养细胞的分型
（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：
1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型；见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。
三、培养细胞的生长和增殖过程
体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。
（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）
所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。对此以后将详述。
正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：
1．原代培养（Primary Culture）期：
也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:13

2．传代期：
初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。
3．衰退期：
此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系（Established Cell Line），现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。
（二）组织培养细胞一代生存期
所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。
所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：
1．潜伏期（Latent Phase）：
细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。
细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。
2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）：
这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:13

3．停滞期（Stagnate Phase）：
细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。

建立细胞系或细胞株

各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。
一、体外培养细胞的种类和命名
体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。
（一）初代培养
初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。
（二）细胞系
初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。
由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。
（三）克隆细胞株
从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）
（四）二倍体细胞
细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。
（五）遗传缺陷细胞
从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。
（六）肿瘤细胞系或株
这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。
对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今别举以下几种代表性的细胞名称供参考：

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:14

HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）
CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）
宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立
NIH3T3：美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。
二、建立细胞系（或株）的要求
关于什么样的体外培养细胞群，可被确认为是已被鉴定的细胞（Certified Cells），国际上也尚无统一的规定，一般依具体情况而定。在只用作初代培养细胞，只要供体性别、年龄等均一，取材部位及组织种类等条件稳定，做鉴定的项目无需很多，有几项能说明细胞的相关性状的即可。如能长期保存并可供其它研究室使用，特别是做反复传代的细胞，习惯上有以下一些要求，并在刊物上报道时应加以说明。
（－）组织来源
应说明细胞供体所属物种，来自人体，动物或其它；供体的年龄、性别、取材的器官或组织；如系肿瘤组织，应说明临床病理诊断，组织来源，以及病例号等。
（二）细胞生物学检测
应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物包括分泌蛋白或激素等；如为肿瘤细胞，应力求证明细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对正常组织浸润力等实验。
（三）培养条件和方法
各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜pH等。
三、已建立细胞系或株的鉴定、管理和使用
近些年，当一个细胞系或细胞林建成后，我国常通过组织专家开鉴定会的形式予以鉴定，从学术角度考虑，此举实非必要。按国际惯例，只要研究认真负责地把有关资料在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。
以前因未建立统一的细胞库时，对已建立的细胞系（株）多由作者单位自行保管，有浪费人力、交流使用不便、细胞易污染和丢失等弊病。我国已初建成小规模贮存细胞机构，待获进一步发展，这对我国细胞培养必将有更大促进作用。
国际上美、英和日本等国已建有细胞库；美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC下属有一组协作实验室和一个由众多专家组成的咨询委员会。ATCC也是美国国立癌症研究所（NCI）和美国卫生研究所中（NIH）的资源库，尤与NCI有密切的关系。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系（1992），其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系；和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费。） ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库标准， ATCC入库细胞要求检测项目如下：
培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等
冻存液：培养基和防冻液名称
细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性
培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量
细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性
核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无
无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等
物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测
免疫检测：一两种血清学检测
细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名
以上为ATCC入库基本要求，杂交瘤入库标准尚有所不同，详细情况请参阅ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”。

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:15

细胞原代培养

一、原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
二、仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步骤
（一）胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
四、注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
五、无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。

附：Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:16

细胞传代培养

一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1、细胞：贴壁细胞株
2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）
3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等
三、操作步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附：消化液配制方法：
称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。

作者: xue258 时间: 2012-9-27 12:16

各位哥们姐们，我原是作细菌发酵的，最近开始做细胞发酵，本是与一同事一起做，希望跟他学学，谁知小子特保守，根本不给我说任何有关的知识。所以只好到此请教各位哥们姐们啦。我主要有以下几个问题：
1、5L发酵罐以多少接种量为好？
2、在发酵过程中主要检测哪几个指标？
3、细胞张到多大密度时感染病毒？
4、感染病毒后还需养多久？
（我做的是293细胞生产腺病毒）
麻烦各位，不胜感激，拜托拜托！

作者: 大尾巴 时间: 2012-9-27 12:16

我在原代培养血管平滑肌细胞，失败了5次，哪位细胞培养高人能指点迷津？thank you!
也请那些与我培养同一种细胞的朋友，共同商讨，共度难关

作者: ALALA 时间: 2012-9-27 12:17

有哪位朋友培养过大鼠NRK细胞，提供我一点关于该细胞培养方面的建议，我一直不能传代，传代细胞就死亡，而原培养细胞没事，啥原因呢，急求

作者: 9900 时间: 2012-9-27 12:18

用大鼠主动脉平滑肌吗？首先大鼠的选择要合适的年龄体重范围内的，平滑肌细胞长得较慢，在爬出来之前，不要过早的移动培养瓶，可以用胰酶消化法，查一下司徒振强的细胞培养。刚开始比较难养，坚持几次就有经验了。

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 12:18

大家好，不知道有哪位做过脐静脉血管内皮的元代培养，我在实验中遇到以下难点，希望各位能给点意见。
1、pBS冲洗脐带后，加入胶原酶消化，但是胶原酶好像总是溢出，不能通到底部，是不是因为胶原酶太粘稠比较堵而下不去，不知道那位可以提点意见来避免这种情况，是胶原酶可以贯穿整个脐带？
2、加胶原酶一般消化多久适宜？
3、冲洗细胞的过程老是不顺利，冲不下来多少细胞。怎样更好？
4、可否用胰酶代替胶原酶（胰酶不稠），消化时间怎么把握？
5、细胞接种后，多长时间换液，根据我的观察好像细胞贴壁的时间不太确定，我是接种后第三天换液这样可以除去很多红细胞，但是觉得内皮细胞贴附不牢，特别是用胰酶消化的细胞，贴壁的很少，所以想问一点，换液时间为多久，内皮细胞接种后多久贴壁，换液时应注意哪些问题可以保证细胞数量够多。
6、我做了两次接种了5瓶细胞，但是3天后观察贴壁的内皮很少，而且不知道元代培养这种细胞多久贴壁，有些资料说一个星期才贴壁的有，有的说6小时贴壁的也有。那位经验丰富者可以给点意见，根据贴壁时间多久换液
7、那位可以提供自己脐带培养的丰富经验，基本过程我也知道，但是我想知道具体的操作规范，即是实验中的关键问题，希望能给宝贵意见。
8、元代培养的内皮可以传代几次，听说一般传3-4代就长分裂很慢了，做实验的细胞要求数量多，怎样提高分裂数量，一般好像加点生长因子可以长快点，但是有些实验就是要用生长因子用药，观察一些指标的变化，这时候不能加生长因子，该怎么办？
关键问题：细胞贴壁太少，细胞分裂太慢？能提供时间参考吗？

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 12:19

我准备做原代的血管内皮细胞培养，用脐静脉做，但是我最担心的一个问题就是污染问题，我想请教各位高手，需要注意哪些来避免污染，谢谢请多指教。
而且听说内皮细胞长得很慢，传代几次后就更慢了，是不是这样，有什么方法可以让它长快点？
谢谢，请执教！

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我曾经做过脐静脉内皮细胞的原代培养。除了书上说的注意无菌操作之外，还要注意一下几点：
1、消化的时间不能太长，否则会混入其他细胞，造成细胞污染。我用的是0.1%胰蛋白酶消化，根据取材的时间2～6H内8～10min.
2、要充分冲洗脐静脉管腔，防止残留过多的红细胞，影响细胞贴壁。曾经有一次培养时，视野里全是红细胞，不过第二天换夜时，瓶底竟有不少贴壁细胞，看来影响也不是很大。
3、配制的培养基，使用的血清都要防止污染。使用血清最好用进口血清，国产血清效果不理想，特别是不加其他生长因子的情况下。
原代培养的细胞，不加生长因子，能够传2～3代就已经不错了。加生长因子会长的好一些，不过一般都很贵。
一家之言，仅做参考

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 12:19

大家好，不知道有哪位做过脐静脉血管内皮的元代培养，我在实验中遇到以下难点，希望各位能给点意见。
1、pBS冲洗脐带后，加入胶原酶消化，但是胶原酶好像总是溢出，不能通到底部，是不是因为胶原酶太粘稠比较堵而下不去，不知道那位可以提点意见来避免这种情况，是胶原酶可以贯穿整个脐带？
2、加胶原酶一般消化多久适宜？
3、冲洗细胞的过程老是不顺利，冲不下来多少细胞。怎样更好？
4、可否用胰酶代替胶原酶（胰酶不稠），消化时间怎么把握？
5、细胞接种后，多长时间换液，根据我的观察好像细胞贴壁的时间不太确定，我是接种后第三天换液这样可以除去很多红细胞，但是觉得内皮细胞贴附不牢，特别是用胰酶消化的细胞，贴壁的很少，所以想问一点，换液时间为多久，内皮细胞接种后多久贴壁，换液时应注意哪些问题可以保证细胞数量够多。
6、我做了两次接种了5瓶细胞，但是3天后观察贴壁的内皮很少，而且不知道元代培养这种细胞多久贴壁，有些资料说一个星期才贴壁的有，有的说6小时贴壁的也有。那位经验丰富者可以给点意见，根据贴壁时间多久换液
7、那位可以提供自己脐带培养的丰富经验，基本过程我也知道，但是我想知道具体的操作规范，即是实验中的关键问题，希望能给宝贵意见。
8、元代培养的内皮可以传代几次，听说一般传3-4代就长分裂很慢了，做实验的细胞要求数量多，怎样提高分裂数量，一般好像加点生长因子可以长快点，但是有些实验就是要用生长因子用药，观察一些指标的变化，这时候不能加生长因子，该怎么办？
关键问题：细胞贴壁太少，细胞分裂太慢？能提供时间参考吗？

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我现在也正在培养脐静脉内皮细胞，有些经验可以分享：
一、我没有用过胶原酶消化，只是用0.1％胰酶消化10min左右（需要根据取材的时间来确定具体的消化时间，不能太长，否则会混入其他细胞；不能太短，否则细胞数量不能保证）
二、不知道你是怎么将胰酶注入管腔的。我的方法：
1、取出脐带，无菌条件下操作，将带有一次性导管的针头（医院里的一次性输液器针头端的导管部分＋针头：使用20ml注射器上的针头）插入脐静脉（最粗）内，并用血管钳夹紧
2、用20ml 注射器抽取PBS（37℃），反复冲洗脐静脉管腔，直至流出透亮液体为止（期间用手经常搓洗）；用血管钳夹紧另一端。
3、抽取约15ml 0.1%胰酶，注入管腔，37℃--CO2孵育箱10min左右。
4、取出后，用注射器收集管腔内消化液，然后用PBS冲2～3次。一并收入预先添加进口胎牛血清的60ml 离心管内。
5、用吸管吸取消化液均匀分装小离心管（注意不要装满），离心1000rpm 7～10min
6、吸管吸取上清液后，换吸管，加入少量培养基（少加，以增加细胞密度），分别吹打以形成细胞悬液（注意动作轻柔），根据量多少转入培养瓶内。加入20％胎牛血清，置于37℃ CO2孵育箱内培养。
7、24h 后换液（注意换液不能过早，过早则细胞容易丢失，因此时细胞贴壁不紧）
三、一般来说，4h 后就开始贴壁，不过此时不紧，还没有粘附。24h 时再进行换液，不能太晚，否则由于红细胞存在，以及养分的消耗，会影响细胞的生长。
四、原代培养时，我一般在培养瓶中事先涂布一层鼠尾胶原，以利于细胞贴壁，效果不错。

作者: H2O 时间: 2012-9-27 12:20

请问各位大侠谁有Raji和U937的培养经验？

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　　你在养Raji和U937，你是学血液的吧？这两种细胞非常脆弱，也比较难养。你可以把血清含量提高到20%试试。另外，如果细胞活率不高的话，你可以先以600rpm，10min离心富集后，弃上清，轻轻将细胞在1毫升完全培养基中吹散，再于另外一个离心管中加入3-4ml血清　，将已吹散的1毫升细胞悬液轻轻地平铺于血清上，以300rpm，4min离心富集，于5毫升完全培养基中培养。

试试看

作者: 101010 时间: 2012-9-27 12:20

我的科研课题是《E14小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为甲状腺细胞》，请问如何才能找到有关甲状腺滤泡上皮细胞分化的诱导因子？

作者: 101010 时间: 2012-9-27 12:21

不同细胞的具体培养过程并非完全一样，我建议你看看薛庆善编写的《体外培养的技术与原理》。

作者: H2O 时间: 2012-9-27 12:22

非常感激你，谢谢您，还有个问题鼠尾胶原是什么呢？怎么买呢

作者: 剪刀手520 时间: 2012-9-27 12:22

紧急求助：
课题需要一篇原文，有哪位同道帮帮忙？
Oda D,Savard CE, Eng L, et al. Reconstituted human oral and esophageal mucosa in culture.[J] In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1998,34(1):46-52
万分感谢！
请发到我的邮箱：hx1990@163.com

作者: ALALA 时间: 2012-9-27 12:22

谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃贮存2周时，就应重新加入原有量的谷氨酰胺。

作者: ALALA 时间: 2012-9-27 12:23

鼠尾胶原一般是Ⅰ型或Ⅱ型胶原

作者: IAM007 时间: 2012-9-27 12:24

各位高手、专家，有谁知道——如何取大鼠滑膜细胞，
大鼠膝关节滑膜细胞的照片可以给我一张吗？
我已经试取多次，可不知道滑膜细胞是什么样子。它在那里。
照片可寄到zhh-happyhome@sohu.com
谢谢，我很急，希望高手指点。

作者: IAM007 时间: 2012-9-27 12:24

上海有谁做过大鼠滑膜细胞培养。帮帮我，
我已经做过几次的不知大鼠滑膜是什么样子，我照着文献上做总是作不好，
谁能帮帮我

作者: c86v 时间: 2012-9-27 12:25

不同细胞的具体培养过程并非完全一样，我建议你看看薛庆善编写的《体外培养的技术与原理》。

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鼠尾胶原可以自己配制
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=400098&sty=1')

作者: c86v 时间: 2012-9-27 12:25

常感激你，谢谢您，还有个问题鼠尾胶原是什么呢？怎么买呢

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鼠尾胶原可以自己配制：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=400098&sty=1')

作者: wsll 时间: 2012-9-27 12:26

哪位老师手上有小鼠血管内皮细胞?急需!谢谢!

作者: 33号 时间: 2012-9-27 12:26

我准备用Dispase酶消化来进行粘膜上皮细胞的培养，查阅中文文献后见都未有细胞纯度的说明，因为我的实验后续研究需要有较高的细胞纯度。Dispase酶消化后是否能达到100％的纯度？如果不能，上流式检测细胞纯度（类似磁珠分选后的纯度检测）有无意义？
万分感谢！

作者: 分子式 时间: 2012-9-27 12:27

请教血管内皮细胞鉴定的方法?

作者: gogo 时间: 2012-9-27 12:27

我在做心肌细胞的培养,想问一下消化时用什么比较好?需不需要加EDTA，胰酶用多大浓度的比较好？好像心肌细胞很不容易吹打成单细胞。

作者: tie8 时间: 2012-9-27 12:28

请问高手：
有没有什么方法将活力好的细胞与活力差的分开，或者将年轻的细胞与老的细胞分开。（是不是传代时早下来的细胞是年轻的？？）

作者: wanglaoshi 时间: 2012-9-27 12:28

我培养牛胸主动脉平滑肌细胞时发现，消化液中存在着大量的胶原纤维，严重影响平滑肌细胞贴壁。我是这样消化组织的：
1 剪碎组织
2 加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA，37度，搅拌消化20min。
3 静置取上清，加DMEM培养液，离心（2000r×10min）
4 弃上清，加入DMEM培养液，吹打，移入培养瓶。

请教高手指点！

作者: loli 时间: 2012-9-27 12:29

有关细胞冻存方法，说法不一。《现代分子生物学实验技术》上说4度4-5小时或过夜，移至-20度冰箱2小时，再悬于液氮罐颈口1小时，最后浸入液氮。而我们版块上说冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。
** 註：-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞死亡。亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍盒內，直接放入-80℃冰箱，但存活率會降低。
请问各位大虾是如何操作的？

请问各位大虾是如何操作的？

我觉得细胞冻存，最关键的是要选用对数生长期的细胞，也就是第一天传代，第二天冻存。我冻存细胞一般是先在-20℃放置到冻存液刚不能流动,5分钟左右,然后放在-80℃过夜(16小时以上),最后移入液氮罐就可.这样每次第一天复苏的细胞,第二天就可长满,能传代.

作者: tie8 时间: 2012-9-27 12:29

细胞培养基本技术
• 组织块法原代培养技术 • 消化法原代培养技术
• 细胞传代培养技术 • 细胞冻存与复苏技术
细胞培养器材
无菌技术
• 培养室消毒: 桌面、地面、空气 • 超净工作台：70%酒精
• 培养器皿: 玻璃培养瓶、器械—高压灭菌、塑料培养板—紫外线或射线
• 实验人员: 口罩, 衣, 帽, 手 • 无菌操作: 物品摆放有序, 注意消毒瓶口
取材要求
• 1. 无菌取材, 取材准确，及时培养。
• 2. 应去除血污、脂肪及坏死组织。
• 3. 疑有污染, 应将组织在含二性霉素2μg/ml、青霉素500U/ml、链霉素500U/ml的培养液中浸泡10～20min, 然后洗净再培养。
• 4. 用锋利器械剪切组织, 减少组织损伤。
• 5. 体腔液细胞: 可直接离心收集. 血细胞: 肝素抗凝(20U/ml), 自然沉降法或Ficoll法分离细胞。
• 7. 及时记录来源, 必要时制备组织学标本。
细胞或组织培养方法
• 血液组织: 悬浮培养法
• 实体组织:
单层培养 : 培养瓶, 培养板, 转瓶等
三维培养: 琼脂培养, 中空纤维培养等
• 器官培养: 琼脂法, 金属网法, 微扩散室法
悬浮细胞培养方法
• 用平底培养瓶或转瓶培养细胞：接种密度为5×104～8×105/ml
• pH７.2～7.4, 37℃, 5%CO2, 饱和湿度条件下培养
• 传代时, 摇晃培养瓶, 轻轻吹打细胞团, 吸取适量细胞悬液, 加入含新鲜培养液的培养瓶中继续培养
• 必要时，800rpm, 离心5min, 弃上清液，用新鲜培养液重新悬浮，培养
器官培养
• 概念：将整个器官、器官的一部分或者器官原基放在体外环境中让其生存和生长的过程。
• 目的：观察和研究器官的发育过程、功能表现及其影响因素。
• 原则：1）提供充足的营养和O2，及时排除代谢产物；2）抑制细胞从组织块向外迁移。
器官培养要求与条件

作者: tie8 时间: 2012-9-27 12:29

器官块体积 1～2 mm3
• 培养基：合成培养基，常用199培养基
• 添加成分：根据器官种类、生长特性选择，如胎牛血清、马血清、鸡胚浸提液、激素、生长因子等
• 气相条件：成体器官95％O2，5％CO2；
胚胎器官或肿瘤组织（糖酵解能力强）50％ O2，45％N2和5％CO2
实体组织培养
• 原代培养：组织块培养法
　　　　　　消化分散培养法
• 传代培养：消化法分散细胞
• 扩大培养：培养瓶培养转瓶培养中空纤维培养
小鼠横纹肌细胞原代培养---组织块法
1. 脱颈处死小鼠, 浸入70%酒精缸中1min, 取出沥干；
2. 用皮肤剪剪开臀部皮肤,暴露大腿肌肉，剪取一块黄豆大小的肌肉组织；
3. 放在培养皿中,用无血清培养液洗净血迹,滴少许培养液,用眼科弯剪剪成1mm3 的组织块；
4. 用眼科镊将组织块接种于培养瓶的底部, 并用齿科探针均匀拨开(间距0.5cm),每瓶放置20～30块。
5. 将培养瓶底部向上补加4mlRPIM1640培养液(含10%胎牛血清), 盖好瓶盖并松半圈，放入CO2 孵箱。
6. 37℃、5%CO2孵育1～2h后, 轻轻反转培养瓶．
7. 培养3～5天, 镜下可见细胞晕出现。
注意事项
1. 培养前2天注意观察有无污染, 避免晃动培养瓶。
2. 培养3～5天, 更换半量或全部培养液。
3. 组织块不易贴壁时,可在瓶底预先涂薄层基质，如胶原、多聚赖氨酸、纤维粘连蛋白、层粘
连蛋白等。
分散细胞的方法
• 机械解离细胞法：剪切、吹打、滤网研磨等
• 酶学解离细胞法：胰蛋白酶、胶原酶、崩裂酶
• 螯合剂解离细胞法：乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na ），柠檬酸钠，枸橼酸钠等常用的消化液
• 胰蛋白酶Trypsin (1:250)
用无Ca2+,Mg2+ Hanks液配制，
浓度：0.1-0.5%,　常用0.25%
用法: 37℃，5～45min；4℃，4～18h
　注意:Ca2+,Mg2+,血清抑制酶活性
• 混合消化液：
0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA
常用于消化上皮样组织.
注意：消化后需离心洗涤细胞，除去EDTA。
• 胶原酶Collagenase
种类：I-IV型或混合型，结缔组织I，III型；骨组织I型；软骨组织II型；胰岛细胞IV型。
浓度：0.1-0.3%, 用法：37℃，1-24h

作者: tie8 时间: 2012-9-27 12:30

• 崩裂酶Dispase
浓度：0.25%, 用法：37℃，1h；4℃，14h
作用：增强胶原酶的消化能力，对细胞损伤最小，多用于表皮细胞。
小鼠肝细胞原代培养－消化法
1. 脱颈处死小鼠, 浸入75%酒精中1min, 沥干。
2. 剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打开腹腔,取出肝脏。
3. 修剪除去肝门区血管结缔组织,剪取一块蚕豆大小的肝组织。
4. 把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无血清培养液淋洗2～3次。
5. 将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消化液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇匀。
6. 消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离心管。
7.离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 用RPIM1640培养液(含10%胎牛血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.将细胞接种于培养瓶中, 密度为106/ml　(2×105/cm2),　37℃、5%CO2培养。
注意事项
• 根据组织类型选择适当的消化液。
• 控制消化时间，尽量减少细胞损伤。
• 尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培养3～5 h后，补足培养液。
• 适当提高细胞接种密度。
人癌细胞系传代培养
• 1. 取对数生长期的培养细胞, 弃去培养液；
• 2. 加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；
• 3. 再加1ml消化液漂洗1次, 弃去大部分消化液, 室温放置2～5min；
• 4. 镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培养液, 用吸管按顺序轻轻吹打；
• 5. 取样,计数,调整细胞浓度；
• 6. 按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 培养。
注意事项
• 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。
• 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。
• 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。
培养细胞的纯化方法
• 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞

作者: tie8 时间: 2012-9-27 12:31

• 崩裂酶Dispase
浓度：0.25%, 用法：37℃，1h；4℃，14h
作用：增强胶原酶的消化能力，对细胞损伤最小，多用于表皮细胞。
小鼠肝细胞原代培养－消化法
1. 脱颈处死小鼠, 浸入75%酒精中1min, 沥干。
2. 剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打开腹腔,取出肝脏。
3. 修剪除去肝门区血管结缔组织,剪取一块蚕豆大小的肝组织。
4. 把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无血清培养液淋洗2～3次。
5. 将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消化液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇匀。
6. 消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离心管。
7.离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 用RPIM1640培养液(含10%胎牛血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.将细胞接种于培养瓶中, 密度为106/ml　(2×105/cm2),　37℃、5%CO2培养。
注意事项
• 根据组织类型选择适当的消化液。
• 控制消化时间，尽量减少细胞损伤。
• 尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培养3～5 h后，补足培养液。
• 适当提高细胞接种密度。
人癌细胞系传代培养
• 1. 取对数生长期的培养细胞, 弃去培养液；
• 2. 加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；
• 3. 再加1ml消化液漂洗1次, 弃去大部分消化液, 室温放置2～5min；
• 4. 镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培养液, 用吸管按顺序轻轻吹打；
• 5. 取样,计数,调整细胞浓度；
• 6. 按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 培养。
注意事项
• 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。
• 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。
• 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。
• 细胞生长缓慢：培养液或血清改变，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等，低水平的细菌或霉菌污染，接种细胞数太少，有限培养细胞衰老，支原体污染
培养细胞的纯化方法
• 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞

作者: u234 时间: 2012-9-27 12:34

有哪位养过大鼠DC细胞，能不能谈一谈经验以及注意事项？谢谢！

作者: DDD 时间: 2012-9-27 12:34

我正准备做细胞培养，请教各位：人与动物之间药物剂量有换算公式，那么人和细胞间有吗？

作者: caihong 时间: 2012-9-27 12:34

您好！看了你发的帖子，但是还不是很明白，我们同学一般是用第8因子来鉴定的，也就是用免疫组化的方法，我想问的就是免疫组化的具体原理和操作，好像还有作苏木素和伊红染色的，好像是用一个试剂盒检测，但是我也是不是很清楚，所以上来问问。谢谢！希望你能解答！

作者: TAT 时间: 2012-9-27 12:35

我想培养HSC-T6,哪位老师有此方面的经验？
刚开始时须注意哪些问题并应做哪些预防工作？
谢谢！

作者: 101010 时间: 2012-9-27 12:36

相关疾病：前列腺增生.问题请教：
本人培养的是前列腺原代细胞，主要过程是取回前列腺增生的手术标本，利用胶原酶消化后培养，但是在原代长好后（不是很均匀），第一次利用0.25胰酶消化后传代，但是传代的细胞不贴壁，我控制了消化的时间，应该不是时间的问题，请教了师姐后，她认为可能是没有使用含血清的培养液来中止消化反应的问题（因为我使用的是无血清的培养液），于是本人再次传代，这次使用0.1的胰酶，时间很短，而且利用含有胎牛血清的培养液中止反应，但是传代的细胞两天了仍然没有贴壁，不知道什么原因，请哪位高手帮忙。不知道是不是胰酶对这种细胞的损伤太大，还是其他什么原因。有没有什么好办法。
谢谢。
我的email是：caofeng005@yahoo.com.cn
如果哪位有什么建议请告诉我，谢谢。

作者: baidukk 时间: 2012-9-27 12:36

我做的细胞非常珍贵,所以染色后想重新挑回活细胞进一步培养,不知有没有影响??

作者: join 时间: 2012-9-27 12:37

我打算按下面步骤的做大鼠肝细胞原代培养,大家有什么建议,请帮我提出,谢谢拉!

1.平衡液/Hanks, 2%戊巴比妥钠, 肝素20 u/100g,, 75%酒精
2.4型胶原酶，购自SIGMA公司，
3.0.4%台盼蓝
4.培养液
RPMI1640：100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，107mol/L的胰岛素，107mol/L的地塞米松, 5%小牛血清
5.分离液：HBSS + 0.01-0.02%Ⅳ型胶原酶；
步骤---------

1．取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥钠10mg/100g体重、肝素20 u/100g体重分别腹腔注射以麻醉和抗凝。
2．10-15分钟后固定大鼠，75%酒精消毒，紫外灯照射15-30分钟。腹部再次75%酒精消毒后正中切开打开腹腔并更换器械。]
3．分离：小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，加入适量肝细胞洗涤液（4oC预冷），撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，剪成约1mm3的小块，用4℃的平衡液冲去残余血液，换用含0.05%胶原酶的RPMI1640培养液(缓慢加)37℃消化，30min制成肝细胞悬液。
4. 纯化：将肝细胞分散于预冷的Hanks液中，以200目滤网滤过，50g离心清洗3次（600 r/min 40s，800 r/min 50s和1000 r/min 60s），按5：3比例加入分离液和细胞悬液，悬液用吸管吸取后小心铺垫在分离液表面，1000~1200 r/min离心10min，吸取最下层纯化的肝细胞悬浮于5%小牛血清的RPMI1640培养液中,100目筛网过滤入50ml离心管，500rpm离心1-2分钟。去上清，沉淀加入RPMI 1640 （4oC预冷）20-30ml洗涤3次。肝细胞沉淀加入肝细胞培养液重悬为10ml，取适量计数并用0.4%台盼蓝染色判断存活率。后即可按实验设计接种培养。

5. 活率测定：纯化的肝细胞悬液与0.4%台盼蓝等量混匀，涂片，显微镜下观察，记数100个肝细胞，呈兰色者为死亡细胞，反之为活细胞，计算百分比。用0.4%台盼蓝排除法测得细胞密度大于90%者用于实验。调细胞密度为2×107/ml，接种于24孔板，放于培养箱中。

培养
1．用1640合成培养基（含10％AB型人血清）细胞混悬液稀释至2×10的5次/ml后,分别接种在96孔/24孔细胞培养板或培养瓶上。
2.加入胎牛血清（改善分离肝细胞功能），维生素C，胰岛素（提高肝细胞的存活率），注意氧气的供给，保持37摄氏度，5％CO2条件下在培养箱内先培养18～20小时
4．换液去除残存血细胞，再用同样的培养基培养7～10天。

作者: memory 时间: 2012-9-27 12:37

今天在这里又学了不少。我是做分子生物的，现在要养细胞，以前没什么了解，现在在这里学了不少。谢谢各位战友了。
我准备建肌细胞系，请各位给我一些建议。

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:38

请问原代肿瘤细胞怎么养？多谢！

作者: 49888 时间: 2012-9-27 12:38

请问各位大虾：若1640中含酚红是否对某物质在1640中的吸光度有影响？

作者: finger 时间: 2012-9-27 12:39

有哪位做过大鼠骨骼肌细胞的原代培养？请指导我一下，我做了多次都不成功。谢谢了。

这位朋友，不知道现在做得如何，我也要开始做，如果有什么心得请指教，如果没有，我们可以互相帮助，好吗

上面两位战友，现在做得怎么样了呀？本人要做猪骨骼肌的细胞培养，请问你们有什么经验呀，给我提供点意见。开始要如何准备呀？盼回复！谢谢！

作者: finger 时间: 2012-9-27 12:39

各位战友，我是新手，准备猪骨骼肌细胞的培养，请赐教！

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-27 12:40

请问，如何提取鼠肾脏近曲小管细胞呢，如何区分及分离出所需细胞呢，请赐教。

作者: JK.jon 时间: 2012-9-27 12:41

求教：我准备做小鼠骨骼肌细胞培养，找不到相关文献，请赐教！

作者: greenbee 时间: 2012-9-27 12:41

请教：谷氨酰胺如何添加？（4度保存的配置2周后的培养基）

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 12:41

我的293cell用DMEM＋10％马血清，但是一直成团，聚集长，不成单层。求高手指点。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-9-27 12:44

各位高手、专家，有谁知道——如何取大鼠滑膜细胞，
大鼠膝关节滑膜细胞的照片可以给我一张吗？
我已经试取多次，可不知道滑膜细胞是什么样子。它在那里。
照片可寄到zhh-happyhome@sohu.com
谢谢，我很急，希望高手指点。

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 12:45

各位高手、专家，有谁知道——如何取大鼠滑膜细胞，
大鼠膝关节滑膜细胞的照片可以给我一张吗？
我已经试取多次，可不知道滑膜细胞是什么样子。它在那里。
照片可寄到zhh-happyhome@sohu.com
谢谢，我很急，希望高手指点。

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 12:45

请教：谷氨酰胺如何添加？（4度保存的配置2周后的培养基）

一般可以和培养基一起加，大概10ml中可以加100ul

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 12:46

求教：我准备做小鼠骨骼肌细胞培养，找不到相关文献，请赐教！

我这可以找到大鼠骨骼肌卫星细胞培养的资料，不知你需不需要。

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 12:47

哪位做过大鼠骨骼肌细胞的原代培养？请指导我一下，我做了多次都不成功。谢谢了。

提元代细胞时，一些小骨关节一定要尽量踢干净，组织块尽量的小，消化时宁可稍多丢一些细胞，也不要消化太过。

培养过程中，血清一定要用进口的好血清，这点非常重要，这是我们的经验也可以说是教训，尤其是最初几代，后面如果生长情况比较好，还可以换用好一些的国产血清，比如四季清就可以

作者: kuaizige 时间: 2012-9-27 12:47

分享到哪里？复制网址新浪微博豆瓣社区腾讯微博开心网人人网今天在这里又学了不少。我是做分子生物的，现在要养细胞，以前没什么了解，现在在这里学了不少。谢谢各位战友了。
我准备建肌细胞系，请各位给我一些建议。

建系不是容易的事，如果事做研究生课题，建议不宜建系，因为需要的周期长，坚定工作繁琐。

作者: zzzz 时间: 2012-9-27 12:48

我在使用Gibco优级血清是发生了一件极郁闷的事，不知各位是否有这方面的经验不吝赐教！
我培养的人BMSCs
1.在原代贴壁后长了十几个欣欣向荣的克隆，可在此血清的“滋养”下克隆逐渐减少，四天后全部跟我拜拜了！（欣欣向荣的克隆也是在此血清“滋养”下长出的）
2.用此血清传代的细胞如果细胞密度较低则无法贴壁
3.换液用此血清的细胞，虽然细胞状态很好但细胞从培养皿边缘开始逐渐“溶解”就像被消化下来一样。
注：培养液绝没有污染

我也是培养的人BMSCs，同样也用的是Gibco优级血清，但细胞不论是原代还是传代的细胞都长得很好。我想你遇见这样的情况要从以下几个方面来考虑：1、分离骨髓的单个核细胞是否成功，而且抽取的标本是否放置太久。2、血清的浓度是否合适。3、培养瓶是否合适。4、更换培养液的时间是否合适。

作者: 园丁## 时间: 2012-9-27 12:48

请问我在用玻璃瓶培养HEK293细胞时，前一天细胞还好好的，第二天看的时候细胞成片脱落，但细胞形态还很好，可能是什么原因？

作者: hyuu 时间: 2012-9-27 12:49

各位养细胞的大侠：
有没有养星形胶质细胞的呀？我现在养细胞养的真是郁闷，老是有成纤维细胞的污染，而且用摇床纯化时细胞也大都死伤好多，所剩无几。有没有大侠指导一下，
1.是不是摇床振荡的时间和速度上不合适？文献上写的是250rpm，14－16小时，而我只用了180rpm，10小时，细胞已经惨不忍睹了。
2.不知道上述的速度和时间是用于水浴摇床还是空气振荡摇床？
3.请教怎样去除成纤维细胞的污染!

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-27 12:49

请问我在用玻璃瓶培养HEK293细胞时，前一天细胞还好好的，第二天看的时候细胞成片脱落，但细胞形态还很好，可能是什么原因？

——————————————————————————————

更正：细胞形态不好。是否可能是由于培养基过黄（酸）引起的

作者: 66小飞侠 时间: 2012-9-27 12:50

请问HEK293细胞能否用2％FBS的DMEM维持培养？一般好像为5％，是这样吗？

作者: 小野花 时间: 2012-9-27 12:51

请问胎盘滋养细胞如何培养？

作者: biabiade 时间: 2012-9-27 12:51

各位前辈好！我刚开始养细胞，DMEM和1640有何区别？我如何来判断该用哪种培养基？

作者: nn255 时间: 2012-9-27 12:52

我在作MTT法测试细胞毒性时，第一步让细胞贴壁时，12小时还挺好的，36小时以后，细胞完全破碎。不知为何?请教各位大虾可能原因？在作这一步时有何注意事项？多谢！

作者: 04906 时间: 2012-9-27 12:52

请教关于卵巢颗粒细胞和内膜细胞的培养方法及注意事项谢谢.

作者: zhezhe 时间: 2012-9-27 12:53

请问各位大仙：
1、明胶包被培养瓶的浓度是多少？
2、请教明胶包被培养瓶的具体步骤？
恳求指点，不胜感激！

作者: 雪山飞鹿 时间: 2012-9-27 12:53

我们在培养大鼠骨肉瘤细胞UMR106时遇到一个奇怪的问题-------细胞的消化很难：用0.25%的胰酶37度消化20、30分钟后都还有很多难以吹打下来。最初怀疑是胰酶失效，但换用别人的胰酶（她的在消化她的细胞时没问题）结果还是不理想，不知哪位可以帮指点指点迷津？谢谢！

作者: DNA 时间: 2012-9-27 12:54

各位同仁:
请教个问题,我在培养平滑肌细胞中,出现了很多的成纤维细胞,请问有什么好的办法可以分离出它们呀
多谢了-----------------

作者: DNA 时间: 2012-9-27 12:54

各位同人:
求助___培养平滑肌细胞中,出现了很多的成纤维细胞,请问有什么好的办法可以分离出它们???
有人说.用胰酶消化以后,两种细胞贴壁有快慢:成纤维细胞贴壁快,平滑肌细胞贴壁慢,靠掌握时间将它们分离开.
上面的说法是否正确,那么消化后,(细胞贴壁过程中)该在多少小时以后将悬浮液转移,另外培养,才能得到比较纯的平滑肌细胞???
谢----不吝赐教!

作者: 小螺号 时间: 2012-9-27 12:55

在作MTT法测试细胞毒性时，第一步让细胞贴壁时，12小时还挺好的，36小时以后，细胞完全破碎。不知为何?请教各位大虾可能原因？在作这一步时有何注意事项？多谢！

作者: 一叶 时间: 2012-9-27 12:55

可以在培养瓶中铺一层明胶促进其帖壁

作者: qqq111 时间: 2012-9-27 12:56

请问有谁养过胰岛β细胞？人的或鼠的均可。另外大家听说过NIT细胞吗？
谢谢！

作者: 987789 时间: 2012-9-27 12:57

请问有谁养过嗜酸粒细胞？如何从外周血中分离培养Eos?它好养吗？

作者: newway 时间: 2012-9-27 12:58

你好！我买的是HMEM/F-12粉，在配置培养基时说明上让加入2克多的NAHCO3，培养基本身不含有HEPES,我是否可以加入一些？如果可以量是多少？与NAHCO3有没有冲突？（有的书上写着如果培养基中含有HEPES,则NAHCO3不能超过一定量，是不是这样呢）。

作者: newway 时间: 2012-9-27 12:58

主任你好，我做的是原代细胞培养，用的是“倒置贴壁法”，为什么每次我的组织块都贴不牢而飘起来，导致实验失败，有时我倒置12小时以上还是漂，有什么好的方法吗？组织块贴壁了，细胞还是长不出，结果1瓶中只有很少的细胞，是什么原因呢？

作者: glass 时间: 2012-9-27 12:59

位好，最近由于一些实验问题搞的我好头大，CHO细胞的无血清培养以及驯化我几乎一窍不通，我真的不知从何着手了。无血清培养基的其他成分的添加，驯化过程的设计，真真的让我感觉是赶鸭子上架呀！有哪位做过的能给我提供一些帮助吗？不胜感激！！！
E-mail:sillyhuier@163.com

作者: DNA 时间: 2012-9-27 12:59

我每次冻存的细胞复苏后总是长细菌，而冻存液是过滤了的。请问哪一步可能出问题？（冻存管也试过了，没问题）

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:00

1.如何选用培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：
细胞系细胞类型种组织推荐使用的培养基
293 成纤维细胞人胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清
3T6 成纤维细胞小鼠胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮细胞人肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A9 成纤维细胞小鼠结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮细胞小鼠垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纤维细胞小鼠胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纤维细胞仓鼠肾 GMEM, 10% 胎牛血清或MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
BHL-100 上皮细胞人乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT 成纤维细胞牛鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA
Caco-2 上皮细胞人结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清和NEAA
Chang 上皮细胞人肝脏 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮细胞仓鼠卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮细胞大鼠肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮细胞小鼠黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纤维细胞猴肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纤维细胞猴肾 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纤维细胞猴肾 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮细胞猫肾 MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
CV-1 成纤维细胞猴肾 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮细胞狗骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
Daudi 成淋巴细胞人淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮细胞大鼠垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮细胞大鼠垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴细胞人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮细胞仓鼠肾 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮细胞人结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮细胞人子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮细胞人喉癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴细胞人早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮细胞人纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清和NEAA
HT-29 上皮细胞人结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC 内皮细胞人脐带 F-12K, 10% 胎牛血清和肝素盐 100 ug/ ml
I-10 上皮细胞小鼠睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴细胞人骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮细胞人绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纤维细胞大鼠肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:00

Jurkat 成淋巴细胞人淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴细胞人骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮细胞人口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
KG-1 骨髓白细胞人红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮细胞大鼠肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮细胞大鼠癌 Medium 199, 5% 马血清
McCoy 成纤维细胞小鼠未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮细胞人乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素
WEHI-3b 类巨噬细胞小鼠骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮细胞人胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮细胞人羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
XC 上皮细胞大鼠肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
Y-1 上皮细胞小鼠肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:01

2.为什么要热灭活血清？
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:01

7.如何消除组织培养的污染？

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6 重复步骤4。
7 在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？
GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

10.目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？
Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:01

11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌体检验
生物化学检测
激素的检测
血红蛋白检测
Sf9 细胞生长促进及方法学检测

12.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

13.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？
是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。

14.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？
如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:02

15.如何检测内毒素(热源)水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。
胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）

16.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？
如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

17.20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？
对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。
下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况
例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-（2x0.310）＝6.78
缓冲系统 pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃
Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280

18.室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？
缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。
4℃ 25℃ 37℃
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:02

19.昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0－6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345－380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

20.High Five细胞有任何其它名称吗？
High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别？
PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。

22.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？
High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

23.High Five细胞用多大的密度冻存？
3.0x10E6 cells/ml

24.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。

25.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。
胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：
1. 去除培养基。
2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。
4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）
6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

作者: 831226 时间: 2012-9-27 13:02

26.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

27.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？
使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
相关生长效率分析：
当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。
细胞毒分析：
当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。
相关形态学和分化分析：
检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。
所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）
经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

28.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

作者: one 时间: 2012-9-27 13:03

我每次冻存的细胞复苏后总是长细菌，而冻存液是过滤了的。请问哪一步可能出问题？（冻存管也试过了，没问题）

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如果你确定冻存前的细胞没有污染，冻存过程没问题，那么试试从复苏过程找原因。

复苏时要用双蒸水融化细胞，细胞冻存管管口以上不要没入水中，避免污染。试试看。

作者: baidukk 时间: 2012-9-27 13:04

谁知道小鼠肝星状细胞的提取方法？急急急

作者: 131415 时间: 2012-9-27 13:07

培基中是否有谷氨酰胺,在厂家所销售的目录中都写有,就是相同的厂家也会有含或不含的明确标志!

作者: 131415 时间: 2012-9-27 13:07

你好,你完全可用弯头的吸管去掉成纤维细胞,
先用记号笔画圈住以后,然后按记号刮掉.

作者: 131415 时间: 2012-9-27 13:08

贴壁法要注意以下几点:
1.组织块要剪得越细越好,越细小越贴.肉眼见要小过芝麻.
2.组织块要每二至三十块为一瓶,用25ML的瓶子.
3.翻瓶的时间为8个小时为最宜.
4,漂浮的组织块仍可用再贴,效果还不错.
5.原代培养的时间较长,组织块有时要2星期才能长细胞,不要急.
6,你可用促生长因子,每100UG/ML可促进长生和贴壁速度.

作者: 131415 时间: 2012-9-27 13:08

你的细胞消化不下来,你的胰酶是有什么成分?含EDTA不?
有0.02%DETA加入效果会大增.

作者: xingyi08 时间: 2012-9-27 13:10

我用的胰酶里加了EDTA。后来在用之前温热了一下胰酶，感觉效果好了一些：37度15分钟后吹打较容易，但仍然不理想，细胞老是成团成团的。另一个问题请教：反复离心对细胞的损害到底有多大？

作者: c86v 时间: 2012-9-28 10:11

相关疾病：慢性粒细胞白血病白血病.我目前准备培养慢性粒细胞白血病患者的CD34+细胞（从骨髓中提取），但查文献发现需要用无血清培养基，再加各种生长因子。不知原因是什么？如果采用加血清的培养基会有什么后果？（因为本实验室培养细胞均用加血清的培养基，无血清培养经验不足且成本可能较高）顺便请教一下CD34+的造血干细胞培养方法（包括白血病细胞），请各位高人指点一二，不胜感谢！！！

作者: 911 时间: 2012-9-28 10:12

我想用可拆卸的酶标板做细胞培养，但买来得不是无菌的，谁知道怎么处理呢？是和一次性培养板处理一样呢？请指教。谢谢。

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-28 10:13

请教海马细胞的培养中如何诱导它的凋亡？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-28 10:13

我知道一个方法，你可以试试：先用清水泡，然后用棉签擦，再用清水泡，然后烘干，烘干后用稀酸泡一夜，然后取出用清水冲洗，然后将它放在双氧水中过一夜，后烘干，然后在75%的酒精中浸4小时，取出后在紫外灯下烘干。

作者: #问号# 时间: 2012-9-28 10:14

嗨，朋友，我现在养了150只大白老鼠，正等着我宰割，可惜我却苦于无从下手，哪位好心人，帮我一把，让这些伟大的志愿者早日升入天堂，也好为你我这些人类谋求几许福利，我替他们谢您了！请问，枯否细胞原代培养，应怎样分离，用什么方法培养呢？盼复，敬侯佳音！

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-28 10:15

请教高手：
我买的CALTAG 公司的单抗：鼠抗人cd28，catlog no：MHCCD2800 克隆号：15E8(CLR-402).鼠抗人cd3：The catlog no.is MHCCD0300 and 克隆号： S4.1(706）
这两种抗体能不能做淋巴细胞培养的联合刺激剂？我用了，淋巴细胞就是不长，有什么办法？还有，淋巴细胞分离时有大量的血小板混入，怎么解决？
谢了！

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我的课题是与混合淋巴细胞培养有关的。对于淋巴细胞分离，我用的是Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences), 建议用4-20%果糖（sucrose)溶液小心注在Ficoll 液上，形成密度梯度，再将血液小心注到果糖上，避免混合，离心后即可在果糖与Ficoll 交界处得到较纯的淋巴细胞，血小板则留在果糖液上。

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-28 10:16

请教：谷氨酰胺如何添加？（4度保存的配置2周后的培养基）

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我用的是sigma公司的粉剂，内含谷氨酰胺，在公司说明书上注明，配成液体后可在4度黑暗中保存1月，因此我认为在1月内谷氨酰胺的浓度应该可以保证大多数细胞的需要。

作者: 分子式 时间: 2012-9-28 10:16

请教各位:我从CCTCC购买了人肝细胞癌细胞Hep-G2，开始生长情况很好，但是传到第三代时出现大量的细胞死亡，找不到原因。培养基、操作方法都没有变化。

作者: 火树银花nm 时间: 2012-9-28 10:17

请教各位老师，我在24孔板中能否培养每孔10的6次方个细胞，在24孔板中能否培养每孔10的7次方个细胞。谢谢了！

作者: 泡泡 时间: 2012-9-28 10:17

请问细胞贴壁率的计算方法？

作者: tie8 时间: 2012-9-28 10:25

各位大侠，有谁做过悬浮细胞的扫描电镜？细胞应该如何处理？是离心后涂片还是用其他的有特殊的玻片吗？请赐教，多谢！

作者: 131415 时间: 2012-9-28 10:26

请问哪里有GIMSA染色液卖，catalog no 是多少？

作者: 33号 时间: 2012-9-28 10:37

问一下,有人做过vero细胞的鉴别试验吗,请赐教方法,本人养细胞时间不长,谢谢

作者: 33号 时间: 2012-9-28 10:38

有谁培养过CD34+细胞（包括白血病细胞），望不吝赐教，多谢！！！

作者: TNT 时间: 2012-9-28 10:39

各位大虾：我前两天复苏了两瓶COS-7细胞，一瓶在1640下长得挺好的，但另一瓶在DMEM下长得一片一片掉。为什么？然后我把在1640 下长的细胞分瓶处理后，刚开始还挺好的，但第二天看细胞又开始掉了。不知道什么原因，是不是培养基的问题，还是其他问题，又谁碰到过这种情况？请指教！还有，CO2对COS-7有影响吗？因为我这两天没用CO2。

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-28 10:40

我的C6细胞用G418筛选都用到2mg/ml了，预实验1200－1500ug/ml。以前有养C6作转染的吗？浓度是不是太高了？不会是细胞有问题吧？
盼恢复！谢谢

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-28 10:41

各位大虾：我前两天复苏了两瓶COS-7细胞，一瓶在1640下长得挺好的，但另一瓶在DMEM下长得一片一片掉。为什么？然后我把在1640 下长的细胞分瓶处理后，刚开始还挺好的，但第二天看细胞又开始掉了。不知道什么原因，是不是培养基的问题，还是其他问题，又谁碰到过这种情况？请指教！还有，CO2对COS-7有影响吗？因为我这两天没用CO2。

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既然长的好时用了CO2，那就再用一下，应该用的，为什么不用了呢

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-28 10:41

你好！我买的是HMEM/F-12粉，在配置培养基时说明上让加入2克多的NAHCO3，培养基本身不含有HEPES,我是否可以加入一些？如果可以量是多少？与NAHCO3有没有冲突？（有的书上写着如果培养基中含有HEPES,则NAHCO3不能超过一定量，是不是这样呢）。

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可以根据PH值加入HEPES，因为它本身就是起稳定PH值的作用。而NAHCO3 也起缓冲PH值的作用。所以无论怎样规定，都是为了培养液的PH稳定。没有什么硬性冲突或规定。

当然要按照说明书操作，而不是某某书。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-28 10:42

我用的胰酶里加了EDTA。后来在用之前温热了一下胰酶，感觉效果好了一些：37度15分钟后吹打较容易，但仍然不理想，细胞老是成团成团的。另一个问题请教：反复离心对细胞的损害到底有多大？

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1，你的E酶时间太长了，效力低。
2，你的E酶浓度可以再高一些，或加大EDTA的浓度，但细胞要彻底洗干净。
3，如果没有必要，最好不要反复离心。一般细胞洗涤2-3次即可。

作者: 831226 时间: 2012-9-28 10:42

我现在做人乳腺导管上皮细胞的原代培养，各位前辈有谁养过的能不能指点几招？我试着养了一次，没养成。我参照的是司徒镇强《细胞培养》一书中乳腺上皮细胞的组织块法。多谢各位了！

作者: 了了 时间: 2012-9-28 10:43

我想请教一个十分简单的问题，我发了帖子，但没人回答，请不吝赐教。请问细胞贴壁率的计算方法和公式是甚末，国际上公认的是哪种啊？我记得在某本书上见过，但再就找不到了。我正在写文章，很急。我在这里先谢谢了

作者: 小野花 时间: 2012-9-28 10:43

小第最近在培养293细胞，从同道那里取得细胞后，传二代后细胞就不行了，我用的是普通的玻璃培养瓶，开始用DMEM+10%FBS不行,考虑是不是和原来所用的培养液不一样就不行？后来使用和原来一样的培养液Opti-MEM+10%FBS，细胞还是不行，传一代后细胞情况还很好，再传二、三代后细胞就全部漂浮起来了。请别人来看了一下，没有污染的迹象。
请问我该怎么改变现在的培养方法？能不能换成DMEM+10%FBS培养？
恳请各位高手指点，不胜感激。

作者: cocacola 时间: 2012-9-28 10:44

293细胞用酶消化很容易下来，但是吹成单细胞却有点麻烦。各位能不能帮我指出问题出在什么地方。请问yong主任单纯吹下来的293细胞容不容易成单细胞形态？

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用进口的消化液能将293完全分散！好像是Gibco的。

作者: sunnyB 时间: 2012-9-28 10:44

小第最近在培养293细胞，从同道那里取得细胞后，传二代后细胞就不行了，我用的是普通的玻璃培养瓶，开始用DMEM+10%FBS不行,考虑是不是和原来所用的培养液不一样就不行？后来使用和原来一样的培养液Opti-MEM+10%FBS，细胞还是不行，传一代后细胞情况还很好，再传二、三代后细胞就全部漂浮起来了。请别人来看了一下，没有污染的迹象。
请问我该怎么改变现在的培养方法？能不能换成DMEM+10%FBS培养？
恳请各位高手指点，不胜感激。

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转到塑料瓶试试看

作者: DDD 时间: 2012-9-28 10:46

请问各位293细胞一天过去了都还没贴壁，还可能存活吗？我的293细胞是刚复苏的，复苏一个星期细胞长势还好，期间换了一次液，然后可能由于未及时换液，部分细胞悬浮起来。再次换液之后细胞可能由于PH的变化全部悬浮起来，于是我就直接吹打分散细胞进行培养，但细胞在一天之后还未贴壁，这样的细胞存活可能性大吗？望回复！谢谢！

作者: vcve 时间: 2012-9-28 10:46

请教：如何分离大鼠主动脉平滑肌细胞，以及用哪一种培养基（高糖还是低糖）较好？

作者: lgm 时间: 2012-9-28 10:47

请教各位前辈:为什么ＭＳＣｓ的原代培养 14～ 1 6ｄ后细胞呈旋涡状或平行状排列,谢谢

作者: xueyouzhang 时间: 2012-9-28 10:48

请教：有没有前辈原代培养过嗜铬细胞瘤（或肾上腺髓质细胞）细胞？细胞表面总有一团团的东西（是否分泌物－肾上腺素？），如何去除？
谢谢先

作者: biabiade 时间: 2012-9-28 10:49

各位大侠，小弟求教什么叫“细胞的异质性”？

作者: biabiade 时间: 2012-9-28 11:00

大侠们，有谁养过人的牙周膜细胞，能谈谈经验吗？

作者: 33号 时间: 2012-9-28 11:06

谁能提供小鼠血管内皮细胞资源???谢谢!!!

作者: zzzz 时间: 2012-9-28 11:06

293细胞很难养，谁能说说经验吗？还有C2C12细胞？

作者: rxcc33 时间: 2012-9-28 11:07

又：
细胞增殖推荐用promega的MTS法，简单，方便，好用！！

我用MTS法检测淋巴细胞增殖（PHA刺激），但不同浓度PHA与OD值之间没有明显线性关系，是我的细胞养得不好，还是加MTS之前要把成团的细胞打散以利于MTS的结合，还是其他原因? 先谢谢了！

作者: rxcc33 时间: 2012-9-28 11:08

请教：我近段时间培养293细胞遇到了一些麻烦，我的细胞不存在传代后贴壁不好或消化时单个细胞分离不好，每次传代后24小时观察还很好，细胞已贴壁且已伸展开，但是48小时再观察时细胞边缘出现回缩，感觉状态不好。这时如果换液，细胞能继续生长，若不换液，细胞则停止生长，一直呈壁不伸展状态。这种状态培养的细胞用于病毒包装时效果极差。我前几个月培养293细胞时均无此种现象，细胞生长极好，速度也很快，现在急着转染但细胞总是长不好。我一直用hyclone的优胎，以前用的是100ml装，用了3瓶都很好，后来考虑用量大，换成500ml装，当时没注意是否是一个批号。我也不知道是不是血清批号不同而质量不同导致细胞生长有好，或者是其他原因。近两天我又买了一瓶defined级优胎，目前看来情况差不多。就因为此，我都复苏了7、8支细胞了，再如此下去，我以前冻存的细胞就要被用光了。请各位多帮我提提意见，找找原因，在此谢谢了！

作者: duoduo 时间: 2012-9-28 11:11

请教高手:
不知为什么,我的细胞培养瓶中出现一层膜状物,细胞随之死亡,请高手指点是何污染? ---焦急万分!

作者: 园丁## 时间: 2012-9-28 11:15

相关疾病：肝癌.培养肝癌乳腺‘癌细胞的问题

我们培养的细胞购于上海细胞研究所
回来后按他们的配方配置培养液
可是细胞状态不好
两天开始出现大量脱壁
培养液中出现黑的颗粒
无运动
请人看过
说可能不是污染
询问公司
说我们用的四季青的血清细胞不适应他们用的进口的
让我们加大血清的含量、
血清含量加了还是没有变化
不知道我们的细胞能不能活过来
谁养过这种细胞给点意见
怎么补救呢

作者: loli 时间: 2012-9-28 11:16

在细胞培养中遇到的问题：
严格无菌条件下取大鼠巩膜，在超净台内用眼科剪剪成1mm*1mm左右的小块，用显微针持放进培养瓶，倒置放在培养箱1小时左右内使其帖壁，然后加入含10%FBS的DMEM（含双抗），将培养瓶正过来，使组织块接触到培养液。在37度，5%CO2的培养箱培养。DMEM用GIBCO公司，FBS杭州四季青。
先后培养了四次，最久的到目前已经有15天了，还没有发现细胞从组织块长出。培养液颜色红，跟刚加入时差不多，没有发现污染的现象。
请高手指教，是什么原因导致细胞没有生长？
注：
巩膜成纤维细胞的培养在国外已经有报道，国内也有一家报道。
培养的方法以组织块培养为主，也有消化法培养的。
据说5-7天后，细胞可以从组织块长出。

是不是消化法成功的可能性更大些？用什么消化液好些？

作者: loli 时间: 2012-9-28 11:17

相关疾病：支原体感染.
最近细胞传代后老是不贴壁，肉眼能看到白色絮状沉淀，镜下为成团的细胞，疑为有支原体感染可能，故加入10μg/ml环丙沙星，结果细胞倒是能帖壁，但细胞形态有所改变：细胞仍为梭形或多边形，但立体感减弱（折光性减弱），细胞核不清。怀疑是不是环丙沙星对细胞的影响，不知哪位能指点指点？在下先行谢过了！

作者: u234 时间: 2012-9-28 11:17

各位高手，请教一个问题，我培养的是原代神经干细胞，细胞因子浓度为20mg/L，N2为100倍稀释，培养液为GIBCO的N2培养液。细胞生长只能维持一-二代后，即大小不均，细胞变黄，培养液的颜色仍然没有变化，而细胞逐渐开始死亡。我的操作与文献相同，全部过程无污染，请教各侠。

作者: 969 时间: 2012-9-28 11:18

相关疾病：高血压.以下是我做高血压患者平滑肌细胞培养的体会，希望对大家有用！
1.取材
外科腹部手术分离切取血管后立即置入含100Ｕ/ｍｌ青霉素、100μｇ/ｍｌ链霉素和10%胎牛血清的无菌ＤＭＥＭ/Ｆ12培养液中,带回实验室后立刻行原代接种培养，血管从离体到贴壁的时间尽量要短，以保证细胞能在最快的时间获得营养。
2.植块大小
植块大小要合适（0.5～1ｍｍ3/块），如果植块过大,则植块内部大量的ｈＶＳＭＣ因营养摄取不足,而不易迁出向外生长，而如果植块剪切过小,则ｈＶＳＭＣ损伤较多,不利于其生长。并且剪切植块时边缘要尽量整齐，有利于细胞的游出。
3.培养基
用ＤＭＥＭ/Ｆ12培养基代替ＤＭＥＭ培养基,因ＤＭＥＭ/Ｆ12培养基内含有利于ｈＶＳＭＣ生长的因子及成分,特点是Ｃａ2+和Ｍｇ2+含量高,氨基酸、维生素和葡萄糖丰富,使ｈＶＳＭＣ在体外培养生长良好,并能保持原来形态和生物学特征。另外,培养液的ｐＨ值应在7.2- 7.4,宁酸勿碱,这是因为ｈＶＳＭＣ对碱性环境的耐受性较差,反而在稍微偏酸性的环境下生长得更好。
4.贴壁时间
植块贴壁干涸3-6ｈ后再翻瓶,这可使植块贴壁较紧,并且不会因干涸贴壁时间太长使细胞缺乏营养而影响生长。
5.血清
胎牛血清比小牛血清好。原代培养时,用20%(ｖ/ｖ)胎牛血清;传代培养时,可改用10%(ｖ/ｖ)胎牛血清。
6.培养液用量
原代培养初期,培养液用量不应超过3ｍｌ(以25ｍｌ培养瓶为例),最佳为1-1.5ｍｌ，仅够保持植块湿润即可。培养液量太多,会使植块漂浮而贴壁失败。
7.静止培养
培养开始时必须绝对静置3d,培养瓶不能震动和移动,以防刚贴壁的细胞重新漂浮而死亡,影响成活率。
8.传代细胞消化程度
胰酶浓度为0.1%，最佳的传代消化时间为60-90ｓ(室温20～25℃)，这样细胞刚好能从瓶壁上消化下来而不受损伤,而贴壁牢固的少量残余成纤维细胞却未能消化下来,可起到去除成纤维细胞及纯化平滑肌细胞的作用,经过数次传代后,ＶＳＭＣ的纯度达98%以上。

作者: 49888 时间: 2012-9-28 11:19

有关细胞冻存方法，说法不一。《现代分子生物学实验技术》上说4度4-5小时或过夜，移至-20度冰箱2小时，再悬于液氮罐颈口1小时，最后浸入液氮。而我们版块上说冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。
** 註：-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞死亡。亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍盒內，直接放入-80℃冰箱，但存活率會降低。
请问各位大虾是如何操作的？

作者: 49888 时间: 2012-9-28 11:20

有关细胞冻存方法，说法不一。《现代分子生物学实验技术》上说4度4-5小时或过夜，移至-20度冰箱2小时，再悬于液氮罐颈口1小时，最后浸入液氮。而我们版块上说冷凍管置於 4℃、 10~30分鐘 →移至-20℃、30分鐘** → 移至-80℃、16～18小時（或隔夜）→移至液氮槽vapor phase長期儲存。
** 註：-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞死亡。亦可跳過此步驟，冷凍管置於厚保麗龍盒內，直接放入-80℃冰箱，但存活率會降低。
请问各位大虾是如何操作的？

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我的方法是细胞消化后用生长液清洗一遍,然后假如冻存液(G ibco),分装后放置于冰中4分钟,然后转移至-70冰箱24小时,在转移到液氮中.我一直是这么做的复苏效果不错.

作者: 49888 时间: 2012-9-28 11:22

有没有人养BHK-21和VERO细胞的，请过两招来。

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做硕士期间,我养过Vero细胞

作者: mamamiya 时间: 2012-9-28 11:22

请教各位大师，有没有养过横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）的，我用0.25%胰酶消化，置5％CO2孵箱5分钟，已看到很多细胞脱落，但未脱落的细胞仍未变形，吹打时又很容易脱落，其最佳消化时间是多少，出现这种情况的原因是什么，有谁能告知一二吗？

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:23

用大鼠主动脉平滑肌吗？首先大鼠的选择要合适的年龄体重范围内的，平滑肌细胞长得较慢，在爬出来之前，不要过早的移动培养瓶，可以用胰酶消化法，查一下司徒振强的细胞培养。刚开始比较难养，坚持几次就有经验了。

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thank you very much
我开始用的大鼠，胎块法，做了5次，2个星期后有5个块周围长得很好，但1次换液以后，死了。好象ph到了8。再次向您请教，是否因为培养液ph导致，我用dmem，没加hepes。

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:25

以下是我做高血压患者平滑肌细胞培养的体会，希望对大家有用！
1.取材
外科腹部手术分离切取血管后立即置入含100Ｕ/ｍｌ青霉素、100μｇ/ｍｌ链霉素和10%胎牛血清的无菌ＤＭＥＭ/Ｆ12培养液中,带回实验室后立刻行原代接种培养，血管从离体到贴壁的时间尽量要短，以保证细胞能在最快的时间获得营养。
2.植块大小
植块大小要合适（0.5～1ｍｍ3/块），如果植块过大,则植块内部大量的ｈＶＳＭＣ因营养摄取不足,而不易迁出向外生长，而如果植块剪切过小,则ｈＶＳＭＣ损伤较多,不利于其生长。并且剪切植块时边缘要尽量整齐，有利于细胞的游出。
3.培养基
用ＤＭＥＭ/Ｆ12培养基代替ＤＭＥＭ培养基,因ＤＭＥＭ/Ｆ12培养基内含有利于ｈＶＳＭＣ生长的因子及成分,特点是Ｃａ2+和Ｍｇ2+含量高,氨基酸、维生素和葡萄糖丰富,使ｈＶＳＭＣ在体外培养生长良好,并能保持原来形态和生物学特征。另外,培养液的ｐＨ值应在7.2- 7.4,宁酸勿碱,这是因为ｈＶＳＭＣ对碱性环境的耐受性较差,反而在稍微偏酸性的环境下生长得更好。
4.贴壁时间
植块贴壁干涸3-6ｈ后再翻瓶,这可使植块贴壁较紧,并且不会因干涸贴壁时间太长使细胞缺乏营养而影响生长。
5.血清
胎牛血清比小牛血清好。原代培养时,用20%(ｖ/ｖ)胎牛血清;传代培养时,可改用10%(ｖ/ｖ)胎牛血清。
6.培养液用量
原代培养初期,培养液用量不应超过3ｍｌ(以25ｍｌ培养瓶为例),最佳为1-1.5ｍｌ，仅够保持植块湿润即可。培养液量太多,会使植块漂浮而贴壁失败。
7.静止培养
培养开始时必须绝对静置3d,培养瓶不能震动和移动,以防刚贴壁的细胞重新漂浮而死亡,影响成活率。
8.传代细胞消化程度
胰酶浓度为0.1%，最佳的传代消化时间为60-90ｓ(室温20～25℃)，这样细胞刚好能从瓶壁上消化下来而不受损伤,而贴壁牢固的少量残余成纤维细胞却未能消化下来,可起到去除成纤维细胞及纯化平滑肌细胞的作用,经过数次传代后,ＶＳＭＣ的纯度达98%以上。

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:26

有资料说翻转时间仅用40分钟。
您用过酶解法吗？请指教

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:26

你的贴壁法要注意以下几点:
1.组织块要剪得越细越好,越细小越贴.肉眼见要小过芝麻.
2.组织块要每二至三十块为一瓶,用25ML的瓶子.
3.翻瓶的时间为8个小时为最宜.
4,漂浮的组织块仍可用再贴,效果还不错.
5.原代培养的时间较长,组织块有时要2星期才能长细胞,不要急.
6,你可用促生长因子,每100UG/ML可促进长生和贴壁速度.

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:27

有2个问题请教
.翻瓶的时间为8个小时为最宜，是否太长？
促生长因子用什么？能用医院里的胰岛素，还是用sigma 的insulin?

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:27

各位同仁:
请教个问题,我在培养平滑肌细胞中,出现了很多的成纤维细胞,请问有什么好的办法可以分离出它们呀
多谢了-----------------

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:28

请教几个问题，你用的是贴块，还是酶解？你用兔吗？你贴的是中膜？你能分清2种cell?2种很相像！内皮cell也是成纤维型！

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:29

我培养牛胸主动脉平滑肌细胞时发现，消化液中存在着大量的胶原纤维，严重影响平滑肌细胞贴壁。我是这样消化组织的：
1 剪碎组织
2 加入0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA，37度，搅拌消化20min。
3 静置取上清，加DMEM培养液，离心（2000r×10min）
4 弃上清，加入DMEM培养液，吹打，移入培养瓶。

请教高手指点！

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:31

我正在做兔动脉平滑肌细胞培养，我们交流一下。你为什么用牛的？你用胰酶消化，文献上很少。你用这种酶，什么依据？为什么不用胶原酶？离心（2000r×10min，要这么快，怎么长吗？

作者: 阿敏 时间: 2012-9-28 11:32

近来开始做我的研究生课题，但在取大鼠血管平滑肌细胞进行原代培养时出现困难，请各位有经验的大虾给点指教，先谢谢啦!

作者: 大尾巴 时间: 2012-9-28 11:33

请问有没有用293细胞做稳定转染的，能否交流一下

作者: 101010 时间: 2012-9-28 11:33

请问有培养脐血细胞的吗?我培养了很长时间但是效果不佳,请高手指点.

作者: 101010 时间: 2012-9-28 11:33

各位高手，请教一个问题，我培养的是原代神经干细胞，细胞因子浓度为20mg/L，N2为100倍稀释，培养液为GIBCO的N2培养液。细胞生长只能维持一-二代后，即大小不均，细胞变黄，培养液的颜色仍然没有变化，而细胞逐渐开始死亡。我的操作与文献相同，全部过程无污染，请教各侠。

其实神经干细胞培养只需用普通DMEM培养基即可,培养过程中加入bFGF EGF
(均为10ng/ml),每三天换液,培养一个月左右即可见到神经球出现,取出单个神经球,吹散后,种入另外培养瓶中,后获得的细胞即为神经干细胞.

作者: tuuu2 时间: 2012-9-28 11:34

经观察证实，该细胞形态的改变并非因环丙沙星所至。实乃细胞消化过渡，培养4天后细胞形态恢复，看来细胞的消化看似简单，却非常关键的；在10μg/ml的浓度下，环丙沙星对细胞形态没有明显影响。

作者: cocacola 时间: 2012-9-28 11:34

大家，我刚开始养MDA-MB-231乳腺癌细胞，目标是实现大规模培养，用于提取细胞膜上的蛋白，可是养了一段时间，细胞密度上不去，中方瓶里的最高密度也就是7*105cells/ml。希望得到高人的指点！

作者: zhezhe 时间: 2012-9-28 11:35

各位养细胞的大侠：
有没有养星形胶质细胞的呀？我现在养细胞养的真是郁闷，老是有成纤维细胞的污染，而且用摇床纯化时细胞也大都死伤好多，所剩无几。有没有大侠指导一下，
1.是不是摇床振荡的时间和速度上不合适？文献上写的是250rpm，14－16小时，而我只用了180rpm，10小时，细胞已经惨不忍睹了。
2.不知道上述的速度和时间是用于水浴摇床还是空气振荡摇床？
3.请教怎样去除成纤维细胞的污染!

作者: zhezhe 时间: 2012-9-28 11:36

我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需要注意两方面：1，取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2，差速贴壁法，可以将细胞先差速贴壁20~30分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可，你不妨试试！祝你实验顺利！

作者: 2541 时间: 2012-9-28 11:36

谁养过 MCF-7, HEPG2, HEP3B、
求它们的培养技术指导
MCF-7在消化后不容易贴壁，而且生长不是很快，

作者: mamamiya 时间: 2012-9-28 11:37

c2c12也很好养。不知你是有什么问题。如果你的细胞长得不好，可以用20%FCS的DMEM培养一段时间，应该会活化。不能让他长过满，可能会出现分化的问题。如果要诱导其分化为myotube, 可用在其长满80-90%时2%马血清的DMEM培养3-4天，可见细胞融合成肌纤维。

作者: yonger 时间: 2012-9-28 11:37

有人养过MDA-MB-231乳腺癌细胞吗？我的目标是要大规模培养它，从而提取膜上的蛋白，但是现在的问题是，细胞密度上不去，有人能指点下吗？
很是困惑啊！

作者: nn255 时间: 2012-9-28 11:37

哪位前辈高人有血管平滑肌细胞？我愿买！千万帮忙，不能见死不救

血管平滑肌细胞我到有，不知你在那。

作者: 831226 时间: 2012-9-28 11:38

请问各位高手有没有用293细胞做稳定转染的，转染效率如何，如用LIPOFECTAMINE 做在6孔板中加多少合适。我明年毕业，心急如焚，那位大侠指导一下，我不甚感激！

作者: DDD 时间: 2012-9-28 11:41

哪位前辈高人有血管平滑肌细胞？我愿买！千万帮忙，不能见死不救

血管平滑肌细胞我到有，不知你在那。

认识你是我的荣幸
我在徐州
我的mail是lgfduckweed@sina.com
您的呢？
急盼您的回音
望眼欲穿哪！

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-28 11:44

各位大侠好，我最近刚开始做细胞培养，很多东西不懂，今天刚来这里看，受益匪浅！现在想请教些问题：
我正在做血管内皮细胞的培养，换液时肉眼看到培养皿里有白色的细砂状的物质，显微镜下看（10×）是一些大小不一的团块，调焦后看好像中间有黑点的，请问这是细菌污染吗？细胞是不是不能要了？另外观察培养液，发现有些小的絮状的物质漂浮，是霉菌吗？培养液是在4度冰箱放置的，能用0.2μ的过滤培养液吗？听说可以做培养液的无菌试验，请问是怎样做呢？
非常感谢！

作者: 969 时间: 2012-9-28 11:45

请问各位高手有没有用293细胞做稳定转染的，转染效率如何，如用LIPOFECTAMINE 做在6孔板中加多少合适。我明年毕业，心急如焚，那位大侠指导一下，我不甚感激！

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我的师姐作过这方面的实验她的意见还是做瞬时转染，因为稳定转染用时长（据说要一年才能把条件摸熟）、效率底，而且做出来之后，结果不让人满意，现在很少人用稳定转染。你明年就毕业，一切还要从头来，最好还是再想想其他方法。

作者: ending 时间: 2012-9-28 11:47

你好.我不知道你说的平滑肌细胞是人的还是动物的.要是人的我可以给你提供一个信息.我们公司现在代理美国CASCADE公司产品.出要产品是关于人体正常组织细胞(原代)其中就包括你说的平滑肌细胞.要是对路的话请联系.电话:13911810296 隗合占

作者: DDD 时间: 2012-9-28 11:47

我的血清从负20度拿出来以后，在室温下放了一天一夜，大概有二十四小时吧，然后灭活，灭活之后，瓶底有一些沉淀，这样对血清质量有影响吗

作者: qqq111 时间: 2012-9-28 11:48

你好，我目前准备养大鼠原代枯否细胞，想请教您几个问题。
1、请问枯否细胞是不是仅有约7天的“寿命”，因为它是终末细胞，不能继续传代培养？
2、如果原代培养是否在需要给刺激因素、提取试验数据时，现分离现试验？即：试验需要时，每次都要分离、培养，且不能超过一周？
3、请问如果属实，每次都要分离、培养，那么最经济、可行的分离、培养方法是怎样的呢？
4、想请教您，目前您用的什么方法分离、培养的原代枯否？我们可以共同探讨一下失败与成功的经验！
5、据我了解不用梯度离心，也不用链霉素蛋白酶E一样可以分离出来，只是目前我还尚未实践。请问你用的什么酶消化的？在体还是离体分离的？怎样提纯的枯否？

作者: qqq111 时间: 2012-9-28 11:49

请问谁知道哪里可以购买到枯否细胞株？价钱大约多少？

作者: langlang 时间: 2012-9-28 11:50

请教：我上个月做了几种天然提取物对Hela细胞的体外细胞毒实验（MTT法），结果让人很难以相信，请各位高手能不吝赐教。
实验中采用了5-Fu做阳性对照，并做了三个浓度，提取物也参照以前的实验做了三个浓度（去年做了HL-60细胞），结果出现提取物的OD570值比空白还高出许多，我开始以为是自己操作的原因，但重复几次仍得不到较好的结果，请熟悉这方面实验的人帮忙指点一下原因会出现在哪？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-28 11:50

请教各位大侠：

培养脐静脉内皮细胞(HUVEC)用什么培养基最好呢？
要有1640培养液和DMEM培养液，选择那种要好些呢？

敬请赐教！！！
不胜感激！！！

作者: 克隆鱼 时间: 2012-9-28 11:51

To culture neurostem cells, the most popular medium is DMEM/F12 medium plus B27 supplement. You also need to supply basic FGF and EGF at concentration of 10 -20 ug/ml in culture. DMEM/F12 medium can be purchased from Gibco and FGF and EGF can be purchased from Sigma. There are two kind of neurostem cells cultures, attached and suspension (neurospheres), the later is more popular. When you culture neurosphere, it is better to add growth factors (FGF and EGF) every day at a half dose. This will keep ralatively constant growth factor concentration in culture. There are two ways to subculture neurospheres, mechnically trituration and enzyme method. The enzyme method is more gently and effective. Some labs use enzyme cocktail for neurosphere subcultur; others use papain for digestion. Both emzyme method works well.

作者: ending 时间: 2012-9-28 11:51

我养的细胞传代后就会出现很多黑色小点，是静止不动的，培养液也没混浊，不太像污染，但细胞状态越来越差（贴壁不好，细胞变瘦且回缩），请问有哪位知道是什么原因？谢谢！

作者: 131415 时间: 2012-9-28 11:52

请问大家，谁养过SMMC-7721细胞，各方面都每问题，但老拉丝呢？谢谢

作者: join 时间: 2012-9-28 11:52

请教高人，原代中性粒细胞（取之大鼠）如何培养，能说说经验吗？还有培养液的选取．望赐教！

作者: 911 时间: 2012-9-28 11:53

我现在在养滋养层细胞，但是取了三次材都没有看到要的细胞，我的方法是先用胰酶消化10分钟，再用DNA酶消化10分钟。不知有哪位大侠有养这种细胞的经验，请赐教！！不甚感激！

作者: yhz1973 时间: 2012-9-28 11:53

有做肾小球系膜细胞原代培养的同学吗？我们做过很多次原代，有时贴壁但系膜细胞爬出很慢，生长一段时间后还来不及传代细胞数量便逐渐减少。唯一次很顺利约十天便长满全瓶开始传代，但用胰酶和EDTA消化传代总是一瓶活得好另一瓶不好，我们用一次性培养瓶，大多是原瓶长得比较好，极少数传的另一瓶好，条件都是一样的，想不明白，又和我做同样试验的同学请予指点。谢谢！

作者: caihong 时间: 2012-9-28 11:54

两种细胞在一起培养的文献有吗？这种培养那位大虾有经验，帮帮小虾！

作者: yhz1973 时间: 2012-9-28 11:54

胶塞的清洗？
我们的做法是
1 2%的NaOH浸泡１５分钟
２　自来水清洗干净，凉干
３　５％的稀盐酸浸泡２０分钟
４　自来水清洗１５遍，一蒸水洗３遍，三蒸水洗两遍
５　自然凉干
初次做实验，经验不足，还望多指教有何不妥

作者: yhz1973 时间: 2012-9-28 11:55

请问二型胶原酶溶液如何保存？是2——8度，还是-20度保存？
我用sigama的DMEM，请问加多少NaHCO3和hepes合适?

作者: ffooll 时间: 2012-9-28 11:55

Ⅱ型胶原酶配制成溶液后,应分装并储存在-20度,不能反复冻融
SIGMA的DMED,应加1.8g的NaHCO3和2g的HEPES,过滤之前调PH值至7.0-7.2

作者: ffooll 时间: 2012-9-28 11:56

有,免疫实验中需要用到饲养层细胞(巨噬细胞),它可以吞噬死去的或崩解的细胞碎片,尤其在悬浮细胞的转染中,用G418筛选时无法除去坏死的悬浮细胞,可利用饲养层细胞清除,可查找饲养层细胞及免疫学相关文献

作者: 了了 时间: 2012-9-28 11:56

两种细胞在一起培养的文献有吗？这种培养那位大虾有经验，帮帮小虾！

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依我个人经验，培养细胞就怕不能纯化，因为我要建立细胞系；而阁下的意思是？如果同是哺乳动物的不同细胞系，那么差别不会很大，可以用原来建系的培养基试养（二者择一）。如果要培养两种不同的细胞，比如昆虫的和
哺乳动物的，那就有点麻烦那，只有自己慢慢摸索了……

作者: xingyi08 时间: 2012-9-28 11:57

有人培养成年大鼠心肌细胞吗

作者: zhezhe 时间: 2012-9-28 11:57

成纤维细胞培养（我10年前所做的工作，和大家分享，希望对战友能有所帮助）
1.原代培养
　　　　(1)在手术室无菌条件下，切取新鲜的皮肤，增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩组　　　　　　
织，修除表皮和皮下组织，盐水反复冲洗后放入含PS的DMEM培养液内带回无菌工作间。
(2)把组织块置于培养皿内，Hank,s液漂洗三遍后吸净Hank,s液，眼科剪反复剪切组织块成0.5－1mm3大小。用弯头吸管吸取组织块接种于40ml培养方瓶瓶壁上，组织块间留约0.3－0.5cm的间距。
(3)塞好瓶塞，放入37℃电热恒温培养箱内3.5小时使培养的组织小
块微干涸。
　　(4)从温箱中取出培养瓶，向瓶底轻轻注入含20%CS及PS的DMEM培养液5ml，然后缓缓翻转培养瓶，让培养液慢慢覆盖附于瓶壁上的组织小块，置于37℃温箱内培养。
　　(5)一周后取出培养瓶，弃去瓶内培养液，Hank,s液漂洗两次后加相同的培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后，同样方法每周换液两次。
　　2.传代培养
　　待原代培养细胞生长基本融合成片时即可传代。
　　(1)吸出培养瓶内的培养液，Hank,s液漂洗两次，向瓶内加入0.5%的胰蛋白酶溶液少许以覆盖瓶底为度。
　　(2)大约1分钟左右，镜下观察细胞胞质回缩，细胞间隙增大时立即吸出胰蛋白酶液，加入DMEM培养液终止消化。
　　(3)用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞使之脱落形成细胞悬液，按1：3比例分装传代，加入足量的DMEM培养液后置于37℃恒温培养箱内培养。
　　(4)每周换液两次，待细胞融合成单层再次传代。本实验均在第4－8代进行。

作者: one 时间: 2012-9-28 11:58

谁会养肉苁蓉细胞呀,尤其是悬浮培养的条件?

作者: gogo 时间: 2012-9-28 11:58

各位大侠好，我最近刚开始做细胞培养，很多东西不懂，今天刚来这里看，受益匪浅！现在想请教些问题：
我正在做血管内皮细胞的培养，换液时肉眼看到培养皿里有白色的细砂状的物质，显微镜下看（10×）是一些大小不一的团块，调焦后看好像中间有黑点的，请问这是细菌污染吗？细胞是不是不能要了？另外观察培养液，发现有些小的絮状的物质漂浮，是霉菌吗？培养液是在4度冰箱放置的，能用0.2μ的过滤培养液吗？听说可以做培养液的无菌试验，请问是怎样做呢？
非常感谢！

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肉眼看，培养皿里的培养基是否清澈？如果是细菌污染培养基往往会变浑浊。这些团块有否影响你的细胞生长？我很早以前培养细胞时也曾遇到此类情况，一直查不到原因，恰好今天听了一个报告，其间讲到了纳米细菌，这是有人在培养哺乳动物细胞时发现的（不过现在好象还没有确实存在纳米细菌的定论），多是由培养基中的牛血清带来的（据说80%的牛血清中存在纳米细菌），由于纳米细菌具有矿化作用，会形成白色沉淀。那你遇到的这些白色物质和我的培养基中的白色片状物是否就是纳米细菌的产物呢？由于很久不培养细胞了，今天没有继续向那位教授请教。
一般都是用0.22um的滤膜过滤培养基。关于培养基的无菌状况，你可以只取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度培养一段时间后观察。

作者: 831226 时间: 2012-9-28 11:59

我今天去实验室，正好有个老师在上海买的一瓶细胞到货了，我就跟去看了看，真的学到了很多东西，本来如果是我看就一定觉得那瓶细胞长的很好，可是那个老师真是厉害在显微镜下看的好仔细，她告诉我细胞染了真菌，我还是第一次听说呢，原来有些真菌很要死的细胞碎片很象的，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。今天真的很好学了一些东西。我马上就上研二了，我课题的很大一部分就是细胞这块，希望我能从丁香园学到更多的东西，我也会把我所知道的东东毫无保留的拿出来很大家分享，希望很丁香园的每一位份子交朋友！

作者: 831226 时间: 2012-9-28 11:59

有哪位朋友现在在做肝脏细胞的原代培养，或是曾经有做过的，想和你们交个朋友，我要开始的课题中要做肝细胞的原代培养的，我是真心的想和你们交朋友，我今年读研二，学药理的！这是我的邮箱hypesnow@126.com,呵呵！

作者: newway 时间: 2012-9-28 12:00

你好
我昨天发现2瓶细胞有问题，好象是真菌污染，看到有丝样的东西，你看到过吗

作者: xue258 时间: 2012-9-28 12:01

原来有些真菌很要死的细胞碎片很象的，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现

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你好，请问你那里有没有这种污染的图片呢？我的细胞碎片很多，细胞生长不好，不知会不会有你说的这种真菌呢，我也想学习一下。谢谢。

作者: bananapeople 时间: 2012-9-28 12:01

真菌污染应该看到丝庄的东西吧

作者: 131415 时间: 2012-9-28 12:02

请教各位大侠：

培养脐静脉内皮细胞(HUVEC)用什么培养基最好呢？
要有1640培养液和DMEM培养液，选择那种要好些呢？

敬请赐教！
不胜感激！

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DMEM is more popular than RPMI 1640 and better to use high glucose DMEM plus 10% FBS.

作者: 131415 时间: 2012-9-28 12:02

各位养细胞的大侠：
有没有养星形胶质细胞的呀？我现在养细胞养的真是郁闷，老是有成纤维细胞的污染，而且用摇床纯化时细胞也大都死伤好多，所剩无几。有没有大侠指导一下，
1.是不是摇床振荡的时间和速度上不合适？文献上写的是250rpm，14－16小时，而我只用了180rpm，10小时，细胞已经惨不忍睹了。
2.不知道上述的速度和时间是用于水浴摇床还是空气振荡摇床？
3.请教怎样去除成纤维细胞的污染!

我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需要注意两方面：1，取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2，差速贴壁法，可以将细胞先差速贴壁20~30分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可，你不妨试试！祝你实验顺利！

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What is the source of your astrocyte culture, human or rat? If you are using rat, try neonate day 2 brain as the source. I have been using day 2 brain astrocyte for a while and never have the problem.

作者: 33号 时间: 2012-9-28 12:03

求助各位大侠，我养的大鼠脑微血管内皮细胞，取材取过三次了，但均以失败告终。每次取材之后观察，可以看到微血管段的，然后放入孵箱后一个半小时，使内皮细胞贴壁，一个半小时后吸走上层一半液体，加入新鲜的配液，再静置2天。但是当我拿出来观察时，就发现全是些细胞的残骸，很多，没有一个细胞是好的，先前的微血管段也不见了。我先是调整我的操作尽量轻柔的取材，匀浆，过滤，然后又听说要改用100g以下的老鼠，我也改了，培养液等全是这次新配的，也在孵箱里放置了一个星期，没有混浊，我不知道到底问题是出在哪里了呢？在这里看到有的大侠说，胶管不能用火烤，会产生有害物质损害细胞，我有的时候会用火烤一下的，不知是不是这样造成的影响呢？恳请大家多给我些意见和帮助，非常感谢！

作者: greenbee 时间: 2012-9-28 12:04

刚开始养细胞，结果传代时胰酶消化时间过长，引起细胞全部夭折死亡，请各位告诉一下，胰酶消化应多长时间？细胞变圆，间隙变大，我总是看不明显，因此导致细胞死亡，痛苦啊！冻存细胞只剩下一管了，暂时也不敢复苏了。还有作MTT时我加的药物（提纯的蛇毒）用不用处理一下，以防止细胞污染，请各位指点！多谢了！

作者: vvmmoy 时间: 2012-9-28 12:04

你说的丝状物应该是的，一般真菌生长的很慢，也不会看到培养液变色的（不象细菌），开始的时候就象我说的那样子，慢慢的会长出很细的黑色丝状物，不是很多根的，我昨天就看到了，在珊瑚状的碎片边长发出很细的丝状物，夏天天气热，真菌很容易生长的，就是很少量的真菌，通过换液以及加抗生素是很难除掉的。

作者: vvmmoy 时间: 2012-9-28 12:05

建议你最好在胰酶中加0.02%的EDTA，可以增大酶的活性，其实加入的酶量没有一定的限定，覆盖满瓶底，放至温箱五分钟，在显微镜下看到细胞变圆就可以终止消化，离心收集细胞了。

作者: memory 时间: 2012-9-28 12:06

大家好:我刚刚开始培养细胞，请问没有培养的细胞如何保存？

作者: 66+77 时间: 2012-9-28 12:06

培养脐静脉内皮细胞(HUVEC),我建议你用
1640培养液

作者: ALALA 时间: 2012-9-28 12:07

肉眼看，培养皿里的培养基是否清澈？如果是细菌污染培养基往往会变浑浊。这些团块有否影响你的细胞生长？我很早以前培养细胞时也曾遇到此类情况，一直查不到原因，恰好今天听了一个报告，其间讲到了纳米细菌，这是有人在培养哺乳动物细胞时发现的（不过现在好象还没有确实存在纳米细菌的定论），多是由培养基中的牛血清带来的（据说80%的牛血清中存在纳米细菌），由于纳米细菌具有矿化作用，会形成白色沉淀。那你遇到的这些白色物质和我的培养基中的白色片状物是否就是纳米细菌的产物呢？由于很久不培养细胞了，今天没有继续向那位教授请教。
一般都是用0.22um的滤膜过滤培养基。关于培养基的无菌状况，你可以只取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度培养一段时间后观察。

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非常感谢您的详细回答。又学到一点东西，谢谢。
肉眼看培养基还算是清澈的，只是在对着灯光仔细的看时才隐约会发现一些小的絮状物漂浮，我也同时请教了其他经常做的人，他们说这个培养液是清的，而那些小的絮状物是血清里面买来就有的，他们一直都这么用，影响不大。那些白色细砂状的物质，他们看了后说可能是细胞的碎片，细胞残骸，可能由于是原代培养，所以杂质比较多的原因而影响细胞的生长了。我也不清楚了，反正最近又做过两次原代培养，所有的液体都是重新配过的，也做了培养基的无菌实验，到目前两个多星期了都没有混浊。而这两次的取材后，也是有很多白色的杂质，换液后就基本没有了，最后终于见到有细胞长了，很开心呢。剩下的唯有小心呵护它们，继续努力啦。

作者: 2541 时间: 2012-9-28 12:08

我要培养关节软骨细胞,能给我提些建议,以及告诉我些这方面的研究的热门方向和用途?

作者: gogo 时间: 2012-9-28 12:08

传代时胰酶消化时间一般要在显微镜下观察，胰酶消化后细胞的伪足会消失，细胞变圆，间隙变大，而且肉眼也能看到有膜状物脱落，应该能看得到的．胰酶消化时间要根据胰酶的活性及细胞的类型来决定，你可以把胰酶的量加多一点，减少胰酶的消化时间．

作者: 33号 时间: 2012-9-28 12:08

能不能麻烦你发份,淋巴细胞培养的资料.及MTT实验方法,我刚接触,难!谢谢.

作者: 园丁## 时间: 2012-9-28 12:11

给大家推荐一篇文章，看是否能对大家有用。
《Culture of Epithelial Cells, Second Edition. Edited by R. Ian Freshney and Mary G. Freshney》

[ 本帖最后由园丁## 于 2012-9-28 12:12 编辑 ]

作者: Ao7 时间: 2012-9-28 12:12

成骨细胞如何鉴定应该用什么试剂盒
多谢指点！

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-9-28 12:13

各位养细胞的大侠：
有没有养星形胶质细胞的呀？我现在养细胞养的真是郁闷，老是有成纤维细胞的污染，而且用摇床纯化时细胞也大都死伤好多，所剩无几。有没有大侠指导一下，
1.是不是摇床振荡的时间和速度上不合适？文献上写的是250rpm，14－16小时，而我只用了180rpm，10小时，细胞已经惨不忍睹了。
2.不知道上述的速度和时间是用于水浴摇床还是空气振荡摇床？
3.请教怎样去除成纤维细胞的污染!

作者: 969 时间: 2012-9-28 12:13

我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需要注意两方面：1，取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2，差速贴壁法，可以将细胞先差速贴壁20~30分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可，你不妨试试！祝你实验顺利！

作者: 987789 时间: 2012-9-28 12:14

What is the source of your astrocyte culture, human or rat? If you are using rat, try neonate day 2 brain as the source. I have been using day 2 brain astrocyte for a while and never have the problem

星形胶质细胞应该是生命力较强的。我们试过空气振荡摇床180rpm－200rpm18-22小时，细胞状态还是很好的，你在摇前要刚从培养箱取出就把盖拧紧，摇床温度要保持37度（36度好象问题也不大），还有可能和你的细胞培养的时间有关。不可太早，也不要培养太久。

作者: c86v 时间: 2012-9-28 12:14

有哪位同道培养过“原代”成骨细胞？能否介绍些您的经验？如取材、所用的培养基，最好给介绍些具体的成功步骤。
谢谢！！

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经验谈不到，刚刚开始。
大鼠胫骨内侧骨膜取材
培养基用DMEM，加NAHCO3 3700mg,HEPES 4500mg,加小牛血清最后配成浓度为15%的血清
高兄知道成骨细胞的检测方式吗用何试剂盒望不令赐教

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-28 12:15

参加过细胞培养，感觉培养瓶一定要干净。所以如果您用的不是一次性培养瓶（板），请您在洗瓶子时一定不要有任何侥幸。

作者: wood533 时间: 2012-9-28 12:15

我觉得养这种细胞有几个关健步骤：
1，注意无菌操作，
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁
赞同,但不赞同完全长满再传代.

作者: TAT 时间: 2012-9-28 12:16

看了本贴，学到不少东西，大家主要就是围绕培养基、血清等细胞培养条件在讨论。在此也谈一下拙见，供参考：

1.细胞：无论你是培养那种细胞，来源很重要，一般自己花钱从ATCC买来的就不用说了。若是别人“惠赠”，一定要请别人惠赠代数早一些的，状态好一些的，有些细胞拿来时状态就很差，还有小黑点，不是迫不得已最好别用了。若细胞是自己取材，千万注意无菌操作，取出的细胞可以用含高浓度抗生素的培养基洗一下，再换用实际所需的培养基培养。
2.培养基：DMEM主要用于贴壁细胞培养，1640一般用于悬浮细胞培养。对常规细胞我们实验室一直按照这个原则，除非有特殊要求。但是有时候将DMEM和1640各50%或按照一定比例混合，也可以达到很好的培养效果，原因是两种培养基中的成分会互补，对一些细胞会有帮助，尤其是刚复苏出来状态很差的细胞。
3.血清：若细胞珍贵，实验经费较足，一定使用进口，我们的经验是Gibico和hyclone的很好，对血清非常敏感的细胞我们首选Gibco。进口血清除非作细胞因子等免疫学检测，无需进行灭活。非重要细胞（预实验）或一次性实验细胞，可以考虑用国产血清，但国产血清由于太脏，建议灭活后使用，56度，30分钟，中间注意间断地混匀培养基，防止有效成分被持续高温破坏，使用前最好还是做一下无菌实验。使用国产血清，抗生素量可适当加倍。血清一般分装于-20度冻存，用多少拿多少，最好是4度缓慢融化，所以你要提前一天做好准备。
4.胰酶：贴壁细胞培养一般需要胰酶消化，对某些半贴壁细胞，虽然protocol不建议用胰酶消化，但若是贴壁较牢，你硬是要用滴管吹，反而会对细胞早成更大的伤害。我们用的胰酶是用1640培养基配置的，浓度为0.5%，使用效果不错。关于消化的度的问题，是一个经验来的，说是看到细胞变圆，大部开始脱落就可以终止了，但我觉得还是根据特定细胞来定。注意细胞消化千万不能过，以前养293细胞，消化过了会产生纤维状的的丝，部分细胞聚在一起很难打散。胰酶消化前，细胞最好用PBS或Hank's液（我没用过）稍微洗涤一下就好了，这样很容易消化。如果偷懒，不洗也行，但消化较慢，因为残留的血清成分会有一些中和。
5.细胞活力和增殖试验，现在大家常用的是MTT法，很经典。但是现在有更简单好用的方法，使用alamarBlue! 具体方法大家可以自己查，我知道深圳雅为生物开发公司有改产品，其他代理我不太清楚。该法的优点是染色后的细胞可以继续进行培养或作其他实验，只需在检测完更换一下培养基就好了。但可能实际较贵，25ml价格约1400元，一般使用量96孔板，20ul/孔。

希望以上几点能给大家有些帮助，不对的地方还请指正。

作者: 社会主义好 时间: 2012-9-28 12:16

那位老师培养过NCI-H69小细胞肺癌细胞株？培养基中必须含有HEPES吗？对此中悬浮细胞，该如何判断其处于对数生长期呢？

作者: zzzz 时间: 2012-9-28 12:17

请教各位：培养pc12细胞可不可以用EDTA?
Thanks anyway.

作者: orangecake 时间: 2012-9-28 12:17

胶塞的清洗：我有一个养过好久细胞的老师教我，先用洗洁精反复的搓洗（一定不要用洗衣粉，因为洗衣粉是碱性的），再用清水冲干净，再用去离子水冲净后，用去离子水煮胶塞也可以是细胞瓶塞10分钟，后就可以烘干包装灭菌了（一定要注意的是，装瓶塞煮的容器不要是金属的，因为会把胶塞煮坏）我每次都用干净的玻璃烧杯煮，真的很好的，是很好的一种办法。
给大家建议一个很好的办法，就是每次用完的和养细胞有关的玻璃器皿还有塞子，不要立刻就洗，可以在0.3%的新洁尔灭中泡着，等多一点了一起洗，还有洗这些的时候用洗洁精，不要用碱性的，因为常把玻璃瓶用碱泡和刷，长期会把瓶子刮花。
养细胞还不是很久，就只有这些体会，希望拿出来和大家一起分享！

作者: 49888 时间: 2012-9-28 12:17

在培养细胞的过程中一直对培养板该如何消毒感到很困惑。我先用洗衣粉泡过夜然后用清水冲洗干净，后用蒸馏水冲3遍，干燥后在紫外灯下照射1－2小时。但每次接种细胞后污染的几率就非常大，我不知道是不是消毒不严格造成的。另外，放入培养箱时边缘需不需要用胶布粘上？在拿取的过程中有时有会碰到板子的边缘是不是也增加了污染的机会？该如何避免？

作者: feima+ 时间: 2012-9-28 12:18

各位战友，我的WI-38（人胚肺成纤维细胞）刚开始疯长，现在不长了，但培养的条件没变啊，成纤维细胞应该好长的，会是啥原因，想请教。我只用0.5%胰酶和0.02%EDTA消化了两次，现在不敢消化了，只吹打，但还是不行。SOS！

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-9-28 12:18

向您请教：
我刚开始培养细胞，但发现放进实验室冰箱或培养箱的培养基过一段时间就逐渐变碱了，为什么？我一直想不明白。谢谢！！

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-9-28 12:19

还有一个问题：用相差显微镜怎样观察细胞? 我怎么总是看不到象书上说的那样呢？请指教。

作者: 兔唇 时间: 2012-9-28 12:19

我最近也在肝HSC 细胞的分离与培养，分离的都很好，但细胞的成活率不高，有哪位高手请指教！

作者: 兔唇 时间: 2012-9-28 12:20

在培养细胞的过程中一直对培养板该如何消毒感到很困惑。我先用洗衣粉泡过夜然后用清水冲洗干净，后用蒸馏水冲3遍，干燥后在紫外灯下照射1－2小时。但每次接种细胞后污染的几率就非常大，我不知道是不是消毒不严格造成的。另外，放入培养箱时边缘需不需要用胶布粘上？在拿取的过程中有时有会碰到板子的边缘是不是也增加了污染的机会？该如何避免？

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培养板可用浓酸浸泡过夜，再清洗，干燥，紫外线灭菌。紫外线灭菌时要打开盖子，放入培养箱时我个人认为无须用胶布粘边缘，在拿取的过程中只要不碰到板子的里面应该不会污染，我建议你找找其他原因。

作者: wsll 时间: 2012-9-28 12:20

请问有那位高手作过鸡的输卵管上皮细胞培养啊，我用胶原酶和胰蛋白酶消化1h结果没有消化出来细胞，不知道是怎么回事，还有用那种培养基好啊，我用的DMEMF12？

作者: 101010 时间: 2012-9-28 12:21

我的培养液用了15mM Hepes,3.4g/l NaHCO3,DMEM,结果配出来的培养液很奇怪,加血清后还可以,pH7.1左右,可是在CO2里放一段时间后变碱了,7.6左右,不知什么原因,怎么解决?原来从来没有出现这种情况!

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我也遇到这个问题了，不过我用的是1640。不知你的这个问题找到原因了吗？
请学长指点迷津！

作者: ha111 时间: 2012-9-28 12:21

我也养了一年的293细胞，其实这种细胞生长能力比较旺盛的，但是有一点不好，特别容易脱落，当长到2/3满的时候就一定要传代了，否则可能再长就非常容易脱落下来，而且用FBS洗的时候要小心，可能轻轻晃动细胞就脱落下来，吸的时候就吸走了，而且用胰酶处理的时候我的经验是只加正常的1/2的量，由于它非常容易脱落，在常温下放几分钟，再轻轻晃动，细胞就可以处理下来了。

作者: superboy 时间: 2012-9-28 12:22

很有可能是所谓的黑胶虫，我也遇到过
对于这个问题，我的经验如下：
1。细胞传代时候一定要保证有一定的密度，这样细胞生长比较快，可以抑制它的生长
2。对于贴壁细胞，在传代之前，就是加胰酶之前可以先用原来瓶里的培养液轻轻滴打细胞表面，这样可以去掉细胞间和细胞表面的黑点，然后再正常传代
3。还可以用500转的速度低速离心5分钟，倒掉上清，换用新的培养液吹起细胞，装瓶
还有就是要好好照顾细胞，我觉得酸性条件下细胞里容易出现这个东西，所以细胞一定要及时换液或传代，千万不能偷懒，会影响细胞状态的

作者: superboy 时间: 2012-9-28 12:23

在培养细胞的过程中一直对培养板该如何消毒感到很困惑。我先用洗衣粉泡过夜然后用清水冲洗干净，后用蒸馏水冲3遍，干燥后在紫外灯下照射1－2小时。但每次接种细胞后污染的几率就非常大，我不知道是不是消毒不严格造成的。另外，放入培养箱时边缘需不需要用胶布粘上？在拿取的过程中有时有会碰到板子的边缘是不是也增加了污染的机会？该如何避免？

照射之前可以用70％酒精浸泡，时间长短不太要紧，但是照射时候要开着风机，以帮助吹干酒精和水份，配酒精的水要用高纯水，我一直这样用，没有污染过；更应该注意的是操作过程中的注意事项：比如消毒要严格，培养板应放的比较靠里，手和衣袖尽量不要在板子上面过来过去；无需贴胶布，碰到板子的边缘没什么关系，但是拿的时候一定要拿稳拿到培养板的下半边，以免不小心揭开盖子就掉大了；要尽量平着拿，以免培养液晃出来到盖上也不好，拿进超净台之前用新洁而灭擦拭外表面

作者: tangxin_80 时间: 2012-9-28 12:24

我急需视网膜静脉内皮细胞，谁有它细胞株，人和动物的都行！原代有的养么，怎么养阿？

我想知道RF 6/A和它有什么区别阿？望指点，
多谢.....

作者: 穿越时空 时间: 2012-9-28 12:24

各位,请教一个问题:
我们养的vero cells这些天很容易污染.想来想去,却不能明白为森么,可以讨论吗?
谢谢!!

作者: dongdongqiang 时间: 2012-9-28 12:25

我是新手,这两天老板要我试着做个MTT法细胞增殖测定,可我查的资料中的方法有些出入,很是不解,能给点建议吗,万分感谢!

作者: 生物迷 时间: 2012-9-28 12:25

我是新手,这两天老板要我试着做个MTT法细胞增殖测定,可我查的资料中的方法有些出入,很是不解,能给点建议吗,万分感谢!

作者: windy+++ 时间: 2012-9-28 12:26

我养的THP-1细胞,总是长一段时间以后,细胞状态就不好了,很多贴壁的,不知道是什么原因?

作者: eric930 时间: 2012-9-28 12:27

我要培养Nasopharyngeal carcinoma(NPC) cell line中的CNE2,想知道其倍增时间及其各期（G1，S，G2，M）的时间，谢谢。

作者: skytree 时间: 2012-9-28 12:27

请问哪位高手养过急性白血病原代细胞?有啥技术要点?快要做实验了,现在对于细胞培养还是菜鸟一个!!!

作者: mickeylin 时间: 2012-9-28 12:28

没想到在这里可以看到细胞培养的信息
不过好像国内的细胞培养跟国外的不一样
我现在在澳洲读硕士
目前在培养软骨细胞
培养液是
DMEM/F-12 399ml
20%FBS or FCS 100ml
0.5ml Gentamicin
0.5ml L-ascorbic

好像也没那么难，要泡醋之类的，不知道泡醋是干什么用的？？

作者: nn255 时间: 2012-9-28 12:28

你好：
鸡MTT步骤：
1．  无菌采取鸡1ml血迅速加入含0.05ml肝素抗凝剂的试管。
2．  于灭菌的试管中加入2ml淋巴细胞分离液，用吸管吸取试管中1ml肝素抗凝血小心叠加于淋巴细胞分离液上（勿破坏液面，淋巴细胞分离液应在使用前恢复到室温）。
3．  2000rpm水平离心10min。
4．  收集液体层与淋巴细胞分离液层之间的淋巴细胞层（呈白膜状），加入1mlRPMI1640混匀，1000rpm水平离心10min。
5．  弃上清，沉淀用RPMI1640如上法洗涤两次。
6．  细胞沉淀用1mlRPMI1640悬浮，在细胞板上计数后调整细胞浓度为3X106个细胞/ml。
7．  将调整好的淋巴细胞液接种96孔细胞培养板，每孔加入100ul，每个样品做3个重复，每板以RPMI1640为空白对照（设3个重复）。
8．  然后向每孔中加入10ulConA(工作浓度10ug/ml)将细胞培养板置37℃ 5％CO2培养66h。
9．  每孔中加入MTT50ul（1mg/ml），继续培养4h。
10．  向每孔加入100ul 10%SDS-0.04N HCI 培养2h。
11．  在酶标仪上测OD570。

作者: whitesheep 时间: 2012-9-28 12:29

回：
我做过冻存细胞：直接放入-20℃冰箱3小时，后再移入-80℃冰箱过夜，第二天直接放入液氮中，复苏后，细胞生长很好。只是注意冻存时，最好冻半管。

作者: whitesheep 时间: 2012-9-28 12:29

哪位朋友也在培养DC细胞？最近不知什么原因，根本没有单核细胞分化成DC细胞，几乎全军覆没？！能不能交流一下经验。谢谢！

作者: S6044 时间: 2012-9-28 12:30

有没有培养大鼠海马神经元的同学呀？能告诉我一些相关的知识么？谢谢

作者: ALALA 时间: 2012-9-28 12:59

细胞传代时，用胰酶消化,细胞变化不大,还是贴壁,请问为什么,怎样处理?

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注意胰酶作用温度；消化后，直接把培养瓶在火上过一下，或者放在培养箱内，5分钟左右，一般可以了加快速度了

作者: ending 时间: 2012-9-28 13:00

我急需视网膜静脉内皮细胞，谁有它细胞株，人和动物的都行！原代有的养么，怎么养阿？

我想知道RF 6/A和它有什么区别阿？望指点，
多谢.....

作者: ALALA 时间: 2012-9-28 13:01

胰酶我们买的是现成配置好的液体，一般情况下胰酶用的是HANKS配置，不过为什么不直接买现成的呢？我们实验室一直是这样用的，100ml才40元人民币，这样用起来很方便啊！

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请问你们单位买哪个厂家的阿，我老是联系不到，谢谢告知

作者: ALALA 时间: 2012-9-28 13:02

注意胰酶作用温度；消化后，直接把培养瓶在火上过一下，或者放在培养箱内，5分钟左右，一般可以了加快速度了

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这里所说的胰酶应该是trysin吧？
如果是的话，注意trysin在37度不可以存放太久
太久的话活性容易降低

作者: milkdog 时间: 2012-9-28 13:02

谁能告诉我MDCK细胞用什么消化页消化比较好,成分是什么?谢谢!

作者: fsdd817 时间: 2012-9-28 13:03

我养的是前列腺癌细胞PC3，最近有些问题：一段时间后细胞开始体积变大，最后全部裂解，死亡！不知道是什么原因，我使用的还是Gibico血清，之前一个多月长得都挺好得。谢谢！

作者: 911 时间: 2012-9-28 13:04

293细胞的难养在于它的不易贴壁，贴了也非常的不牢，如果有血清饥饿或者其他的处理就更容易漂浮起来。它用常规的方法培养也能正常生长，一般用DMEM，用1640也没有问题，但注意培养液的PH值不能太高，否则不易贴壁，一定要松口培养。进口的血清比较好，国产的血清也还可以，但要过滤。0.2微米的滤膜过滤后效果比较好，不然血清太脏了。但DMEM不太好滤，1640还好。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-28 13:04

看到大家这么热情的讨论细胞培养，我把要给我们实验室需养细胞的同学的一份讲稿放上来以供各位战友参考。

浅谈细胞培养技术
（一）细胞培养的基本概念
细胞培养是指摹拟体内生理环境，在无菌、适当的温度和一定的营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法，培养物是单个细胞或细胞群。培养细胞的形态分类:
1．  贴附型这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。（1）成纤维细胞（2）上皮细胞等。
2．  悬浮型有的细胞生长时不贴附在支持物上，而呈悬浮状态生长。如某些癌细胞和血液白细胞。
培养细胞的一般形态可能受很多因素的影响而发生改变。如反复开关箱，可影响温度，使之波动，并能放出培养箱中CO2促使培养基变碱，还有支原体污染，培养基PH值改变等都可使细胞形态发生变化。掌握培养方法并非难事，更主要的是明白各种操作的基本道理，二是有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力，三是熟悉体外培养细胞的生存条件，细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识。
二．培养细胞生存环境条件和代谢
1．  无污染环境是保证培养细胞的生存条件。
2．  维持细胞的增殖生长，必须有适宜的温度。人和哺乳动物培养细胞标准温度为36.5±0.5℃偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响甚至死亡。
3. 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气、二氧化碳。CO2既是细胞代谢物，也是细胞所需成分，作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH值为7.2～7.4，偏离此范围对细胞将产生有害影响。通常用5%的CO2气使培养液维持稳定的PH值。

三．实验室设备
1．  CO2培养箱。
2．  电热干燥箱主要用于烘干和干热消毒玻璃器皿。
3．  冰箱培养液、消化液、血清和各种待培养的细胞等都要保存在4℃～-20℃。冰箱应保持清洁，禁止存放易燃、挥发和有毒物品。
4．  显微镜（倒置生物显微镜）
为了了解细胞的生长情况，经常需作显微镜观察，另外还可检查细胞是否发生污染。
5．  离心机培养细胞需要制备细胞悬液，漂洗、离心和分离细胞，一般要求1000rpm/min左右。
四．培养器皿
（一）玻璃器皿
选择透明度好，无毒、中硬质玻璃，常用的玻璃器皿有以下几种：
1.  细胞培养使用器皿量大，如玻璃系统，一般应备三套培养器皿，才能满足循环使用的要求，一套使用中，一套在进行刷洗处理，一套消贮存备用。玻璃瓶用于配制储存各种培养液、缓冲液、消化液，常用500ml若干个，250ml若干个，100ml12个，10-20ml抗生素小瓶20-30个。
2.  培养瓶（螺口）主要用于培养细胞，选用壁厚薄均匀，便于细胞贴壁生长和观察规格有25ml、50ml等需领数15个左右。
3.  培养皿用于清洗分离组织，规格一般为130cm，需领数6个。
4.  滴管刻度滴管主用于移送培养液，常用5ml/支，需领数6支。普通滴管主要用于吸细胞悬液，加NaHCO2调PH值等用，需领40根左右。上述各种吸管自清洗晾干后待消毒之前，在根端可口中需用尖镊取少许脱脂棉堵塞，松紧度要适宜，堵塞过多防碍透气，过少易脱落和不起防异物作用。
5.  离心管离心、漂洗和分离细胞，我们常用的螺口刻度离心管为10ml，需领10支。

作者: xingyi08 时间: 2012-9-28 13:05

（二）其它
1．多孔培养板有底板和盖板两部分组成，适于做单细胞克隆、生长曲线测定、药物测试等研究，分6孔、24孔、96孔几种规格。
2．小滤器用于消化液等液体处菌。微孔滤膜，规格0.22μm。
3．橡胶乳头若干，大小翻口胶塞若干。
4．酒精灯，打火机，饭盒，无齿镊，存放酒精棉球的容器。
五．清洗与消毒
（1）  浸泡新瓶使用之前先用自来水洗刷，然后用5%盐酸溶液浸泡，（中和其中碱性物质）培养后的玻璃器皿附有大量蛋白质，干涸不易刷洗，,用后要立即浸入清水中.。
（2）  .刷洗浸泡后的玻璃器皿要用洗涤液刷洗。选用软毛刷和洗洁精。
（3）  泡酸刷洗不掉的杂质，经过硫酸和重铬酸钾清洁液、强氧化作用后，可被除掉。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡。浸泡时间不应少于6小时。一般浸泡一天。
（4）  冲洗刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗。如冲洗不彻底，对细胞不利。需反复冲洗十次以上，然后用蒸馏水清洗2—3次，烤干备用。
六．常用液体的配制
（1）1640培养液 RPMI 1640干粉 10.4g HEPES 5.9g ， NaHCO3 2.1g，L–glutamlne 0.3g ，溶于800ml双蒸水中，青霉素每瓶80万单位以4ml Hanks液或培养液4ml稀释，取0.5ml，最终浓度为100单位/毫升。链霉素每瓶1ｇ5ml Hanks以Hanks液5ml稀释，取0.5ml最终浓度为100单位/毫升。加双蒸水至1000ml，抽滤、分装、-20℃保存。HEPES是一种缓冲剂,具有稳定PH值的作用，分子式C8H18N2O4S，分子量238.31，使用最终浓度为10-50mM
(2) PBS液
PBS液/1升  KCl  0.2g
  KH2PO4  0.2g
  NaH2PO4•12H2O2  3．58g
  NaCl  8.0g
KCL 0.4g
KH2PO4 0.06g
NaCl 8.0g
NaHCO3 0.35g
NaH2PO4•12H2O2 3．58g
(4)小牛血清：
通常我们习惯用杭州四季青产，使用前需经60℃120分钟灭活，或56℃30分钟灭活、分装，-20℃保存。避免反复冻融降低效价。

(5)消化液
1．  胰蛋白酶1：250（1份胰蛋白酶能分别解离125个酪蛋白，它在PH8.0，温度37℃作用能力最强，钙镁离子和蛋白质的存在会降低其活力，消化细胞时加入一些小牛血清能终止胰蛋白酶对细胞的继续作用。胰蛋白酶的配制方法如下：
1）  将D-Hanks 液用NaHCO3 调PH7.2左右。
2）  将胰蛋白酶置烧杯中加D-Hanks搅匀，调PH7.2左右，置4℃冰箱过夜,常用浓度0.25%。
3）  次日，过滤除菌，分装入瓶，冰冻保存。

2.胶原酶：
胶原酶是一种由细菌中提取的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织，上皮组织以及癌组织。上皮细胞本身对胶原有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有很好的消化作用，可以使上皮细胞于胶原成分脱离而不受伤害，此酶在钙镁离子存在的情况下仍有活性，故可用BSS和含血清的培养液配制。常用计量0.1-0.3ug/ml。
细胞培养的成败，除了需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染，常见的污染有：真菌、支原体和病毒，还有非同种的其它细胞（如……）为了防止污染，实验操作时要认真，动作准确，严格消毒，进入培养室是应穿隔离衣戴口罩、帽子。

作者: greenbee 时间: 2012-9-28 13:05

有人养过hepG2.2.15细胞吗？能给点建议吗？关于这个细胞株有没有什么书，内容详细一点的？谢了

作者: greenbee 时间: 2012-9-28 13:06

最近我们实验室养的正常肝脏细胞L-02有一个培养瓶里出现许多黑色的颗粒状物质，遍布于细胞间隙和培养基中，细胞也被其覆盖，形态看不清楚，这些黑色颗粒好像贴在瓶壁上一样，非常牢固，细胞生长状态还行，以前有一瓶细胞中也有这种情况，现在这瓶细胞还行，但是这种黑色颗粒状物质到底是什么东西一直弄不清楚，不知大家有没有遇见过这种情况，可否给我指点一下，谢谢。

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泰乐菌素处理两代，再红霉素两代，也许有用。

作者: flyxx05 时间: 2012-9-28 13:07

293细胞多久传一次代呢？
我的2天传一次，长的好快啊。
都形成象ECOLI一样的克隆了，肉眼看就是一个大白点。
各位的是这样的吗？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2012-9-28 13:08

大家对肝Ｌ０２细胞的培养有什么经验吗？我复苏了别人的细胞（普通１６４０培养基），换用ＤＭＥＭ（实验需要），死活也不长啊（开头贴壁还行），传代也没用，再用他原先的培养基就开始疯长了，郁闷啊，有没有什么办法啊．

作者: BOSS2011 时间: 2012-9-28 13:09

我在养hepG2.2.15细胞
请问需要什么建议？

作者: BOSS2011 时间: 2012-9-28 13:11

我在养hepG2.2.15细胞
请问需要什么建议？

作者: kuaizige 时间: 2012-9-28 13:11

请问T2细胞如何培养，好像也很难长呀！！！

求救！！

作者: zhezhe 时间: 2012-9-28 13:12

在用密度剃度离心法分离外周血和骨髓过程中发现：我用ＦＩＣＯＩＬ分离液，１５００转／ＭＩＮ，３０ＭＩＮ，结果分三层，但无白细胞膜层．我分析原因可能有二．１．细胞被溶解；２．ＦＩＣＯＩＬ过期失效．请各位分析一下，敬请指教．

作者: lixi559 时间: 2012-9-28 13:12

各位，谁有培养人肝癌BEL-7402、SMMC-7721细胞的经验方法？我是菜鸟，请教大家了，多谢。

作者: 白白的 时间: 2012-9-28 13:12

293细胞对生长环境的改变较为敏感，细胞容易成团，因此维持稳定的温度、酸碱度和转动速度对细胞正常均匀生长至关重要

作者: 气泡 时间: 2012-9-28 13:13

求助：主任，小弟马上要养成骨细胞和破骨细胞，希望您能提供一些相关资料，也希望有经验的大哥多多指点。邮箱jarie2000@sina.com 谢谢！！

作者: abc816 时间: 2012-9-28 13:14

那位师兄师姐培养过黑质神经元啊，请不吝赐教。

作者: junhun 时间: 2012-9-28 13:14

请教各位：我想把肠段消化作成单细胞悬液，上流式，可是总弄不好．现在的问题是消化（０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ）后总存在胶状，粘粘忽忽，分不开，涂片检查，细胞个体之间已经分开了．
　怎么将胶状物去掉呢？

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-28 13:15

各位大侠，救命！请问哪有卖：

培养基DMEM/F 12 with D-valine instead of L-valine
如有谁知道的，请告诉本人，感激不尽！！

作者: S6044 时间: 2012-9-28 13:15

对于无白细胞层的原因,我用两种方法鉴定,一种换离心液,购买了新的FICOLL,另外我把离心时间缩短至25分钟,并将减速度设为5,结果证明离心液体出了问题,质量不好.另外离心后的洗涤1000转每分,5分钟就够了.离心速度过快,沉淀过紧,吹打混匀不易,易伤害细胞.下面我遇到的问题是让贴壁细胞繁荣生长,还需验证培养液问题,真是步步困难.我们只能知难而进

作者: Ao7 时间: 2012-9-28 13:15

哪位了解宫颈上皮细胞原代培养的技术啊，请大侠出手相助！

作者: bohe221 时间: 2012-9-28 13:16

培养细胞我是新手，第一次养细胞，现在养的是293cell，遇到一些问题，请各位给些意见。1，消化细胞总是不理想，很难成单细胞，请问是什么原因？2，瓶底的细胞间隙有些黑点，高倍镜观察并不动，是怎么回事？
怎么处理？

作者: HP007 时间: 2012-9-28 13:17

请教,培养人血管内皮细胞需要注意什么哦?请多多指教啊

作者: memory 时间: 2012-9-28 13:18

请问有谁养过CNE-1细胞吗？？要注意什么？请指教指教谢谢！！

作者: 小糖块 时间: 2012-9-28 13:19

请问有谁养过CNE-1细胞吗？？要注意什么？请指教指教谢谢！！

作者: caihong 时间: 2012-9-28 13:20

请教一下，有谁养过宫颈癌细胞系？如HeLa和SiHa? 多多指教，谢谢！
有哪位朋友可以出售SiHa细胞？急需！请联系我

作者: 2541 时间: 2012-9-28 13:20

有谁养过c2c12细胞是吗？请问您知道如何破碎细胞提取线粒体吗？比较简单的方法。非常感谢，望不吝赐教！

作者: 2541 时间: 2012-9-28 13:21

各位学长有谁知道如何破碎c2c12细胞，提取蛋白吗？必须要保持线粒体的完整性。多谢！急急急！！

作者: jujuba 时间: 2012-9-28 13:21

养基中虽然含有谷氨酰胺，但是由于其很容易降解，所以需要加入。

作者: yes4 时间: 2012-9-28 13:22

看到你说起你养过血管平滑肌细胞，我下个周就要开始养这种细胞了，听说不太好养，你能否介绍点经验给我呢？多谢了！

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-28 13:22

我养的是caco-2细胞，拿回来时时在冻存管里的，复苏以后，镜检细胞量很多，但是细胞贴壁效果不理想，复苏后第二天换液时很多都掉到培养液里，我再拿去离心，另加培养液养到别的瓶子里。现用的是MEM，10%胎牛血清，1%双抗，1%LG，请问有办法让其增加细胞量和改善贴壁效果么？谢谢：）

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-28 13:23

我想由测定乳酸脱氢酶来鉴别细胞膜的损伤程度，需要全自动生化分析仪，请问哪位高手有此方面经验，不胜感激：）另外还想打听北京哪里有此仪器可供外单位用，谢谢

作者: 二子 时间: 2012-9-28 13:23

肺泡Ⅱ型上皮细胞原代培养.有没有哪位高人养过?据说这种细胞极为难养,我是菜鸟,可否指点一二?

作者: 66+77 时间: 2012-9-28 13:23

各位前辈：
我是一名新手，在下有个问题想请教一下，我们单位要开展细胞类试验。不知在没有程序降温器和低温冰箱的情况下，在细胞冷冻时，可以通过在液氮储存器中手工控制下降速度的方法达到慢慢降温的效果吗？能否告诉我一些实际的经验。谢谢！

作者: guagua 时间: 2012-9-28 13:24

看了好几页帖子发现好多人都在养血管平滑肌细胞，不知这些先辈们养的咋样？能否赐教！不胜感谢！

作者: toy 时间: 2012-9-28 13:24

各位好：我的293细胞最近老出现一种现象，细胞培养液中可见漂的黄褐色物，聚集成团，刚开始生长缓慢，随着传代增加，细胞老化，出现颗粒状物，然后细胞就死亡。可否请各位有经验的人指点一下。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-28 13:25

求助:
哪位有新生牛血清？实验室的老师进了两批四季青的，但都有些浑浊，没敢用，可我的实验不能等啊，所以求助于大家，请有条件的帮帮忙！
多谢！

作者: ladyhuahua 时间: 2012-9-28 13:26

各位前辈：
我是一名新手，在下有个问题想请教一下，我们单位要开展细胞类试验。不知在没有程序降温器和低温冰箱的情况下，在细胞冷冻时，可以通过在液氮储存器中手工控制下降速度的方法达到慢慢降温的效果吗？能否告诉我一些实际的经验。谢谢！

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可以的，我们有时候就是用一绳子绑住细胞冻存管，在液氮储存器口外一段时间（15分钟左右），然后慢慢下降冻存管，直到完全进入液氮中，整个过程大概40分钟左右。冻存效果还不错，不过最好是从4到负20再到负70度的来冻存。

作者: hold住 时间: 2012-9-28 13:27

我用培养瓶养细胞还比较顺利，怎么一到培养板里就经常出现大批死亡的现象呢，还有，我们实验室用的是中强酸，板子只泡2个小时，有没有问题

作者: jrwyyplt 时间: 2012-9-28 13:28

本人做了脾细胞培养半年，都没有做出来，目的是提总RNA，每次脾细胞培养时在脾细胞悬液中加ConA 终浓度为5ug/ml 后发现细胞总是凝集成团，细胞死亡，细胞活化低，没有目的基因表达，请各位大师救命。

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-9-28 13:28

大家好，我准备养神经细胞，因为是初学者，所以对一些简单的问题也有些不知所措：请问如果我用神经细胞做缺血缺氧实验，应该选择什么样的多大的动物取神经细胞，并且应用什么样的培养液比较合适。外分感谢！

作者: join 时间: 2012-9-28 13:29

大家好，我准备养神经细胞，因为是初学者，所以对一些简单的问题也有些不知所措：请问如果我用神经细胞做缺血缺氧实验，应该选择什么样的多大的动物取神经细胞，并且应用什么样的培养液比较合适。外分感谢！

应该选胎鼠或新生1－3天的鼠，根据经费情况可以用GIBACO的高糖DMEM培养基加10%牛血清、10%马血清，或直接用GIBACO的无血清培养基

作者: tangxin_80 时间: 2012-9-28 13:29

鼠尾胶原如何灭菌？

作者: kulee 时间: 2012-9-28 13:29

我觉得各位兄弟说得都没击中要害，我养过293疯了一样长。293是病毒转化的人胚肾细胞，给人的感觉是比较接近正常细胞。比较脆弱，只要注意胰酶消化时不要过，对细胞损伤太大即可。即加入0.25%的胰酶后轻微摇晃，见有膜一样的东西脱落下来，即加入血清吹大即可。

作者: kulee 时间: 2012-9-28 13:30

是不是污染了？在相差显微镜下能看到菌丝否

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各位好：我的293细胞最近老出现一种现象，细胞培养液中可见漂的黄褐色物，聚集成团，刚开始生长缓慢，随着传代增加，细胞老化，出现颗粒状物，然后细胞就死亡。可否请各位有经验的人指点一下。

作者: kulee 时间: 2012-9-28 13:30

我以前也想用过这种培养基，好像sigma就有不过好像是没有L-valine 的培养基，并有单独的D-valine 卖
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各位大侠，救命！请问哪有卖：

培养基DMEM/F 12 with D-valine instead of L-valine
如有谁知道的，请告诉本人，感激不尽！！

作者: misswu61 时间: 2012-9-28 13:31

各位师兄师姐，请问做神经元培养时，分离了海马神经细胞之后，要接种于预先经多聚赖氨酸处理过的底物上，它的具体处理过程是什么？是用培养瓶还是培养皿或者培养板？我以后要进行细胞的缺氧处理，检测细胞的形态学改变和其中的蛋白含量。急需指导！十分感谢！

作者: junjie05 时间: 2012-9-28 13:31

各位前辈有没有养成骨骼肌卫星细胞的啊？怎么就看到求助，没有多少人有回复啊？希望能和大家多讨论，我也要养它。

作者: hold住 时间: 2012-9-28 13:31

请问哪位养过LNCAP细胞,请谈谈经验好吗?

作者: hold住 时间: 2012-9-28 13:32

难道DMEM和Hyclone是同一种东西吗

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-9-28 13:33

请教一下，你说的一次性培养皿具体怎样处理，怎样消毒，好象高压湿热消毒不行。很想能得到您的指教。
先谢了。
在有一个问题：我现在在做大鼠气管上皮细胞的原代培养。原代培养的很好，但是再传代时，细胞的生长状态很差。传代时，我没用胶原包被培养6孔板。不知道有那位朋友做过。原代培养的气管上皮细胞能不能传代，传代时一定要用胶原包被吗？

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我做过血管内皮培养，非常娇弱，个人经验是一般原代培养的细胞不要传代再用，这是细胞本身的性质决定，不是外界条件可以控制的。不知有用否？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-9-28 13:33

请问哪位养过MDCK,能否告知其具体的消化方法,谢谢.

作者: 831226 时间: 2012-9-28 13:33

关于细胞的冷冻，按以下顺序：4度30min，-20度2-3h，-70度过夜，然后可以放到液氮里了。

作者: BUK 时间: 2012-9-28 13:34

有谁养过心肌微血管内皮细胞，请不吝赐教。都要用那些东西，以及注意事项？不胜感激！

作者: 101010 时间: 2012-9-28 13:34

我刚开始养牙周膜细胞，现在有点茫然，不知哪位高手可以指点一下。还有，得到的细胞怎样可算干细胞。
另外，我的原代细胞复苏了三瓶，可是都没活，不知是怎么回事啊？

作者: DDD 时间: 2012-9-28 13:35

我要做原代细胞转染，请问哪位大虾有好的建议阿，甚急，多帮忙阿。

作者: 四福晋 时间: 2012-9-28 13:35

各位师兄师姐：
请问在缺氧条件下，如何造成神经细胞凋亡而不是坏死？十分感谢！

作者: baidukk 时间: 2012-9-28 13:36

请问哪位老兄有Ficoll-400调配浓度及使用的经验和淋巴细胞分离液使用经验。说来与小弟分享，本人将不胜感激！

作者: 04906 时间: 2012-9-28 13:37

我将要养肿瘤的血管内皮细胞，不知可有做相同工作的，相互交流经验以供学习。
另外，谁知道用percoll分离，内皮细胞的密度是多少？如何配制？谢谢了！

作者: plaa 时间: 2012-9-28 13:38

有关293T细胞：
我养的经验就是，没有传说中那么娇贵难养。细胞刚刚从国外带回来复苏的时候，的确是成团生长，难得分散贴壁。但用传代时只消用0.05％的胰酶（无须EDTA）消化1min左右，再加入培基吹散，然后按1：2或者1：3的比例传代，之后都可以长得不错，贴壁也蛮牢，很少漂浮起来。
有关黑胶虫：
可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，在显微镜下呈小黑点状的细菌。虽然容易生长，但是细胞如果长得好的话，该细菌就会被抑制，直到消失，所以建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。个人经验，仅供大家参考。

作者: #问号# 时间: 2012-9-28 13:38

各位前辈，我做乳鼠神经元的原代培养不久，前几次是做皮层，细胞种在培养瓶内，都长得挺好。这两次，我做的是基底前脑，细胞接种在96孔板里，结果细胞几乎全死了，前后所用的培养基等条件都没有变，请各位前辈指点一下到底是什么原因导致的，在这先谢谢您了！

作者: 969 时间: 2012-9-28 13:39

我对细胞培养现在可以说是一点都不懂，但还是对养细胞很感兴趣的，我在这里想请大家帮一个忙，就是：那一位朋友能不能提供培养鼠神经干细胞的详细步骤。谢谢！

作者: bongte 时间: 2012-9-28 13:39

请教各位给我指点几招,我培养的是NB4细胞株,但不知为什么总是过一二天就会出现培养液变混浊的现象.但不是细菌污染.镜下可以发现视野里是很细的一层东西,还形容不好,考虑是不是支原体感染,但细胞还在生长.没有死亡.有什么简单的方法来验证吗.我也用液体洗过,但没有效果.有什么好的办法能去除吗,如果是支原体,如何处理呢.是不是必须扔掉.
另外这种细胞是悬浮生长,每次换液只能离心换液吗,有没有比较方便快捷的办法.

作者: sunnyB 时间: 2012-9-28 13:39

lidm,许多培养基中确实已经加了谷氨酰胺(也有不加的,需在配制时加入),但谷氨酰胺在水溶液中容易分解,4度储存两周左右其有效浓度即达不到实验要求,必须重新加入.一般使用终浓度2mM的谷氨酰胺．配制时先配成１００倍储存液存－２０度，使用时每１００mＬ培养液中加入１mL就够了．

　　１００倍储存液的配制：称取谷氨酰胺１.４６０克，用少量ＰＢＳ溶解，最后用ＰＢＳ定容至５０mL,除菌过滤，无菌分装，１mL／支，－２０度储存备用．使用时每１００mL培养液中加入一支，很是方便．

作者: sunnyB 时间: 2012-9-28 13:40

请问有培养脐血细胞的吗?我培养了很长时间但是效果不佳,请高手指点.

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你的问题太过笼统．脐血中有许多种细胞，你要培养哪一种？淋巴细胞？造血干细胞？间充质干细胞？血管内皮细胞？每种细胞的培养方法都不一样．我做过造血干细胞和间充质细胞的培养多年，可以和你分享经验．

作者: sunnyB 时间: 2012-9-28 13:40

请问各位大虾：若1640中含酚红是否对某物质在1640中的吸光度有影响？

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当然有影响．一般要求将培养液去除后再加显色剂，测定吸光度．不过影响的大小却要看你的具体实验目的．对于贴壁生长的细胞，直接吸去含酚红的培养液，再用ＰＢＳ洗一洗就可以了，而悬浮生长的细胞就要先用可以离心培养板的离心机离心沉淀细胞后再去除含酚红的培养液．有些时候也可以直接显色后进行吸光度测定的．因为你有实验对照组，对实验结果不会有特别大的影响

作者: ha111 时间: 2012-9-28 13:40

请教各位，我新配制过滤的DMEM培养基，培养2-3天后发现有圆圆的立体形态的东西，不知道是什么；好像是贴壁的，破裂后有内容物溢出，挺象细胞破裂时的内容物，请问是什么东西？
另外，我的血清是国产的，不过说是和hyclone合作什么的，自己灭活过。培养的AD293细胞长的好慢，4天还没贴满，好多悬浮，贴壁细胞之间还有死细胞形态的东西，但是是贴壁的，我想不会是死细胞，应该是什么污染吧。我刚刚开始养，上述情况很严重，细胞看起来好脏，可否指点一下，多谢

作者: ha111 时间: 2012-9-28 13:41

再请教一下：我养的AD293细胞长的太慢，两天还没贴壁，培养基也没变黄，没舍得扔，又长了两天就贴了，不太正常，怎么让它长的快点呢？再加多点血清行么（原10％胎牛血清，国产自灭活的），谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-28 13:42

大鼠心肌细胞用哪种培养基能保持时间长一点？也更容易贴壁？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-9-28 13:42

请教大鼠心肌细胞的培养用哪种培养基比较好？

作者: Ao7 时间: 2012-9-28 13:42

坛主:
我是做间充质干细胞MSC 的细胞培养,根据国外资料:是先用高糖DMEM从骨干中冲洗出骨髓,再用低糖型DMEM来培养.血清是用小牛血清(浓度10%),但最好是用10%的胎牛血清.而不是20%的血清.
另外,文献上只是提到用1:1的EDTA和胰酶的混合物.比较好.

我有个问题:对于脂肪细胞的鉴定,除了用显微镜下观察,油红染色外.
还有没有其它的鉴定方法.

作者: zhezhe 时间: 2012-9-28 13:44

我在用密度剃度离心法分离外周血和骨髓过程中发现：我用ＦＩＣＯＩＬ分离液，１５００转／ＭＩＮ，３０ＭＩＮ，结果分三层，但无白细胞膜层．我分析原因可能有二．１．细胞被溶解；２．ＦＩＣＯＩＬ过期失效．

对于无白细胞层的原因,我用两种方法鉴定,一种换离心液,购买了新的FICOLL,另外我把离心时间缩短至25分钟,并将减速度设为5,结果证明离心液体出了问题,质量不好.另外离心后的洗涤1000转每分,5分钟就够了.离心速度过快,沉淀过紧,吹打混匀不易,易伤害细胞.下面我遇到的问题是让贴壁细胞繁荣生长,还需验证培养液问题,真是步步困难.我们只能知难而进

现在用FICOLL分离液分离骨髓及外周血的文献很多，但是各家说法不一，并且外周血和骨髓粘稠度不同，是否是同一的离心速度和时间？分离液也是一个很重要的因素，不知playingstone老师用的是什么牌子的？我现在分离骨髓，试验过多次，2000转/分，30分钟或者2500转/分，20分钟，或者将骨髓稀释一倍后再分离，但总是混有红细胞，真不知是没哪一步出了问题，请playingstone指教。

作者: 831226 时间: 2012-9-28 13:44

大家好！

有养过sf9细胞的吗？我现在需要方法，我需要用5L的培养瓶进行培养，不知是否需要给培养瓶通气体，如需通气，请告之方法，多谢！

作者: 831226 时间: 2012-9-28 13:45

大家好！

有养过sf9细胞的吗？我现在需要方法，我需要用5L的培养瓶进行培养，不知是否需要给培养瓶通气体，如需通气，请告之方法，多谢！！甚急，方便的话请发E-mail到wanglangqing@sina.com.cn，非常非常的感谢！！

作者: 铜雀 时间: 2012-9-28 13:45

海马神经元培养时，涂皿赖氨酸的残留量应该是多少？
反复利用的赖氨酸涂皿后对细胞的贴壁影响大吗？
我现在用的是重复回收利用2次的赖氨酸，可以吗？最多回收利用几次呢？

作者: lixi559 时间: 2012-9-28 13:46

对于鸭胚成纤维的接毒时间，大家给个建议

作者: qqq111 时间: 2012-9-28 13:46

请教一下有人养过角膜基质细胞吗?好养吗?大概几天?有特殊要求吗

作者: xue258 时间: 2012-9-28 13:46

各位师兄师姐：好！
我要做原代结肠成纤维细胞，可用贴壁法做了很久都没用，不知道哪位有这方面的经验，帮帮小弟我吧，谢谢！

作者: tie8 时间: 2012-9-28 13:47

请高手谈一下培养小鼠前胃癌细胞MFC的经验，教训。不胜感激！！！

作者: yhz1973 时间: 2012-9-28 13:47

急需neurology全文检索的user name 和password, 请各位老手赐教,谢谢.

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