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标题: 【求助】请教淋巴细胞的培养 [打印本页]

作者: youyou99 时间: 2012-9-29 10:13 标题: 【求助】请教淋巴细胞的培养

我们抽取外周血分离到单核细胞之后再加入一系列单抗，经藕连二抗的磁珠
分离naive and memory T CELL.
因细胞数量难以满足需要，只能再培养。按照淋巴细胞的常规培养法，加anti-CD3 and anti-CD28(浓度均为１００ng/ml),未再加APC CELL及IL-2. 在培养过程中，第一、第二天还好，细胞有增殖，但第三天后，有的细胞成团，也不知是细胞聚集还是增殖的克隆，并出现细胞破裂，第五天细胞已所剩无几。

请教高手：有什么解决办法？是不是细胞凋亡了？

作者: 我佛慈悲 时间: 2012-9-29 10:14

我室T细胞培养方法较成熟，两种方法可供参考：
1.分选得到的T细胞在培养板中培养时加入soluble anti-CD3单抗（3ug/ml）及IL-2（20U/ml），同时加入γ射线照射灭活的hpbl（对人而言）或同系小鼠脾细胞（起APC的作用）。
2.可以先用soluble anti-CD3单抗包被培养板（将用PH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的5-10ug/ml的anti-CD3单抗加入培养板于37度放置1-2小时后，丢弃液体，用PBS洗一次，即可备用），直接将T细胞加入其中，同时补加IL-2（20U/ml）
T细胞一般在2-3天活化即很明显，开始增殖旺盛，4-5天一般要分孔培养，分孔时补加IL-2（10U/ml）。7-10天细胞开始静息，需进行新一轮刺激。

作者: youyou99 时间: 2012-9-29 10:15

但我们培养的细胞因进一步实验的关系，不能加IL-2及APC，只用anti-cd3及anti-cd28联合刺激能生长吗？
还有，我也请教过很多免疫老师，他们有的说anti-cd3和anti-cd28的剂量应该是200ng/ml（细胞数量一百万），有的说是anti-cd3 5ng/200ul，anti-cd28的剂量100ng/200ul，不知silvia君？？？/
还有细胞数量少的话是不是应该用96孔板，且最好用圆底板？两天细胞数量能长多少？anti-cd3的浓度大了是不是更易导致细胞凋亡？

作者: ending 时间: 2012-9-29 10:15

１。慈悲君说的T细胞是怎样的Ｔ细胞呢？是贴壁后剩下的T细胞，还是用别的方法纯化过的？
２。第二种方法用CD-3单抗包被板子的目的是什么？与第一种方法的主要区别是什么？第二种方法我没做过，想详细问问。

作者: finger 时间: 2012-9-29 10:16

我们抽取外周血分离到单核细胞之后再加入一系列单抗，经藕连二抗的磁珠
分离naive and memory T CELL.
因细胞数量难以满足需要，只能再培养。按照淋巴细胞的常规培养法，加anti-CD3 and anti-CD28(浓度均为１００ng/ml),未再加APC CELL及IL-2. 在培养过程中，第一、第二天还好，细胞有增殖，但第三天后，有的细胞成团，也不知是细胞聚集还是增殖的克隆，并出现细胞破裂，第五天细胞已所剩无几。

请教高手：有什么解决办法？是不是细胞凋亡了？

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细胞激活后，高表达FASL和FAS，二者相互作用诱导活化细胞凋亡，这便是AICD。所以你的细胞死亡在一定程度上说是正常的。但活化T细胞必须在IL-2的存在时，才能在体外存活一定时间。本人在T细胞培养方面有不少经验，考虑到你的情况，你可用下列策略：分离到的PBMC，先不分离所需细胞，二是先经PHA或单抗（至于浓度，参考文献即可，不同实验室不同）激活，让细胞增殖，5-7天后，再磁珠分离你所需细胞。细胞激活后，因含有CD4细胞，可分泌IL-2等细胞因子，故此过程不需加入外源性IL-2。但分离后需尽快用于实验，否则，死亡。祝好运！

作者: youyou99 时间: 2012-9-29 10:17

但我们因为抗体及磁珠数量所限，不可能在细胞增殖后再分离！

作者: 一叶 时间: 2012-9-29 10:17

1.只加抗CD3和抗CD28只能活化T细胞，因为T细胞生长、分裂增殖离不开IL-2（IL-2通过与活化T细胞表面表达的IL-2R结合，促进细胞增殖），若不加IL-2应该说T细胞是没法在体外扩增的，过几天肯定会死掉。
2.细胞数量少是应该用圆底96孔板，但用圆底的不好观察细胞形态，镜下看时看孔边缘细胞。至于两天细胞能长多少，真没法说。一般T细胞在体外7-10天刺激一轮，至少能增殖一倍。两天真没什么长。就象抗原抗体反应需适当的比例一样，抗CD3在一定浓度刺激作用才最强，建议你做一个浓度梯度，摸一下条件，找出合适的浓度，我们用的一般是1-10ug/ml。

作者: 一叶 时间: 2012-9-29 10:18

1.我们用的T 细胞有用磁珠分选的也有用流式分选的，其实即使直接用混合细胞也行，因为用这种方法只能使T细胞生长增殖，刺激几轮下来，其他细胞都死掉了，只剩下T细胞。只是需时较长。
2.抗CD3包板的方法是因为借助于板上的抗CD3可以使T细胞表面CD3分子交联，直接活化T细胞，而不需借助共刺激信号

作者: DDD 时间: 2012-9-29 10:18

但我问过现在在美国免疫所的翁南平教授，他说细胞在只有抗CD3和抗CD28
存在下能生长，真不知道谁对！
　正如你说，园底板就无法在倒置显微镜下观察细胞了！

作者: lgm 时间: 2012-9-29 10:19

用CD3单抗包板子和直接加CD３单抗的主要区别何在？

作者: biabiade 时间: 2012-9-29 10:19

CD3分子是TCR识别特异抗原后传导活化信号的重要信号传导分子，由五条链（ε、δ、γ、ξ、η）组成，包被的抗CD3分子可以使T细胞表面CD3分子交连，由于受体的交连使其胞内区互相靠近，胞浆区ITAM（免疫受体酪氨酸活化基序）易于被PTK作用发生磷酸化而活化。可溶性抗CD3分子必须在APC提供共刺激信号时才能活化T细胞。

作者: 9900 时间: 2012-9-29 10:20

我的意思是游离的单抗和包被板子的单抗有效果有什么不同。

作者: woshituzhu 时间: 2012-9-29 10:20

我培养的是人外周血淋巴细胞,PHA刺激,
第二天,发现培养基中有团块状东西出现,较大,
第3天更甚,培养基是清亮的.
请问各位大侠:
这是否正常?

谢谢!

作者: dragonkilly 时间: 2012-9-29 10:21

有人曾问游离的CD3单抗和包被板子的CD3单抗有效果有什么不同。

据说，CD3单抗有剂量依赖性，细胞结合过多不但不会刺激T细胞，而且会导致细胞凋亡，游离的CD3单抗如果浓度掌握不好，容易导致由CD3抗体导致的CD3受体交连后传递抑制信号，就容易导致凋亡。所以有时用CD3刺激不了T细胞就是这个原因，尤其当用临床用的OKT3（古巴产）刺激人的T细胞时，剂量应小，我做的是游离的用20～30ng/mL。
事先包被的好处是，这样做时，细胞接触的CD3抗体有限，容易刺激细胞增殖。不过我的体会仍然事先用不同的浓度包被，寻找最佳的浓度。
以上的解释是一知半解，搞免疫的大师应当更明白，欢迎批评指正！

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