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标题: 【求助】从大鼠胸主动脉取平滑肌细胞如何操作？ [打印本页]

作者: wood533 时间: 2012-9-29 10:54 标题: 【求助】从大鼠胸主动脉取平滑肌细胞如何操作？

按贴块法操作，如何把大鼠的中膜撕下，忘做过的多指点！

作者: redbutterfly 时间: 2012-9-29 10:55

不知阁下做过兔子的平滑肌否，兔子的主动脉较大，去中膜还算简单。
大鼠的主动脉用贴块法在肉眼下有一定难度，可以试着在解剖镜下操作。先将主动脉沿纵轴剪开，去除周围结缔组织后，在解剖镜下仔细剥离，一定要剥离干净，然后就可安心等待细胞爬出来了。

作者: wood533 时间: 2012-9-29 10:56

我就是无法把握剥离干净这个度！

我救没看见有中膜外膜内膜，最多好像就是把血管剥成白色！

能否说说如何把握这个度！

万分感谢

作者: wood533 时间: 2012-9-29 10:57

还有两个问题
1.据说100ml的玻璃瓶需要6-8个大鼠的动脉脉，是否需要这么多？？

2.平滑肌细胞是否用玻璃培养瓶救行了！

作者: yychen 时间: 2012-9-29 10:57

我做大鼠主动脉平滑肌细胞培养时这样的：
1、去除外膜时是用一眼科弯镊夹住一端，另外一个镊子在动脉表面机械划拨（不知道怎么形容更贴切），再处理另外一端。
2、去除内膜，是用眼科剪纵向剪开动脉，用棉签在血管内面捻掉内皮（还是不知道怎么形容这个动作更好）。
3、至于掌握的度，不好说的，也是成为白色，在去外、内膜时尽力些，宁肯多划、多捻。
4、每次原代培养所需的大鼠，100ml培养瓶我一般用6只，少点也可以的，但是多点大鼠，原代细胞可以很快就长满瓶底的，不用等太久就能传代了。
5、我用的是玻璃培养瓶养的VSMC，如果进一步实验用于药物刺激提取RNA、蛋白，就传代到培养皿里，当然一次性进口塑料皿里细胞的确长得好些。
仅供参考，不足请指教！

作者: yychen 时间: 2012-9-29 10:58

另外，请问，你有没有养过成年大鼠的心肌细胞？我要养，好象也很难。

作者: duoduo 时间: 2012-9-29 10:58

实在是非常感谢，在下还有几个问题要请教：
1.为什么说要尽量多捻以去出除干净内膜和外膜，是否如果不清除干净会影响平滑肌细胞从组织块长出，还是会印象平滑肌细胞的纯度？
2.我在操作过程中血管可以迅速剥离成白色，但是随后的剪成1平方毫米的组织块觉得很有难度，特别滑溜，使不上劲，而且最后也不是规则的正方形小组织块。请问你操作中是否每块组织块都能达到1平方毫米这么小的要求？
3.组织块贴壁的问题：我用的是50平方毫米的培养瓶，用移液枪伸入培养瓶把揉在一起的组织块展开，烘干再翻转培养瓶。请问把组织块展开这一步是否也很重要。
4.还有就是一般要多长时间细胞会长出，我怀疑我操作中的组织块没有达到1平方毫米以下的要求，（我的最大估计有2平方毫米多），另一个存在的问题我估计是组织块没有很好的贴在瓶上，你在操作中能否达到当培养液浸泡了组织块后，组织块还是都贴在瓶壁上，在下实在不好意思，有一些漂浮起来了。

最后非常抱歉我的课题一般不需要养心肌细胞，不过过段时间要养冠脉内皮细胞，据说这个特难养，不知道你养不养的。

都说平滑肌细胞特容易养，这个是否属实？
本人组织培养2天了，今天忍不住看了看好像没见到一个细胞的影子，实在是郁闷！

作者: wood533 时间: 2012-9-29 10:59

两位都特强调剥离内膜和外膜干净，是否没有剥离干净，平滑肌细胞就很难从组织块游出来？？

作者: yychen 时间: 2012-9-29 11:00

抱歉，我疏忽了，当时我做使用的是酶消化法。现在我们实验室技术员在用贴壁法培养，我请教过她：
1、去除外膜和内膜的方法二者是一样的。我觉得不去除干净主要影响的是细胞的纯度。
2、剪动脉时是不容易剪碎，一定要用锋利的眼科剪，如果剪刀钝会加重组织的损伤，可能会影响细胞的活力。组织块的大小并不都是1平方毫米的正方形，多为不规则的，1-2平方毫米，甚至大于2平方毫米。
3、组织块贴壁：把组织块均匀的分布在培养瓶底，并展开很重要的。没有用烘干，只是将培养液甩干，翻转培养瓶加入培养液，孵箱培养2-4小时，轻轻翻转，继续培养。可能有少量组织会浮起，但是不多的。
4、细胞一般3天可以见到了，一周左右长的好的话，就可以传代了。
5、技术熟练的话，贴壁法100ml培养瓶用一只大鼠就可以，还与你取材时动脉的长短有关。摸索方法，建议你用两只大鼠/100ml培养瓶。如果你步入实验阶段，技术熟练，可以一次多用几只大鼠多养几瓶原代细胞。

抱歉，我不养冠脉内皮细胞。
平滑肌细胞是很好养的，不要太着急，慢慢来，你一定会成功的！

作者: wood533 时间: 2012-9-29 11:00

你用酶消化是否仅仅使用胶原酶2，贴块法好像从种入培养瓶到融合太慢了，我想改用酶消化，另外你当时酶消化时消化的程度如何，我见到有文献说把中膜小块消化至胶冻状，按他的消化程度是否消化过头了。详细和我说说如何把握消化的程度。谢谢了

作者: hyuu 时间: 2012-9-29 11:01

搞不好,培养出的是成纤维细胞

作者: bongte 时间: 2012-9-29 11:03

在培养细胞的过程中，贴壁法和消化法我都尝试过，我个人觉得就操作上来说，后者更方便点。
我曾使用贴壁法培养过内皮细胞，处理血管时一定要小心去除外膜，尽量剪除血管上附着的纤维和粘膜，然后用锋利的刀片（最好是新的）将血管切成1毫米大小的组织块，我觉得外膜上粘连的纤维的处理最关键，因为我在其后的培养过程中发现凡是组织块周围没有粘连物的，细胞很容易爬出来，不知道是什么原因，我也不知道在平滑肌细胞贴壁培养的过程中是否也有这种情况，仅供参考！
一般来说平滑肌细胞相对要好养点，胰酶和胶原酶我都尝试过，而且都有成功的经验，因为我是做组织工程的，在用消化法获得内皮细胞后，将无内皮细胞的血管的外膜用血管钳撕掉，剩下中膜层，用剪刀剪成很小的组织块1-2毫米，具体大小不限，但越小越好，这样后期消化容易些，然后将这些组织块放入胰酶或胶原酶中，在这过程中我觉得最关键的是，调节消化液的PH值，可以跳得稍微偏碱点，尤其是胶原酶，它的作用缓慢而持久，越到消化终末，速度越快，消化液明显偏酸，对细胞生长不利。在消化的过程中要不时地摇晃，以达到均匀消化的目的。消化的时间大约需要6个小时左右，消化液呈混浊状，仍有细小的组织块，但千万不能消化过头，不能消化到看不见组织块。消化后期你小心点就可以了。然后将这消化液离心洗洗，一古脑全倒在培养瓶中，玻璃的也行，培养48-72小时，换液你就会有惊人的发现了！
以上是个人做试验一点经验，远多多交流

作者: wood533 时间: 2012-9-29 11:03

昨天做了一次酶消化法。
用的是胶原酶2消化中膜。
消化时一直担心酶消化过头损伤细胞膜，所以总共胶原酶在37度培养箱里消化的时间大约30分钟，中膜碎片剪的都在1平方毫米以下，消化后上清夜没有出现浑浊的情况，好像肉眼观察还是比较清亮的溶液。离心后50ml离心管底部仅有少量细胞，培养24个小时后显微镜下见到的细胞数量相当有限，大约一个视野里仅3-4个细胞。
本人操作中总担心消化过头，是否对于中膜组织而言，消化应该充分一些。

还有消化后的组织块离心前需要过滤一下的吧

作者: TNT 时间: 2012-9-29 11:04

1、用的是胶原酶2，无血清培养基配成0.2%（但我用的时候都略略低于这个浓度，大概0.18%）。
2、在血清瓶里将组织剪成1-2mm小块后，加入配好的酶。封好口。
3、37度空气摇床上15rpm震摇6-8小时。掌握的度基本与wuffly所说的一致，即消化液略呈混浊状，仍有细小的组织块。如果都变成胶冻状，没有组织块，那么一定消化过头了。
4、滤网过滤，滤液1000rpm离心7min×2次。

如果你的消化液是清亮的，而且细胞数很少，我觉得是消化的时间不够。

作者: wood533 时间: 2012-9-29 11:06

培养两天后观察，好像细胞多了几个，有个问题想问，在细胞融合前，平滑肌细胞是否就呈梭形的，我现在在一个视野下可以见到大概十来个细胞，不过都是圆形，请问现在能否确定这是否是平滑肌细胞？

作者: TNT 时间: 2012-9-29 11:06

融合前是梭形的，带着长尾巴。

作者: wood533 时间: 2012-9-29 11:08

看来我得重来一把了，48小时后，细胞多了不少估计一个视野下可以见几十个，不过细胞都是圆形的。

各位给我说说这可能是什么细胞？

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