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标题: 【求助】单克隆挑不出怎么办 [打印本页]

作者: tianmei001 时间: 2012-9-29 11:47 标题: 【求助】单克隆挑不出怎么办

我用293细胞做转染，转染已经成功了，测过活性还可以，现在在用有限稀释法挑单克隆，但按书上的方法挑了三次都没有成功，就是将细胞稀释到10000个/ml，然后再稀释10倍，再稀释10倍，直到10个/ml，将稀释的细胞液以每孔100微升加到96孔板，但我让它长了20天都没长起来。不知道有什么技巧，请大家给点意见。

作者: biabiade 时间: 2012-9-29 11:47

你确定每孔1-2个细胞了吗？分完孔当然要在镜下确认每孔的细胞。

如果有细胞长不起来，有可能是折腾时间太久，细胞状态不好了。
细胞还贴壁吗？如果贴壁接换回液。

单克隆化没什么技巧。

作者: TAT 时间: 2012-9-29 11:48

我是这样做有限稀释的：

单克隆荧光阳性细胞的挑选：荧光蛋白标记的细胞以荧光倒置显微镜和FACS检测荧光细胞百分比，必要时重复转染一次，有限稀释法获得荧光阳性单克隆：于96孔板中8孔为一组，每组除第一孔外其余7孔每孔加入含15%FBS的IMDM50uL（无刻度巴斯德滴管1滴），第1孔中加入100uL细胞密度为1000个/mL的含15%FBS的IMDM，即100个/孔，（以排枪）自第1孔中吸取50ul，以后每孔依次做2：1倍比稀释，丢弃最后1孔中吸出的50uL，常规培养数天~1周后于荧光显微镜下挑选eGFP＋单克隆并扩增。

这个方法可以确保一定有细胞生长，如果比例足够，96孔板中至少有12~24个孔是有1个到2个细胞的，一般会有阳性孔。这种方法起始细胞数可以比较灵活，适合懒人。不象上面提及的经典方法，算得人头晕。我也没有去对过文献，自己想的。

我想，也许这种做法同样可以体现“有限稀释”的本意。

只要阳性率足够，不难。我是用逆转录病毒转的。

不知各位以为如何？

作者: 园丁## 时间: 2012-9-29 11:49

楼上自创的有限稀释法很好,理论上好象可以,而且是很聪明的方法,我马上就试一下,一周后就知道结果了.

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-9-29 11:50

我做的是整排的有限稀释，

第一排约50cell/100ul/孔
第二排是第一排的一半
直至第十二排，
每次做两板。

这个方法好像2-3个月前在本版说过，
讨论的是真核表达的问题。

作者: 二子 时间: 2012-9-29 11:50

一位在某国做过多年实验的老师，介绍给我如下方法进行单克隆化，他一直使用此法，效果很好，我正在准备试试，现介绍给各位：

将玻璃吸管在酒精灯下烧至熔化,然后两头拉伸并折断一部分使其成为毛细管,在管的另一头套上一个胶管含于口中。此时准备好96孔板，并加上培养液。
在荧光显微镜下观察－选定细胞－将吸管置于细胞上－轻轻吸细胞（在镜下可看到细胞进入了吸管）－将细胞转到96板中。如此操作，选上20～30个细胞培养。然后再选择最亮的含荧光的细胞继续培养。
在此操作中：
（1）最好有一个助手帮忙，主要是在你吸到细胞后，帮助你将96孔板打开；
（2）对于无菌操作，不用太担心，只要每一步都注意一些，不会污染；

如果感兴趣可以试一试，然后在此交流一些操作上的心得，如何！

作者: caihong 时间: 2012-9-29 11:50

用楼上改进的有限稀释法挑了单克隆了,细胞是有了,不过好象没有贴壁,大概是要等两天吧,很有创意的方法,多谢!多谢!

作者: caihong 时间: 2012-9-29 11:51

楼上兄的方法好象和卢圣栋老先生编写的一本书的配套光盘中转基因小鼠的制备异曲同工。有这个光盘或能借到的，可以看看，以供参考。

作者: caihong 时间: 2012-9-29 11:51

已经挑了四五天了,细胞还是没有生长的迹象,即使是在一孔有十几个细胞的孔中,也没有长起来,是时间不够长,还是有其他问题呢?
在挑单克隆的时候我大概总共用了半个小时不到的时间,从用胰酶消化细胞到最后放入孵箱,应该不会太长吧,在筛选稳定细胞株时我用的是800微克/毫升的G418浓度,是否在挑单克隆的时候应该减少呢?
96孔板是greiner bio-one的,用的是10%的胎牛血清,平时用它们做检测,细胞密度用20000个/孔铺板时,细胞的生长都很好的呀,应该不是这方面的问题才对.
本应该是很简单的问题,可就是挑不出来,真的很郁闷,不知道大家是否可以多点意见?

作者: langlang 时间: 2012-9-29 11:52

卢圣栋老先生的配套光盘倒是有两盘，当时是从录像带翻录的。现在好像是12本都有光盘了，不过我还没有见到全套。"海淀图书城“昊海楼404室有卖的。人民卫生出版社出版。
北京的朋友感兴趣可以问问：
Tel：82872132；Fax:62534434

作者: 831226 时间: 2012-9-29 11:53

这个情况我考虑可能是以下几个环节：

1）胰酶消化过度。我对293细胞用0.25%胰酶+0.01%EDTA消化30秒，最多60秒，细胞就可以吹下了，EDTA是保证细胞呈单个的关键。当然细胞要清洗去掉胰酶和EDTA，洗2次更好。你是老手，相信这个问题可能性较小。

2）挑克隆前细胞的状态。建议此前不要加药，等细胞贴壁后再加药。细胞不要融合。不要用力吹打。

3）800微克/毫升的G418浓度是有效浓度还是单纯的质量/体积比，如果按G418的纯度为70%的话也有560微克/毫升了。这是事先测定了还是参考其他细胞的浓度。严谨些应先测定。每个细胞差异很大。293是人的细胞，该浓度似乎大了。

4）血清质量。单个细胞生长的要求要高的多。进口的也不一定就好。

5）载体。我们发现过某些基因对于细胞生长是有影响的，有荧光但就是不长。最后换了载体。

以上原因不会都存在，供你参考。96孔板不是问题。实验的成功往往就在于细节的把握。祝你早日成功！

作者: c86v 时间: 2012-9-29 11:53

不太可能是胰酶消化过度。
加药？没有啊，你指的是G418吗，那不是一直都要的吗？
我用的是液体的G418，它的浓度是50毫克/毫升，每100毫升的培养液中，我加了1.6毫升。包装上好象没有关于纯度的表示。在筛选稳定细胞株时，我用的是800微克/毫升的G418浓度，细胞长得很好啊，单个细胞时，这个浓度就不行了吗？

作者: ALALA 时间: 2012-9-29 12:16

我今天看了一下15号挑的细胞，在一孔有十几个细胞的孔中，大约有一半的细胞开始发黑了，但又不像是污染，因为同孔的其他细胞还亮晶晶的，应该是活的吧，但又看起来不像是有贴壁的样子，因为没有像正常细胞一样拉起丝来。这时候如果换液（eeflying建议的养过同种细胞的培养液）可以吗，这种培养液加入之前要不要先做预处理呢？
另外，我转染的细胞在挑单克隆之前是有部分出现融合的现象，而且好象传代的次数的增加，融合的程度也有增加的趋势，这是什么原因呢？是否细胞是传代的次数太多了？在转染之后，到真正开始挑单克隆，我间隔了一段时间，在这段时间内我只挑了一次单克隆（没有成功），其余转染成功的细胞我做了保种，现在是将它们复苏出来挑，这样大概在转染之后到现在挑单克隆之间我一共传了4-5代，这样是否可能就挑不出来了？

作者: c86v 时间: 2012-9-29 12:17

有可能是细胞正在走向凋亡。

我建议的方法只要过膜就可以了，’

一方面防止污染，另一方面防止带进未转染的细胞。

作者: 西子 时间: 2012-9-29 12:18

怎么细胞会走向凋亡？
过什么膜，用一般.22和.45的过滤膜，用于针筒抽滤的那种吗？也用针筒抽滤的方法吗？

作者: c86v 时间: 2012-9-29 12:19

过什么膜，用一般.22和.45的过滤膜，用于针筒抽滤的那种吗？也用针筒抽滤的方法吗？

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0.22，抽滤即可。

作者: ALALA 时间: 2012-9-29 12:20

G418的效价是不是很重要, 粉剂的G418是不是有个效价的问题, 但是为什么没有标出来呢? 在包装上?

作者: c86v 时间: 2012-9-29 12:20

氨基糖甙类药物都使用质量表示吧。

好象这类药的效价问题不是很明显。

用质量没问题。

作者: ALALA 时间: 2012-9-29 12:21

那什麽叫做G418有赋形剂，如果我是用粉剂按质量比配的话，是不是跟本身就买的是液体的就不一样呢？因为我们实验室，前面用的是液体的，这两天老板刚回来，又带回了粉剂的，我不知道这样的话，我原先用液体G418摸的浓度，现在用自陪的是否也适用？

作者: ALALA 时间: 2012-9-29 12:21

我在文献上看到说双抗，也就是青霉素和链霉素的使用对于G418 的筛选有竞争性抑制的作用，而且也影响转染的效率，那这样的话，是在加入G418的培养液中不加双抗比较好，还是增加G418的浓度比较好呢？

作者: c86v 时间: 2012-9-29 12:21

赋形剂是药物里常用的一种辅料，比如我们平时吃的药片，明明医生开的是几毫克，怎么会有那么大的一片。就是有赋形剂。

G418的赋形剂比例是是：每1mgG418粉末中含有G418纯品735ug，各公司不大一样。但差不了太多。每次称量时别忘按比例多称10/7就可以了。

不是竞争抑制，因为链霉素，庆大和G418都是氨基糖甙类药物，都要靠氨基－乙酰基转移酶来分解，

连用时会有协同作用，不过从我的经验而言，影响不大。只是注意转染时用无抗性的培养液就够了。
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=18139&h=1&bpg=1&age=0')
很多问题都讨论过了，看看吧。

作者: abc816 时间: 2012-9-29 12:22

我手头有一套，原来实验室的，一个很好的机会被我全部翻刻了，从录象带转录而来，整整花了我两个通宵。当然我自己全部看过。分子生物学入门的很好教材。很感谢卢老先生，不过有点对不起他哦。：）
新版的好象是一张光盘，没有看过，不知道有没有区别。
如果各位需要，我可以上传，但是不知道传到哪？

作者: 大尾巴 时间: 2012-9-29 12:22

新家有FTP

作者: ha111 时间: 2012-9-29 12:24

其实我觉得按书上说的方法没错阿，先取小鼠腹腔巨噬细胞滴2块96孔板，用弯头滴管滴2滴/孔（约100ul)，于培养箱放置。对克隆细胞计数后，取230个左右（只能是大约）的细胞于4.6ml培养液中，先滴前3排，2滴/孔，平均每孔5个细胞；剩1ml培养液，再补加4ml，滴中间3排，平均每孔1个细胞；剩1.4ml培养液，补加1.4ml，滴最后两排，平均每孔0.5个细胞。我这样做很容易就挑到单克隆，你不妨也试试。

作者: ha111 时间: 2012-9-29 12:25

G418有赋形剂的，约700ug/mg。你用液体的就没这个问题。

要等１０天左右才可以形成克隆;

如果单细胞存活能力差，可用养过细胞的培养液。具体做法：在另一瓶子里养同种细胞，到养到一半，别等养分耗干，取出培养液，过滤膜，加G418用于单细胞培养。

原理：在细胞培养过程中，细胞间通讯对于细胞的生长是最重要的因子，比任何血清提供的生长因子都重要。还有，血清在细胞培养中提供的是生长因子，而不是蛋白质营养。是否血清灭活过度，生长因子失活过多，在常规细胞培养中因有细胞间通讯提供生长因子，所以影响不显著，单细胞培养中，因位细胞间通讯消失，这个血清因子失活的问题就显出来了。用培养过细胞的培养液，因为里面有细胞自己分泌的生长因子，

所以会更好，注意别养得过分，把宝贝们饿死就行了。

不成用一半养过的，一半没养过的也成。

作者: 17801095410 时间: 2023-2-13 15:14 标题: 回复 #1 tianmei001 的帖子

博主最后发现是什么原因了吗，我最近也遇到了类似情况，转染成功的CHO-K1细胞株，有限稀释法挑单克隆，铺完板后，细胞不长，4天就发现死亡了

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