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标题: 【求助】如何防止细胞涂片免疫组化时脱落 [打印本页]

作者: vvmmoy 时间: 2012-10-1 20:27 标题: 【求助】如何防止细胞涂片免疫组化时脱落

最近试验一直不顺，有人说细胞涂片免疫组化好做，可我做了好多次都没结果，请教如何防止细胞涂片免疫组化时脱落。

作者: yychen 时间: 2012-10-1 20:28

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2012-10-1 20:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近试验一直不顺，有人说细胞涂片免疫组化好做，可我做了好多次都没结果，请教如何防止细胞涂片免疫组化时脱落。

应该注意以下几点：
1。一定要用PLL或collagen包被细胞爬片；
2。PBS清洗时，一定不要直接冲洗到细胞上，而要从壁缓慢的流下；
3。如果对细胞进行了损伤性处理，这时细胞脱落的可能性就会增大，我的做法是：加大损伤的强度，但是缩短作用的时间。

希望对您有用！

作者: nn255 时间: 2012-10-1 20:28

你用的粘片剂是那种？我在普通石蜡切片用APES，很少用脱片现象。

作者: yychen 时间: 2012-10-1 20:29

你用的粘片剂是那种？我在普通石蜡切片用APES，很少用脱片现象。

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楼上说的可能是细胞爬片，而不是切片！

作者: vvmmoy 时间: 2012-10-1 20:29

细胞涂片与细胞爬片也不一样呀，比如血细胞涂片等等
我现在也准备要做细胞涂片的组化，谁能提供经验呀，谢谢先

作者: woshituzhu 时间: 2012-10-1 20:29

我的实验是将分离的细胞调成一定细胞浓度的悬液后。将细胞悬液进行涂片，干燥后再行固定，其他同一般免疫组化步骤一样。不是在载玻片上培养细胞进行免疫组化。
另外，还请教高手指点：细胞分离后镜下活性良好，HE染色形态完整，为何免疫组化后看不到完整的细胞，只能看到细胞核着色。

作者: 莲花白 时间: 2012-10-1 20:30

用10%多聚赖氨酸或0.5%明胶处理玻片最好,不要用APES(易变性).
细胞涂片必须用贴片剂37摄氏度烤干后再涂细胞，而且免役组化要用甲醛或丙酮固定。免疫组化一般显示胞体结构，不显示核，可能你的实验有问题！

作者: bongte 时间: 2012-10-1 20:30

你做的免疫组化是什么方法，是ＡＢＣ法吗？如果是的话，只染出细胞核的情况是有的，但应该判定是染色阴性。空白对照你做了吗？你可以看一下，是否一样。我原先做过也出现过这种情况，你可以延长一抗和二抗的时间，如果还是如此的话，很可能就没有你要检测的抗原。

作者: 莲花白 时间: 2012-10-1 20:31

我的免疫组化是用ＡＢＣ法检测核内NF-kB,结果也是核着色细胞为阳性,计算核着色细胞占总细胞数的百分比,不知哪位兄长有此方面经验请指教.

作者: moonlight 时间: 2012-10-1 20:31

免疫组化并不是只显示核或胞浆,这取决于你所要检测的抗原的定位,例如对于神经细胞,NeuN即表达于核中,而β-tublin则仅表达于胞浆.
但是有时免疫组化也会出现不可靠的情况,当你所使用的缓冲系统PH不对时,或者抗体的质量不高,储存方式不当,都有可能出现待检测抗原并不分布的地方出现阳性结果,因此我们最保守客观的说法一般是A免疫反应阳性,而不说A阳性.
因此为得到确切的结果,至少要重复三次都得到相同结果,并且每次都需要设阳性及阴性对照.
若A抗原应出现于胞浆,却在胞核中出现,则可同时染仅在胞浆中出现的抗原B,以检测缓冲系统是否有问题.若无问题,需要进一步排除抗体问题

作者: vcve 时间: 2012-10-1 20:32

免疫组化并不是只显示核或胞浆,这取决于你所要检测的抗原的定位,例如对于神经细胞,NeuN即表达于核中,而β-tublin则仅表达于胞浆.
但是有时免疫组化也会出现不可靠的情况,当你所使用的缓冲系统PH不对时,或者抗体的质量不高,储存方式不当,都有可能出现待检测抗原并不分布的地方出现阳性结果,因此我们最保守客观的说法一般是A免疫反应阳性,而不说A阳性.
因此为得到确切的结果,至少要重复三次都得到相同结果,并且每次都需要设阳性及阴性对照.
若A抗原应出现于胞浆,却在胞核中出现,则可同时染仅在胞浆中出现的抗原B,以检测缓冲系统是否有问题.若无问题,需要进一步排除抗体问题

作者: duoduo 时间: 2012-10-1 20:33

1 不要反复冻融
2 37℃ 30min 干燥或者室温吹干
3 适当使用黏附剂：PLL，鼠尾胶、明胶
4 不要直接冲刷细胞

作者: yychen 时间: 2012-10-1 20:34

我用的是鼠尾胶原效果不错
作免疫组化时主要不要过多的振荡，可多洗几次。振荡过多，细胞脱落会比较多。

作者: yychen 时间: 2012-10-1 20:34

还有需要注意的是每一步加液体时应从培养孔的壁上轻轻加上.使液体慢慢到达孔底。

作者: 969 时间: 2012-10-1 20:35

我在做组织分离的活细胞的免疫组化，谁能告诉我要用多少细胞数？稀释多少浓度？转速多少？多长时间？丙酮固定吗?先谢谢了

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