分析测试百科

标题: 走梯度的问题 [打印本页]

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 11:14 标题: 走梯度的问题

我想走一个pH梯度，在pH3时，不出峰，在pH2.5时死时间出峰，为什么走线性梯度pH3-2（10min）中间不出峰？

作者: uovt69jn 时间: 2009-7-22 14:20

我估计在pH2.5死体积出的峰不是你要的，如果是你要的话，pH3时也绝对对出峰的。pH是可以改变出峰时间，但是对时间的改变比较小，溶剂梯度才是改变出峰时间的主要因素。

作者: ttkl533 时间: 2009-7-22 14:47

你的实验有问题，缓冲液从2.5～3.0改变这么大，有点不太可能！请将具体的条件列出来，大家好帮你分析！一般梯度从5%～95%（有机溶剂），梯度时间20min即可。确认所有的峰都要出来，然后根据出峰时间确定起始和最终有机相的比例！

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 14:48 标题: 回复 #2 uovt69jn 的帖子

呵呵，死时间出的峰是我想要的，因为我进的是标准品。ph3就是不出峰啊，你为什么这么肯定呢？我走梯度，不行啊，不知道为什么。

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 14:54 标题: 回复 #3 ttkl533 的帖子

缓冲液从2.5～3.0改变这么大，为什么不可能啊？我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.大家看看有什么不妥吗？

作者: yangxinlei 时间: 2009-7-22 15:10 标题: 无须梯度

分离一个化合物无须梯度这么麻烦，等度就可以了
你的化合物是酸性的吗，用的是什么柱子？
要是酸性化合物，一般RP柱，你的方法就是有问题的，酸性化合物在pH越低的条件下电离就越弱，疏水性就越强，这样一来保留越强才对。
最好告知你的化合物性质或结构和柱子类型，否则都是瞎建议

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 15:23 标题: 回复 #6 yangxinlei 的帖子

呵呵，两个月都没分出来，哪有你说的那么简单，不是我的方法有问题，是样品太复杂，奇怪的现象连连发生，你说的不可能它就发生了啊，我分离的目标是多肽盐，柱子就是c18柱。看看有什么好的建议不？

作者: j-1982 时间: 2009-7-22 15:25 标题: 回复 #1 悠悠白云的帖子

我也没有跑过pH梯度，不知你是怎样做到的！难道是用一定浓度的三氟乙酸溶液跟流动相跑的？pH变化只有0.5，这也太难控制了吧！
不过pH对结果的影响有时确实很大，我就遇到过一样品中性条件下不成峰型（整个一基线抬高），加0.1%三氟乙酸峰就很漂亮。还有做手性分析时0.1%三氟乙酸一点分不开，但在此基础上加0.02%的二乙胺对应体就基本彻底分离，而只加二乙胺也是一点分不开。

我想现在首先应该弄清楚pH2.5时死时间出的那个峰到底是不是样品峰，可进一空白对比看看。

作者: chrispand 时间: 2009-7-22 16:52

PH2.5时完全离子化，所以基本不保留，随着流动相直接洗脱。PH3时可能洗脱不下来，所以你试一下加大有机相的量。
建议用PH3不用什么PH梯度，然后加大乙腈的浓度。试验一下，看结果如何？

[ 本帖最后由 chrispand 于 2009-7-22 16:54 编辑 ]

作者: hplc 时间: 2009-7-22 17:12 标题: pH梯度比浓度梯度复杂得多

原贴问题：
我想走一个pH梯度，在pH3时，不出峰，在pH2.5时死时间出峰，为什么走线性梯度pH3-2（10min）中间不出峰？
补充问题：
缓冲液从2.5～3.0改变这么大，为什么不可能啊？我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.大家看看有什么不妥吗？

我的回答：
这可是一个高难度问题，请大家不要以为很简单。pH梯度做的人比较少，也容易被忽视。
其实pH梯度比浓度梯度复杂得多同。学问很大。不是一般的知识和操作所能了解和掌控的。
在这里也不可能简单二三下就能说清楚。估计真正能说清的人国内也没几人。即便是色谱大师或一些所谓牛人，也是一头雾水。

我所关心的是你所说的pH梯度。你如何能准确控制或测定流动相的pH?其实原因的解释是次要的。结果才是主要的。
另外，被测多肽中有什么碱性氨基酸组成？
我关心此问题。液色迷人 cuturl('http://hplc2.blog.163.com')

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 19:01 标题: 回复 #10 hplc 的帖子

被测多肽中有赖氨酸，是一个甲磺酸钠盐

作者: aa_tang 时间: 2009-7-22 20:30

回复 #1 悠悠白云的帖子
走梯度的问题
我想走一个pH梯度，在pH3时，不出峰，在pH2.5时死时间出峰，为什么走线性梯度pH3-2（10min）中间不出峰？

回复 #5 悠悠白云的帖子
缓冲液从2.5～3.0改变这么大，为什么不可能啊？我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.大家看看有什么不妥吗？

pH gradient HPLC来分离某些复杂体系，这种思路可以试验。
按楼主设定的pH gradient 运行样品，不出峰，很正常！楼主虽然注意到了流动相洗脱体系中有机相比例保持不变，但确忽略了一个事实：使用的是磷酸氢二钠buffer，“A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40.”在这个线性梯度过程中，流动相体系没有达到楼主预想的从pH 3 梯度变化到 pH 2！因为磷酸盐buffer有一定的缓冲容量的，pH没法变过来。楼主若是不相信的话，可以从HPLC废液口，于不同时间点接流出液，测定pH。或者更干脆的方法——直接把 A1/B=60/40 和 A2/B=60/40混起来，测pH。

给楼主的建议：

既然分离的化合物是多肽类，建议采用TFA体系，同时考虑到运用pH gradient HPLC方法，所以可尝试：
mobile phase：A1:0.01%TFA水溶液（V/V，pH=2.84)，A2:0.10%TFA水溶液（V/V，pH=2.03) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40
试试这个体系，看是什么情况？
Effects of TFA Concentrations on HPLC

另外，pH gradient HPLC法分离多肽，可以参考一下相关文献。
pH gradient reversed-phase liquid chromatography as a fractionation tool for the separation of peptides
cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6THP-4PYYTNG-1&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=2cab8269d63d53b9a610291caf9fbf6f')

[ 本帖最后由 aa_tang 于 2009-7-22 20:39 编辑 ]

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 20:39 标题: 回复 #12 aa_tang 的帖子

非常感谢您的建议，您说的这个体系试过了，没什么效果。此肽盐我们在高效毛细管电泳上试过了，可以得到分离，只是峰形不太好，但重现性还可以。我想是不是需要外加电压才可以，液相会不会不适合分离呢？

作者: troy.tper.lee 时间: 2009-7-22 20:58

觉得很奇怪，而且采用TFA体系也不行的话。
建议可以先试等度，从2.0~3.0逐渐变化，每次0.1，找出开始不出峰的PH值，或保留时间随PH的变化规律。
另外，从你的化合物入手，看你的多肽是否发生了质的变化而引起检测上的变化。

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-22 21:18 标题: 回复 #14 troy.tper.lee 的帖子

太感动了！谢谢各位指点！我把各位的建议都试试，有结果了告诉大家！

作者: cao1208 时间: 2009-7-23 08:13

看了您的问题，和看了大家的解释。我个人是这么理解的。因为不清楚具体目标和过程只有如下看法：
1 你的梯度系统过于复杂，B相是固定的，为何不和A1，A2整合一下，这样你的溶剂压缩波动会减少很多，因为按你的字面含义，属于3溶剂系统，这在一般梯度中应该避免的，原因是溶剂压缩比，溶液混合后pH改变等，常规液相不是能很好的进行，超高压液相可能是一个解决途径；
2 溶液混合后，特别是和有机溶剂混合，pH值通过水相电极测定只是一个表观值，具体的在梯度过程中的实测值，您并不清楚，所以这也是一个原因，同时也是建议您减少溶剂系统的原因之一；
3 您分析的是多肽，也有标准品，序列是明确的，开始您计算的pI是多少，其中碱性，酸性氨基酸比例是多少，总体应该根据这个进行溶剂选择。这里提供一个蛋白组中常用的溶剂系统，你可以简单测评一下，A 97%water：3%ACN—B 10%water：90%ACN，两相均加入0.1%formic Acid.
4 您提出的实验现象在大体积进样中常出现，pH3没有峰，是因为在记录之前就已经洗脱出去了，这个原因有2，一个是在进样过程中，loop体积较大，进样时间大于溶剂前端流动到柱的时间，这时候在记录开始时，溶质已经冲出柱子，第二是样品溶解溶剂，将柱子quench了，也就是不保留了。
5 关于梯度，实际上在液相洗脱相关的各个因素中，溶剂比例浓度，温度，添加剂比例，检测条件等等，均可以尝试梯度改变来达到分离目的，因此看到上面一些叙述，有的过于局限，梯度不是一个限定词，而是一个因素改变策略。
以上只是建议，具体还要看你的实验过程和对象。

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-23 08:39 标题: 回复 #16 cao1208 的帖子

谢谢您的热心帮助，用三相是为了节省乙腈，呵呵。

作者: 恐龙 时间: 2009-7-23 10:00

这个问题看来很复杂？
注意一点，流动相的pH梯度不等于实际的pH梯度，二者有差异的，尤其是有有机溶剂参与时。
0.5的pH变化会造成这么大的差异？？？请具体提供化合物的结构。

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-23 10:47 标题: 回复 #18 恐龙的帖子

真是不好意思，对于该肽盐我只能说这么多，甲磺酸钠肽盐，等电点2.5（不知道是不是可靠，呵呵）我想最有可能的就是跟该物质的结构有关系。总之，用什么流动相不是不出就是死时间出，走浓度梯度也不出。

作者: ttkl533 时间: 2009-7-23 16:10

回复：悠悠白云

呵呵，没见过你做试验的这种方式，两种流动相体系改变做梯度！真不明白你想通过这样的梯度，想获得什么信息？是想获得最佳的pH值，还是选择一种适用的缓冲液！你这种做法，是浪费时间了！
最好每次只改变一个因素，比如你要选择pH, 要用同一个缓冲盐溶液，其他色谱条件一样，配置3不同的pH值进行试验，看看色谱峰的移动情况，选出最佳的pH。若选择不同的缓冲盐，在确定的PH值下，试验不同缓冲盐种类对分离的影响！你的方法是自己开发的，还是标准的方法！如果是自己开发方法，你的重新进行试验。如果是人家提供的标准方法，我就无语了！

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-23 16:37 标题: 回复 #20 ttkl533 的帖子

我没有同时改变两个变量啊，我只是改变了pH值，缓冲体系是相同的。等度的pH我试了一系列，所以才选择pH梯度，这很不可思议吗？我没觉得！

作者: 出国吧 时间: 2009-7-23 21:33

我觉得这样的实验方法是有缺陷的
因为PH3和PH2的两种溶液按照你的方法在液相里混和,然后做出来的图谱
又能说明什么问题呢?
因为你的缓冲液的PH随着时间的改变,所以在你PH改变的10分钟内,你每个时间出来的色谱峰多是在不同的PH的缓冲液也就是不同的流动相组成做出来,保留时间峰形多不会不一样
那你又拿什么做比较呢?有可比性吗???
你是要想知道在PH3到PH2之间哪个PH适合你的样品,也就是说你想要在合理的PH值下得到更好看的色谱图吧!!
我建议你准备至少3-5个不同PH值的缓冲液
在同一仪器其他所有的条件不变只改变缓冲液
然后得到3-5张不同的图谱
你就可以进行比较了
择优而定！

作者: aa_tang 时间: 2009-7-23 22:12 标题: 回复 #11 悠悠白云的帖子

多肽甲磺酸钠盐，两性离子，用HPLC来分析，流动相的pH值确实尤为关键！
HPLC 分析 peptide zwitterion ，不知道楼主是否尝试过用甲酸铵缓冲液体系，这个流动相体系分析多肽也很顶用的，可否尝试用 10mM HCOONH4 buffer（调pH 2.0）？

另外，是否也可以考虑用ion-pairing HPLC，离子对色谱法，试用 10mM TEA（三乙胺）溶液（CH3COOOH调pH 7.4），这个体系分离强酸性化合物也比较合适，不知是否适用与楼主的情况？供参考吧，有时候有机相比例微调1个百分点，出峰情况迥异，做多肽分离时遇到过这种情况。

作者: j-1982 时间: 2009-7-24 05:01

QUOTE:

原帖由 悠悠白云 于 2009-7-23 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
真是不好意思，对于该肽盐我只能说这么多，甲磺酸钠肽盐，等电点2.5（不知道是不是可靠，呵呵）我想最有可能的就是跟该物质的结构有关系。总之，用什么流动相不是不出就是死时间出，走浓度梯度也不出。 ...

“我走的是线性梯度，mp：A1:磷酸氢二钠（10mM,pH=3),A2:磷酸氢二钠（10mM, pH=2) B;乙腈，A/B=60/40, gradient：10min内，由A1/B=60/40变为A2/B=60/40”

不得不说，你pH梯度这个方法设计得确实很巧妙，不过还是有一些考虑不周的地方！
先说巧妙的地方：1.利用了三元泵走梯度作pH变换。想得巧！
2.缓冲盐选择了pH在2——3没有缓冲作用的磷酸氢二钠（pKa约12），这样便能较好地完成pH的“线性”梯度。
不周的地方是：pH2时能出峰吗，如果冲不出来呢（这个假设如果成立，是不是就解释了这个pH梯度不作用的原因）？那将梯度的终值设为2是不是欠考虑，为什么不设成更有把握的2.5呢？

还有一个可以尝试的方法是整体条件pH2.5的情况下，加大流动相水的比例，看能不能有保留。

还想到一点：如果只有在等电点时（pH2.5）死时间出峰，而在别的pH条件下都不出峰；从C18的分离原理来说，不带电荷都死时间，那带电荷（极性更大）就更是死时间了，或许样品不是没出来，而是直接弥散在流动相里了。关于这点的验证，严格地做一下空白实验应该不难看出！

C18不好用的话试一下强阳离子交换柱（SCX）吧！

[ 本帖最后由 j-1982 于 2009-7-24 05:10 编辑 ]

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-24 09:29

谢谢大家的热心关注，我正发愁下一步不知道该怎么做呢，多谢了！

作者: ttkl533 时间: 2009-7-24 10:27

回复#21 悠悠白云的帖子
呵呵，pH梯度对我来说是一个新生的概念，但是没法在液相中使用，楼主的创新精神值得鼓励！但是建议楼主好好学习色谱基础理论，合理地提出创新意见！

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-24 11:20 标题: 回复 #26 ttkl533 的帖子

作者: 悠悠白云 时间: 2009-7-28 07:42

还是没有解决!

作者: dxkuii 时间: 2009-7-28 07:49

pH梯度对我来说是一个新生的概念
晕，第一次听说这个概念，一般来说做的最多的是有机溶剂梯度，选一个ph，做梯度洗脱就可以了，有什么必要做pH梯度？

作者: header 时间: 2009-7-28 08:15

第一次听说pH梯度，以前都是配制一系列不同的pH值的缓冲液，在某个pH再改变其他条件摸索液相条件。pH值对物质的解离状态影响很大，你试验的目的是什么呢？检测？制备？
还有想问下，你怎么保证是线性的梯度？一般pH的变化都不是线性的，并且还是缓冲液

作者: dsfl1314 时间: 2013-8-16 21:11

很实用！！

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)