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标题: 【讨论帖】看图说细胞－状态好坏鉴别 [打印本页]
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:23     标题: 【讨论帖】看图说细胞－状态好坏鉴别


我正在培养两种人B淋巴细胞，L721.221, Raji。对细胞状态好坏的鉴别有一点心得，希望和大家讨论。
长的好的细胞有下面几点特征：
1. 培养液：澄清，能很快变黄（5％CO2培养箱，12h之内），说明增殖快
2. 低倍镜（10X10): 细胞透亮，“晶晶亮”，大小均一，其中还有个别“超级大个子”，是处于分裂前期的细胞，胞膜完整，不是细胞肿胀。
3. 低倍镜（10X10): 聚集悬浮生长的细胞，通常能看到一簇一簇的细胞群，应该就是一个个“克隆”吧。
4. 低倍镜（10X10): 细胞容易悬浮，容易随培养液“四处飘荡”，即使形成较大的细胞簇，也是“飘飘荡荡”的。
5. 高倍镜（10X40): 大小钧一，形态规则，胞膜完整。

长得不好的细胞正好与前面相反：
1. 培养液: 有浑浊感，不变黄（几天甚至几星期都是红的），细胞根本不在呼吸代谢。
2. 低倍镜（10X10): 细胞黯淡无光，几乎看不到“大个头”的细胞。
3. 低倍镜（10X10): 很少有小簇细胞群，（若是细胞密度过大造成细胞状态不好，只有很大的细胞群，没有新生的细胞“小”克隆）。
4. 低倍镜（10X10): 细胞不容易“飘荡”，似乎很“重”，粘在瓶底，还可以在瓶底看到细胞的残骸(淡淡的细胞样的痕迹）。
5. 高倍镜（10X40): 大大小小，深深浅浅，没有固定的外形，（能看到各种怪样子），是细胞凋亡皱缩，或崩解造成的。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:23


贴几张图：10x10,好细胞

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13999

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:24

10x10, 好

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14000

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:24

10X10,好，小克隆

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14001

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:24

10x20, 好，下方正中有一“大个子”，有时还能见到更大的

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14002

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:25


10x40 ,好，胞膜完整，大小规则，色浅


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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14003

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:25

10x40, 好，小克隆，漂浮

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14004

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:26


10x40, too bad, 满目疮遗

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14005

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:26


10x40，too bad ,细胞残骸！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14006

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:26


10X40, 好坏细胞在一起（中间的好），对比一下吧

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14007

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:27


10x40，看看各种怪样子（坏）


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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14008

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:27


10x40, 小克隆旁边的（坏）

图片附件: 20122230.jpg (2012-10-22 15:27, 52.13 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14009

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:28


10x40, 只剩下一点点细胞的影子了

图片附件: 79830506.jpg (2012-10-22 15:28, 16.12 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14010

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:28


10x40, 怪吧

图片附件: 75389217.jpg (2012-10-22 15:28, 14.95 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14011

作者: DDD    时间: 2012-10-22 15:28


我看了你的图，很好很好，记得以前我也见过这样的情况，可惜没有楼住这样敬业，把照片都贴出来了，辛苦了，建议加分！！！！！！！
实验最基本的是细胞培养，最关键的也是细胞培养，我也在养人 T细胞，是我自己的细胞，看者它们生长，就象看者自己的孩子一样，呵呵。毕竟是从自己身上抽出去的，不想它们就象照片上那样，变的面目全非啊。
希望能和楼主互相交流，多多指教啊。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:29


你的问题，我在培养中也曾碰到，当细胞特别少的时候，离心法彻底更换培养液，反而会越来越糟。可能细胞增殖需要合适的微环境，细胞之间会“团结协作”相互促进，例如分泌生长因子等。如果不断换液，就会打破良好的氛围，我的经验是细胞浓度低于10万/ml，可以将培养瓶“直立”放置（仅限于悬浮生长的细胞，如淋巴细胞），在瓶底浓缩细胞。倍倍稀释法换液比较好，保证细胞微环境变化不大。

另一个变糟的原因是，离心会增加污染机会。

还有，每次离心，来来回回“倒腾”细胞的时候，会有10-20%的细胞损失。

当然，细胞浓度增大后，代谢废物多了，还是要离心换液。但这时“丢”细胞已经不是主要问题了。

希望你的细胞也能快快长
作者: 一叶    时间: 2012-10-22 15:29


楼主实在是很有耐心，对大家帮助挺大的，看来在培养细胞方面快炉火纯青了，希望以后能多多指教。建议加分分啊！
PBMC说的也很好，细胞培养很关键，很重要，在这方面出现和碰到的问题很多。比如，对待细胞要象对待自己的孩子那样，了解其习性，增长、增殖的周期等等，不同的种属细胞给予不同的对待，这就需要耐心，细心和认真。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:29

感谢大家支持，我们这里养细胞的个个都有一点心得，整理出来和大家分享是件快乐的事。我正在鼓励周围的几个细胞高手，把看家的本事都拿出来，交流才能进步。“独乐乐，不如与人同乐”。
作者: DDD    时间: 2012-10-22 15:30

你的问题，我在培养中也曾碰到，当细胞特别少的时候，离心法彻底更换培养液，反而会越来越糟。可能细胞增殖需要合适的微环境，细胞之间会“团结协作”相互促进，例如分泌生长因子等。如果不断换液，就会打破良好的氛围，我的经验是细胞浓度低于10万/ml，可以将培养瓶“直立”放置（仅限于悬浮生长的细胞，如淋巴细胞），在瓶底浓缩细胞。倍倍稀释法换液比较好，保证细胞微环境变化不大。

另一个变糟的原因是，离心会增加污染机会。

还有，每次离心，来来回回“倒腾”细胞的时候，会有10-20%的细胞损失。

当然，细胞浓度增大后，代谢废物多了，还是要离心换液。但这时“丢”细胞已经不是主要问题了。

希望你的细胞也能快快长

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谢谢，我明天师兄还会给我复苏一部分细胞，我会根据你的建议很认真很仔细的培养，希望细胞会有起色，以后遇到了问题还会请您帮助。
作者: DDD    时间: 2012-10-22 15:30


楼主的耐心真是厉害，看来是妹妹无疑了。
如果淋巴细胞分不出来，到底是怎么回事呢？明明出现了pbmc层，可吸取后再一离心，就什么都没有了，只有点点的细胞，真是郁闷啊。
作者: abc816    时间: 2012-10-22 15:31


请教：在培养液中加入Heps和谷氨酰氨的浓度是多少，还有我现在有Heps和谷氨酰氨粉末，把它们配成百分之几的浓度，用什么配啊，是三蒸水吗
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:31


我们的配方是： (2x1000ml)
RPMI Medium 1640, 10.4g, 2x1袋
L-Glutamine, 2mmol/L, 2x300mg
2-Mercapto-ethanol, 50umol/L, 2x3.9ul
Pyruvic acid, sodium salt, 1mmol/L, 2x110mg
Hepes Free acid, - 2x1.5g
Sodium bicarbonate, - 2x1.5g
Gentamyoin sulfate injection,50 U/ml, 2x50000 U
DDW ==>2x1000ml
pH ==>7.2
立即，0.22um 滤菌==>高压==>4度密封保存
用前加10%NBS。
一到两个月，需要往保存的1640中加原量的L-Glutamine（分解了）。

我们的前辈，是个超级细胞高手，强烈推荐所有试剂都用进口的（特别是前四个）。

我们用的很好，不知在你们那怎样，试试吧。
作者: 一叶    时间: 2012-10-22 15:32



QUOTE:
原帖由 穿越时空 于 2012-10-22 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们的配方是： (2x1000ml)
RPMI Medium 1640, 10.4g, 2x1袋
L-Glutamine, 2mmol/L, 2x300mg
2-Mercapto-ethanol, 50umol/L, 2x3.9ul
Pyruvic acid, sodium salt, 1mmol/L, 2x110mg
Hepes Free acid, - 2x1.5g
Sodiu ...

注意：一般用0.22um滤膜滤过后，已经达到无菌要求，不需要高压的。
作者: BUK    时间: 2012-10-22 15:32


不能高压,一高压那些营养成分都变性了。一般在无菌状态下经滤膜除菌就行。
作者: mamamiya    时间: 2012-10-22 15:33

不错！不错！

收获很大！可以拿出来当样板给初学的看图学养细胞了。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:33

多谢楼上几位及时指正，的确是我大意写错了。希望没有给你带来损失。
作者: ALALA    时间: 2012-10-22 15:34


合适的离心速度和时间!
不要携带太多的分离液!
作者: duoduo    时间: 2012-10-22 15:34

我看了你的图，很好很好，记得以前我也见过这样的情况，可惜没有楼住这样敬业，把照片都贴出来了，辛苦了，建议加分！！！！！！！
实验最基本的是细胞培养，最关键的也是细胞培养，我也在养人 T细胞，是我自己的细胞，看者它们生长，就象看者自己的孩子一样，呵呵。毕竟是从自己身上抽出去的，不想它们就象照片上那样，变的面目全非啊。
希望能和楼主互相交流，多多指教啊。

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你好，能否请教一下人T细胞如何培养吗？我也准备养，但不知如何做准备。
作者: 阿k    时间: 2012-10-22 15:34


我想请教一个问题，对于悬浮生长的细胞，在培养方面，是细胞浓度高些还是细胞浓度低些对细胞状态、增殖有利呢？
作者: shenkunjie    时间: 2012-10-22 15:35

干得好！细胞培养这种事情本来就是需要我们平时多下点功夫,经验的积累才能培养出真正的本领！，加油哟，各位！
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:35



QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2012-10-22 15:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
干得好！细胞培养这种事情本来就是需要我们平时多下点功夫,经验的积累才能培养出真正的本领！，加油哟，各位！

我个人的经验，如果是增殖很快的肿瘤细胞胞系，如Raji等，当细胞处于少量增殖期时，状态比较“稳定”。“稳定”是指细胞基本同步化，处于同一细胞周期，大小、折光性、颗粒性、膜表面分子，都比较钧一。

更重要的是细胞膜强度大——若在快速增殖期，细胞极度膨胀，成为“超级大个头”，胞膜为了迎接即将到来的“重新分配”，变得很柔弱，就像孕妇的“肚皮”，十分松弛，经不得碰撞！——离心，洗涤，振荡，重悬对细胞都是很严重的“冲击”。

不知到其他各位有什么经验，一起交流交流吧。
作者: duoduo    时间: 2012-10-22 15:36

首先，你要有细胞培养所必要的设备，比如培养箱，培养瓶，培养板等等
其次，就是试剂了，我一般是用RPMI —1640培养液+10%fcs （还包括谷氨酰胺，庆大酶素，heps等成分）+rIL-2 （25-50U/ML）培养人pbmc。每3天换液一次，加rIL-2 一次。
细胞培养最最重要的就是要注意操作过程中的无菌概念，一定要注意无菌操作！！！！否则，细胞培养根本不可能成功，这一点，你可以参考精华版的几个高手的经验。
若是你想在培养过程中得到不同的t细胞亚群，就需要用不同的刺激剂
一般我用的有okt3 ，okt8 ，okt4，mtb-ag（结核杆菌抗原），分别能刺激t总，CD8 T，CD4T，和gama-delterT 的增殖。但是这样得到的t细胞亚群都是活化后的，要得到非活化的t细胞亚群，现在我知道的，有磁珠抗体分选和流式细胞仪分选。
另外，我对t细胞培养也是刚刚起步，希望以后能多多交流经验。
祝你早日细胞丰收~~~
作者: DDD    时间: 2012-10-22 15:36

相关疾病：
肿瘤
duoduo:
多谢指教，我现在养的是肿瘤细胞，有的培养液是RPMI-1640，没有加10%fcs （还包括谷氨酰胺，庆大酶素，heps等成分），不知是否可行？还有，你所说的okt3 ，okt8 ，okt4，mtb-ag是什么，怎么得到，具体该怎么做，可否告诉我详细点吗？
作者: duoduo    时间: 2012-10-22 15:37


相关疾病：
结核
不加小牛血清的1640 称为不完全培养液。它不仅包括了细胞生长所需要的基本营养物质，如维生素，氨基酸，糖。还含有细胞生长所必须的维生素，矿物质。 其他的一些人工合成的培养液如DMEM，TC199，Eagle's MEM 等也都含有细胞生长所需要的营养物质。但是这些人工合成的培养液，在使用的时候，仍然需要加入一些天然的营养成分，比如人和动物的血清，血浆等。常用的有胎牛血清（fcs）或者新生牛血清（Ncs），他们都含有多种促细胞生长因子，和多种脂溶性维生素，某些微量元素等，这些都是细胞生长所需。常用的血清含量为10%-20%. 我个人的经验认为，你要想让细胞多多的繁殖，含量就多些。这样细胞吃饱了，生长和繁殖才会很好的进行。
okt3，okt8 ，okt4 其实就是抗cd3单抗，抗cd8单抗，抗cd4单抗 。是做单克隆抗体得到的，具体如何制备，请看有关单克隆抗体制备方面的资料。我用的是别人做好的，自己也没有制作过。要是你做，我很想得到一些现成品，嘿嘿，不知道可不可以啊？？
mtb-ag 就是结核杆菌低分子多肽，它能特异性的刺激gama-delterT 细胞增殖，是将结核杆菌高压后得到的上清（具体操作略）我们曾经做过检测，在不同人的未活化的pbmc中，gama-delter T 细胞比例在5%左右，用mtb-ag刺激活化后7-14天，gama-delter T 细胞的比例明显升高高，最多达到95%。
如果你需要知道如何制备mtb-ag，请过几天。
作者: duoduo    时间: 2012-10-22 15:37


大家看看我培养的人的t细胞
看到那个克隆就说明t细胞培养成功了，嘿嘿
我分别用的是okt3 和mtb－ag刺激培养的

mtb-ag活化后形成的菊花样克隆


图片附件: 18138746.jpg (2012-10-22 15:37, 33.34 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14012

作者: duoduo    时间: 2012-10-22 15:37


还是mtb-ag刺激的，大家注意那长长弯弯的细胞，那就是活化后的淋巴细胞，怎么样？是不是和静止的时候差别很大？？


图片附件: 80298294.jpg (2012-10-22 15:37, 37.73 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14013

作者: duoduo    时间: 2012-10-22 15:38

okt3刺激形成的克隆群～～


图片附件: 90162670.snap.jpg (2012-10-22 15:38, 75.78 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14014

作者: 3648755    时间: 2012-10-22 15:38


哪位能不能讲讲贴壁细胞的状态情况？特别是293细胞。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:39



QUOTE:
原帖由 3648755 于 2012-10-22 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哪位能不能讲讲贴壁细胞的状态情况？特别是293细胞。

老实说，我们这一直是做淋巴细胞，其它的细胞没有太多经验。

不过你可以试试在论坛里面“搜搜”，也就是：点击页面上方“Search"，用“贴壁细胞”为关键词，定会让你眼前一亮。

有点耐心，试试吧。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:39

还是mtb-ag刺激的，大家注意那长长弯弯的细胞，那就是活化后的淋巴细胞，怎么样？是不是和静止的时候差别很大？？

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看看下面的图，对比更明显。
第一张，静息
第二张，活化

图片附件: 26595970.jpg (2012-10-22 15:39, 22.89 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14015

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:39

这张 是活化的，肺炎双球菌激活的T细胞。

图片附件: 10161649.jpg (2012-10-22 15:39, 42.95 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14016

作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:40


活化后，T细胞会伸出许许多多“手臂”样伪足，抓住抗原性物质，再使出十八般武艺，用各种各样方法消灭“非己”势力。

（这两张图是我从“免疫学信息网”上搜来的。）
作者: mickeylin    时间: 2012-10-22 15:40

看过之后感受颇多，谢谢你的贡献，太无私了！
我正在养晶状体上皮细胞，看过图后大致知道自己的细胞养成何种档次了
作者: jkobn    时间: 2012-10-22 15:40


相关疾病：
肿瘤
我养的肿瘤细胞YAC-1经常遇到奇怪的现象，当我换液1天内细胞都很好，但是两天就开始有楼主那张too bad照片上的细胞了，细胞缩小，能看到原先细胞膜的形状，六小时后就基本都是小细胞了，不知道是什么问题，已经反复很多次了...搞的我心力交瘁...
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:41

我养的肿瘤细胞YAC-1经常遇到奇怪的现象，当我换液1天内细胞都很好，但是两天就开始有楼主那张too bad照片上的细胞了，细胞缩小，能看到原先细胞膜的形状，六小时后就基本都是小细胞了，不知道是什么问题，已经反复很多次了...搞的我心力交瘁...

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相关疾病：
肿瘤

不要紧张，可能你的细胞增殖很快（肿瘤细胞大凡都有这样的特性，看看源一兄发的帖子，就会知道什么叫“疯长”了）。

我们的细胞也是肿瘤细胞系，1640/10％NBS, 至少一天换一次(一开始，按别人的建议两天换一次，结果损失惨重)。

建议你，
1. 先摸摸在你们实验室，YAC-1细胞的倍增时间（最简单的方法是：分时间点，作细胞计数）。
2. 尝试缩短换液时间，注意不要等到培养液有“浑浊感”才换，那时细胞浓度太大，代谢废物累积太多，很不利于细胞生长。
3. 比较不同浓度，不同换液时间间隔，哪种细胞状态最好。

耐心摸索吧，但愿你的细胞能快快好起来。
作者: ladyhuahua    时间: 2012-10-22 15:41

同意楼上的意见。
我只养过悬浮细胞，体会是勤换液，控制细胞量（宁少勿多）。
如果细胞状态总是调不好，索性重新复苏吧。
作者: loli    时间: 2012-10-22 15:42

很好，我培养的是BHK-21细胞，生长状况不好，昨天培养基的颜色很红，今天重新配了培养基，正在观察之中，
主要还是消化的时间难以控制
作者: TNT    时间: 2012-10-22 15:42

我养的肿瘤细胞YAC-1经常遇到奇怪的现象，当我换液1天内细胞都很好，但是两天就开始有楼主那张too bad照片上的细胞了，细胞缩小，能看到原先细胞膜的形状，六小时后就基本都是小细胞了，不知道是什么问题，已经反复很多次了...搞的我心力交瘁...

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偶也在养YAC-1，说些体会吧
刚刚复苏时很好，但是过2－3天就急转直下乐，细胞开始变小，破裂，状态非常的差
但是这个时候千万不要放弃，一是可以重新复苏细胞，二是坚持換液，注意要清洗细胞，还有必要的话把培养瓶换掉，因为瓶壁上已经有大量的细胞碎片和代谢物，这些一般对细胞生长不利的
另外就是细胞浓度不要太低，因为细胞，尤其是一些肿瘤细胞具有浓度依赖性，越是浓度低它越发不爱生长，偶是通过一个现象发现的，就是在培養液里有些小纤维时，细胞附着在纤维旁边生长的很好，越多越好，反而只有单个细胞的地方就越是不长。
看到自己挽救乐的细胞真的是HAPPY，祝你好运。
作者: TNT    时间: 2012-10-22 15:42


这是状态比较好的YAC-1


图片附件: 71657620.snap.jpg (2012-10-22 15:42, 30.68 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14017

作者: TNT    时间: 2012-10-22 15:43


这个是比较差的，可以看到壁上有黑色的细胞碎片
细胞大小也发生变化
有些细胞已经破碎

这时候离心，洗涤，耐心养，还是可以挽救的。

图片附件: 35999675.snap.jpg (2012-10-22 15:43, 21.87 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14018

作者: yes4    时间: 2012-10-22 15:43

看了你和各位战友的帖子真是收益非浅，对于培养悬浮细胞的初学者非常有用，建议可将标题改为“悬浮细胞培养经验交流专题”
最近在培养THP-1细胞（单核细胞株），因是新手目前细胞状态仍让我担心。刚开始从细胞库拿回时，细胞状态还行，回来传代1天后，就有不少细胞变小皱缩，镜下看细胞大小不一很不均匀，高倍镜下看细胞内有许多成团的小颗粒，核颜色深。已快半月下来，镜下看虽仍有好多活细胞，但数量离传代的标准还不够，培养液的颜色几天也没变黄。细胞这样半死半活的真让我着急（买细胞花了我近1千）。今天才看见上面的帖子，希望能救回自己的细胞。
也请有培养THP-1经验的兄弟多提供宝贵经验。
作者: nn255    时间: 2012-10-22 15:43

不知你是否用PERCOLL之类分的，如果是，吸出中间一层后，离心转速稍大一些，时间稍长些（3000RPM，15MIN），离心后后不要直接倾倒，用吸管自上至下吸去1/2或2/3，振匀再补满PBS再离一次。你试试看吧
作者: daod    时间: 2012-10-22 15:44


有境界，向你致敬。请教一下：用96孔板培养悬浮细胞必须用U形底的吗？平底板为什么不可以？
作者: ha111    时间: 2012-10-22 15:44


神经元培养HEPES在1L培养基中加入3.745g，谷氨酰氨是330mg/L，可以用三蒸水或DMEM配置。用时用滤器滤一下即可。 0票
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作者: 831226    时间: 2012-10-22 15:44


各位前辈好！本人现养着U937细胞，用1640+15%血清，可细胞总是在复苏的第3天以后开始出现大片的死亡（复苏后第一次换液时看着还挺好），也没见明显污染，特纳闷。特请高人指点迷津，谢谢！
作者: 831226    时间: 2012-10-22 15:45


再请问一个问题：
我的Raji细胞状态有些差异，一个培养瓶里，既有菊花样大克隆，又有3~5个细胞集在一起的小克隆，还有很多衰老变形（伸出小伪足）及死细胞，我现在做的离心换液好象无法改变这种状态。盼赐教！
作者: 66+77    时间: 2012-10-22 15:45

谢谢楼主，让我对细胞的好与不好有了直观 的认识，建议多贴一些细胞培养的照片给大家学习。我是做肝细胞培养的，如果有肝细胞的照片就更好了！
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:46

再请问一个问题：
我的Raji细胞状态有些差异，一个培养瓶里，既有菊花样大克隆，又有3~5个细胞集在一起的小克隆，还有很多衰老变形（伸出小伪足）及死细胞，我现在做的离心换液好象无法改变这种状态。盼赐教！

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Raji细胞是肿瘤母细胞，每一个细胞在适当的条件都可以增殖，一些细胞从大克隆群上掉下来，便会自成一体，“开辟新的王朝”，也就是一个新的小克隆。

我在培养中发现，一个非常大的克隆群，往往很快会出现大片“衰退”，失去立体感，透亮度减低，最终只剩细胞的残影。猜测：超大克隆群内部的细胞难以获得充足的养分，细胞之间的竞争抑制也是一个原因吧。

建议：每次换液吹打几次，防止超大克隆形成。

试试看吧，或许有帮助。
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:46

我觉得那些3~5个细胞成的小团看上去状态要好些，能否收集这部分细胞呢？因为目前这种参次的状态细胞生长缓慢，那种超大克隆也总导致很多死亡细胞。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:47

我觉得那些3~5个细胞成的小团看上去状态要好些，能否收集这部分细胞呢？因为目前这种参次的状态细胞生长缓慢，那种超大克隆也总导致很多死亡细胞。

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我的经验也是小克隆好些，但只收集小克隆会损失很大。若你的细胞若长得快，不在乎丢掉一些的话，当然可以。
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:47


Raji细胞的培养除了1640里的谷氨酰胺，是否还需加大谷氨酰胺的量，如果需要，这个量又该加多少？另：在哪可以买到这种谷氨酰胺？
谢谢！！
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:48



QUOTE:
原帖由 mimili_901 于 2012-10-22 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Raji细胞的培养除了1640里的谷氨酰胺，是否还需加大谷氨酰胺的量，如果需要，这个量又该加多少？另：在哪可以买到这种谷氨酰胺？
谢谢！！

我在前面详细写过，这里再贴一次不吧
我们的配方是： (2x1000ml)
RPMI Medium 1640, 10.4g, 2x1袋
L-Glutamine, 2mmol/L, 2x300mg
2-Mercapto-ethanol, 50umol/L, 2x3.9ul
Pyruvic acid, sodium salt, 1mmol/L, 2x110mg
Hepes Free acid, - 2x1.5g
Sodium bicarbonate, - 2x1.5g
Gentamyoin sulfate injection,50 U/ml, 2x50000 U
DDW ==>2x1000ml
pH ==>7.2
立即，0.22um 滤菌==>==>4度密封保存
用前加10%NBS。
一到两个月，需要往保存的1640中加原量的L-Glutamine（分解了）。

我们的前辈，是个超级细胞高手，强烈推荐所有试剂都用进口的（特别是前四个）。

我们用的很好，不知在你们那怎样，试试吧。
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:48


想请问：
前面列的那些照片都是什么细胞？想看看你的RAJI长啥样？
谢谢！
作者: whitesheep    时间: 2012-10-22 15:48


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楼主,我想请教您一个问题.我最近养了293细胞.但生长状态不太好,我不知道如何来进行调整.
如果是贴壁比较牢靠的细胞,生长状态不好的话,我们可以采用胰酶消化筛选的方法来调整细胞的状态.就是用较低浓度的胰酶轻轻消化一下,将液体吸出后,然后加入培养基和血清,不传代.这样,贴壁不紧的细胞就会被淘汰,经过几轮这样的处理后,就能得到状态好的细胞.但是,293细胞属于贴壁不牢的细胞,因此,用这样的方法处理的话就不妥了.不知道应该用什么方法来调整状态?请给予指导.谢谢了!
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:49

前面列的那些照片都是什么细胞？想看看你的RAJI长啥样？
谢谢！

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我在第一页贴的图，全是Raji细胞。

不好意思，最近实在太忙，今天才看到你的帖子。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:49

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楼主,我想请教您一个问题.我最近养了293细胞.但生长状态不太好,我不知道如何来进行调整.
如果是贴壁比较牢靠的细胞,生长状态不好的话,我们可以采用胰酶消化筛选的方法来调整细胞的状态.就是用较低浓度的胰酶轻轻消化一下,将液体吸出后,然后加入培养基和血清,不传代.这样,贴壁不紧的细胞就会被淘汰,经过几轮这样的处理后,就能得到状态好的细胞.但是,293细胞属于贴壁不牢的细胞,因此,用这样的方法处理的话就不妥了.不知道应该用什么方法来调整状态?请给予指导.谢谢了!

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你在养293？ 太好了，我可能下周也要开始养，还要希望多多交流！

你知道293， HEK293, HEK293 T, 还有293 T到底有啥区别？哪种可以做包装细胞？ 我有点胡涂。。。
作者: zwsyrt    时间: 2012-10-22 15:49

楼主的耐心真是厉害，看来是妹妹无疑了。
如果淋巴细胞分不出来，到底是怎么回事呢？明明出现了pbmc层，可吸取后再一离心，就什么都没有了，只有点点的细胞，真是郁闷啊。

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你是不是离心后倒上清时倒的太厉害把细胞都给倒掉了？倒上清速度不能快，而且一次成功，不能反复。你可以把你倒出的液体收集起来看看里面是不是有细胞。
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:50

我在第一页贴的图，全是Raji细胞。

不好意思，最近实在太忙，今天才看到你的帖子。

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一个星期前，我的RAJI也有这么漂亮，可是昨天一场污染，全毁了，真是让人伤心欲绝。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:50

不要难过，污染在所难免，我也有惨痛经历!!!
尽快重新复苏吧。

想尽办法拯救，往往费时费力，还不得要领。
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:51

各位前辈好！本人现养着U937细胞，用1640+15%血清，可细胞总是在复苏的第3天以后开始出现大片的死亡（复苏后第一次换液时看着还挺好），也没见明显污染，特纳闷。特请高人指点迷津，谢谢！

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你复苏后的情况,再详细说说.

U937细胞是很好养的.我用的是RPMI+10%FBS.隔天继代一次.
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:51

不要难过，污染在所难免，我也有惨痛经历!!!
尽快重新复苏吧。

想尽办法拯救，往往费时费力，还不得要领。

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我的悲惨在于当时用的是试验室的最后一瓶RAJI，自己养起一大堆后，用同样的方法冻存，现在一株也复苏不起来了，因为当时想着一股气把试验做完，却没考虑到冻存上的问题，哪料来这场不测风云，怎么向老板交代啊？
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:52

你复苏后的情况,再详细说说.

U937细胞是很好养的.我用的是RPMI+10%FBS.隔天继代一次.

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难道是我们试验室冻存的U937有问题？我取出来的都是2003年冻的，不知道还行吗？
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:52

难道是我们试验室冻存的U937有问题？我取出来的都是2003年冻的，不知道还行吗？

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很有可能细胞在冻存时状态已经不是很好.我之前用别人冻存的细胞也出现过这样的问题.

另外,2003年的细胞是冻存在液氮还是-80度.如果是液氮中是没问题的,如果是-80度就会受影响.-80度超过三个月就不太容易复苏,起码要花上两三周细心照料,不时的换液才能长好.
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:53


倒是冻在液氮中的，不过今天听一个师姐说他们当时冻的时候细胞好象不太好！这下完了。
作者: tangxin_80    时间: 2012-10-22 15:53

我的经验培养液中L-Glutamine两周就有问题，比较难养的细胞最好用时再加L-Glutamine。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:53

请问视野中央附近那个细胞上的“泡泡”是什么呀？我的细胞老有那个，不碍事吧？

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在高倍镜下，你会清楚的看到RAJI细胞表面有些突起，且这些突起常常是会“动”的。（你说的“泡泡‘就是这些’突起”，应该没问题的）
哪天我把手上“舞动的RAJI”的图片整理一下，开个新贴，再详细介绍。
作者: tangxin_80    时间: 2012-10-22 15:54


经验之谈啊!对我帮助很大,谢谢了!我也要准备培养细胞 了.
作者: qqq111    时间: 2012-10-22 15:54

前段时间养的raji 细胞长得挺好，自己冻存了两批，可现在总是复苏不活，不知是什么原因？冻存和复苏有什么特殊要求吗？请楼主及各位高手指点！谢谢！
作者: vcve    时间: 2012-10-22 15:54


看了你的图片，才知道那些大个子原来是好的细胞，我以前以为是细胞肿胀，快死了
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:55

前段时间养的raji 细胞长得挺好，自己冻存了两批，可现在总是复苏不活，不知是什么原因？冻存和复苏有什么特殊要求吗？请楼主及各位高手指点！谢谢！

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我新开了一贴，专门介绍细胞冻存、复苏时的注意事项，及其解决发法。
链接：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1322275&sty=1')

希望有帮助，祝好运！
作者: mimili_901    时间: 2012-10-22 15:55

是啊，在这学到不少，也得到很多鼓励和帮助，也许就是这么多的关心，我的RAJI现在又起死回生了，这次我也不敢大意了，小小心心的冻了几管，复苏还不错。
我这次用的冻存液是血液科用来冻存干细胞的，只不过过了期，不能用在人身上，它的配方是DMSO10ML，羟乙基淀粉（HES）12G，和生理盐水配成68ML溶液，室温保存，用时加入25%的人血清白蛋白（我没有白蛋白，直接就用的小牛血清），如上配好后，与等量的1640吹悬的细胞混合即可。
这种冻存液按说明是可以不需程序降温，直接就可以扔进-80度，不过我还是谨慎点，从-20——气相液氮——液相液氮。
作者: 穿越时空    时间: 2012-10-22 15:56


这种方法好象比我们的麻烦，希望效果更好。
我们使用普通的配方：1640MSO:NBS=4:5:1,
厚壁泡沫塑料盒，-80度24h，入液氮。

效果一向不错，但是需要注意一些细节的处理！
（有兴趣的话看看cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1322275&sty=1')，希望有帮助）
作者: KGZ564    时间: 2012-10-22 15:56


说道细胞培养污染的问题，其实每个环节都有可能增加污染的可能性和影响细胞培养效果。就离心而言，我一般都是500rpm离心3分钟，而后在超净台用酒精棉球擦拭玻璃离心管表面，在有就是毛吸管尽量使用一次操作，避免连环污染



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