分析测试百科

标题: 【求助】救救我的THP-1细胞吧！已附图片 [打印本页]

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:46 标题: 【求助】救救我的THP-1细胞吧！已附图片

从上海买回THP-1（单核细胞株）细胞已近一月，细胞状态越来越差，到现在还不能冻存。开始买回时，细胞还可以，可等我第一次传代后，细胞状态就不好了，细胞大小不一，碎片较多，还有许多成团，胞核内好多颗粒，而且细胞生长很不均匀，总是培养瓶底有一片细胞密密麻麻，而周围却稀稀啦啦，我开始总想等铺满瓶底再传代，可细胞总是长不满，而且培养夜颜色也几天不变黄。由于是悬浮细胞，现在培养瓶内细胞碎片越来越多，状态也越来越差，好多死的细胞团快。最近在高倍镜下看培养瓶内有很小的做布朗运动的颗粒，不知是否黑胶虫感染，但几天下来也没有明显增多。
唉，实验还没开始，800元买来的细胞就要玩玩，不知该如何向老板说，急死了。
不知哪位南京附近的朋友在养THP-1细胞，能否送我一瓶，救救我啊！
另：我有血管内皮细胞株、大鼠肾脏系膜细胞株可以交换啊！

作者: idea2011 时间: 2012-10-23 13:47

你把细胞好好洗洗，注意你选用的培养液是否最适合该细胞，在检查你所有的用液、器械是否无菌等。不知对你有无帮助。

作者: mysmdbl 时间: 2012-10-23 13:47

你的细胞应该是悬浮细胞吧
那你不要单纯看培养液的颜色情况，而是及时换液，一般不要超过3天，否则尽管液体不黄，但同样没有什么营养，那样的话细胞碎片会越来越多

近在高倍镜下看培养瓶内有很小的做布朗运动的颗粒，不知是否黑胶虫感染，但几天下来也没有明显增多。（这许多细胞都有，细胞密度大不明显）

还有就是你的培养液问题血清质量及浓度合适否，浓度不能太低，否则长的很慢
买来的时候是否用原带来的培养基养一段时间？

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:48

我是买回后第二天传代的。
可现在我的细胞已经无法达到冻存的要求，我也查了好多文献，试了好多方法，可瓶内的细胞数量越来越少，变大破裂的细胞增多，我想是没救了，再买一株也要600元，唉不知该如何是好了，
哦，我是按照细胞库的要求配的培养基：1640里面添加hepes、碳酸氢钠、2－巯基乙醇、丙酮酸钠，10％FCS,不过原来细胞库用的血清是进口的，而我回来后用的是杭州四季青的（经56度灭活补体），不知血清是否影响。
不知有没有正在养THP-1细胞的朋友，给点建议，THP-1是否真的很骄气？
能否发点图片看看？
急盼！！！

作者: yes4 时间: 2012-10-23 13:48

你去搜gogogo发的帖子,可能会有点帮助.
另外,既然这么贵的细胞,还是用进口血清好一些.

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:48

有没有培养THP-1细胞的战友把THP-1的图片发给我看看啊，急啊！

作者: owanaka 时间: 2012-10-23 13:49

[img][/img]

图片附件: 13642778.jpg (2012-10-23 13:49, 40.35 KB) / 该附件被下载次数 33
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14043

作者: owanaka 时间: 2012-10-23 13:49

PMA刺激后[img][/img]THP-1要用好的进口血清！国产的不行。不要丧失信心，改用好的血清，最好1640也用进口配好的，多换几次液，会好转的

图片附件: 44013115.jpg (2012-10-23 13:49, 43.39 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14044

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:50

太谢谢了。唉，当时就是因为节省金费才没舍的用进口的血清。不知到现在换还来的及吗？今天看了一下，几个培养瓶里总是中间一小块细胞比较多，但高倍镜下看细胞已经比较老了，而且已近7天没传代了。不知希望如何。看了你的图片很是羡慕，请问你用的是何种血清？你是如何换液的？一般几天就可以铺满瓶底了？
l我的细胞前后拿回来已一月，还没有冻存，现有培养瓶里的比较老了再用进口血清不知能回复状态吗？

作者: ffooll 时间: 2012-10-23 13:50

离心，把细胞放在24孔板中，使细胞密度增大。

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:51

今天联系了好几家代理公司，因该死的疯牛病进口血清进步来。
看来只能死马当活马医了。如果我想转移到12孔板，如何做呢？看来要离心了？我真害怕啊，屈指可数的几个活细胞能耐受马？
低速离心1000r/m,5mim,该没事把？

作者: qhyu 时间: 2012-10-23 13:51

有一个办法可以一试：
制备小鼠腹腔巨噬细胞，然后铺在96孔板中，密度高一些，大致以铺满75%左右合适(制备巨噬细胞的方法参考相应的书)。过夜后，用培养基洗巨噬细胞一遍。然后把你的细胞极限稀释，加入到含有巨噬细胞96孔板中，你的细胞1－2个/孔。
注意事项：
1.这个实验费的细胞很少，所以不影响你的其它实验；
2.如果想提高成功率，可以做2－3块板，如果想把细胞做成单克隆，可以把细胞再稀释；
3.此实验顺便可以除去你的污染的可能性，所以，你的实验用品尽量绝对无菌；
4.96孔板周边36孔不加细胞，因为周边孔细胞生长状态不好，但是需加入200ul的液体。
5.好一些的培养液，大致用点20%的胎牛血清吧。谷氨酰胺加足量了。
好了，好像罗嗦得够了。我曾经用这个办法成功地挽救过好几株濒临灭绝的细胞株和污染的细胞株。希望你能成功！

作者: owanaka 时间: 2012-10-23 13:51

建议楼主将您的细胞照片发出来看看，到底是污染所致还是别的因素。
增加小牛血清浓度。尽量挽救吧，不行我的细胞可以复苏给你。但是一定设法找到原因，否则给你的细胞也会完完的。

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:52

看到这么多战友帮助我，我觉得有愧啊，没把细胞恢复过来。
今天看细胞又变差了，瓶内留下大量的细胞残骸，高倍镜下看细胞核颜色变黑，细胞内布满了小颗粒。细胞周围的不停运动的小颗粒越来越多，如果是黑胶虫的话，但颗粒倒是有点亮，不黑阿。我想是不是因为污染影响了细胞生长。昨天给上海细胞所打了电话，说他们以前也用过国产血清，且细胞买回已过了半月，不能优惠啊。另因我们倒置显微镜不带数码相机，我会想办法发上来得。
我同时还培养了ECV-304、3T3L1细胞生长状态都不错，应该可以排除孵箱等问题。我想让我担心的是不是开始买回那天因铁路堵车，细胞培养瓶在我身上晃了近24小时，回来后开始没经验一会儿换液、一会儿离心把细胞折腾的够呛。
nixiao兄，看了你多次出手相助，真的非常感谢，如果方便的话，真的很奢望想从你那儿买瓶THP-1细胞。这次我会重新开始，换掉所有的培养试剂，我想在大家庭的关心下，我有信心养好THP-1的。

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:52

细胞图片×400，细胞之间的亮点在高倍镜下不停的运动，培养液不浑。

图片附件: 75400194.snap.jpg (2012-10-23 13:52, 18.71 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14045

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:53

细胞的残样，该没救了吧！×400

图片附件: 97881015.snap.jpg (2012-10-23 13:53, 28.04 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14046

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 13:53

建议楼主将您的细胞照片发出来看看，到底是污染所致还是别的因素。
增加小牛血清浓度。尽量挽救吧，不行我的细胞可以复苏给你。但是一定设法找到原因，否则给你的细胞也会完完的。

————————————————————————————————————————————————————————————————

owanka友，不知有没有看到我的细胞图片，没希望了吧？另外问一下，我按照细胞库的要求在1640里加了丙酮酸钠和葡萄糖、巯基乙醇，你认为有必要吗？哦，知道你是南医的该是我大师姐了，我是95的。
我怕我的细胞是没希望了，实验已耽误太长时间，真的可以从你那儿得到细胞吗！！渴望得到大师姐的帮助

作者: owanaka 时间: 2012-10-23 13:54

你同时养的其他细胞有此现象吗？黑胶虫现在争论不一，有人认为它对细胞没有严重影响。我没有遇到过。但是个人体会是，THP-1细胞还是挺顽强的，我的细胞曾受霉菌、细菌污染，只是细胞长的速度变慢，但形态还可以。曾经自己配的培养基有一批就是养不好，大约1周细胞就几近崩解，细胞内颗粒增多，类似你的样子。而培养基颜色外观没什么两样（怀疑是PH值的问题），换成另一批配的一周就能缓过来。所以，除了血清外，培养基很重要。所以后来我就买PAA的1640液体培养基（约120元/500ml ），加胎牛血清就可以直接用，比自己配的好很多。至于进口胎牛血清，南京生兴公司（不过这个公司办事有点差劲）及上海吉泰有，如HYCLONE、GIBCO、SIGMA的，价格1000元右。现在进口血清进不来，他们应该有些存货。
至于1640内加什么丙酮酸钠和葡萄糖、巯基乙醇，这些都不是非加不可的，我是什么都没加，后来抗生素都不加了。试着不加胎牛血清，细胞也能旺盛地活4天才开始表现为“衰败”。
我就这点小本事，不要跟我太客气。
有空可以MSN联系。
打算下周给你复苏细胞吧。但是你的培养基必须重配。

作者: dragonkilly 时间: 2012-10-23 14:32

看了你的帖子我有信心多了。其他的细胞里面也有，但因为贴壁细胞经常换液，所以不如THP-1细胞里多。

作者: DNA 时间: 2012-10-23 14:33

THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以尽量使用相同ph的1640，此外THP-1似乎不太适合长期冻存。

个人建议，传代后切忌常移出培养箱观察，一般THP-1生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后4天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增，然后用低速离心去除状态较差细胞，一般500转/m即可。

作者: DNA 时间: 2012-10-23 14:33

看上述的图片，细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。

作者: orangecake 时间: 2012-10-23 14:38

看到这么多人在养THP-1细胞，真是高兴啊。
去年年底我到处找THP-1细胞，没有人回答啊。
上海细胞库的老师告诉我，他们的THP-1细胞不太好，结果就没有给我，他们不是说要去ATCC重新引进的吗，怎么还是给你了。
THP-1细胞有人说是不好养，其实应该这么说的，但是有两个窍门，一是细胞的密度一定要高，ATCC上说不超过10的6次方每ML，相当高的密度，我的经验是5×10 5次方以上，增值的快。还有就是dna兄说的，THP-1细胞喜欢偏酸的环境，培养基的颜色黄得很快说明正在旺盛生长，要是老是换液，就不行的。
你的问题我也碰上过，当时和你一样着急，不是血清的事，杭州的血清不错的。培养基也没有问题的，不需要加ATCC上的其它东西细胞照样长得很好。你向你师姐要一支细胞吧，肯定能养好的，祝你成功！

作者: 园丁## 时间: 2012-10-23 14:38

很幸福呀，有这么多战友帮忙，羡慕呀～～～～～

从上面的帖子，我的一个感觉是：应该不是你的问题，而是细胞本身的事。

和老板说明情况，重新买一只吧。好运！

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 14:40

谢谢各位战友！
对比各位的意见，我想可能原因如下
1、培养液PH偏碱？配好的培养液放了几天就发现颜色偏碱，但没予注意
2、换液太勤：开始刚拿回来还没稳定时1~2天就换液，中间还离心换过液，结果越换越差
3、打搅太多：开始时着急不放心，几乎每天拿出来看看几眼，让细胞不得安稳休息生养
看来培养的细胞也随着培养者的心情变化啊，越是性急，越长不好。
好在群友已答应帮我，再次谢谢ownaka师姐！

作者: pengke1983 时间: 2012-10-23 14:45

我的THP-1细胞终于培养成功，现在我用国产的胎牛血清生长的也不错。

感谢所有关心过我的朋友！！

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)