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标题: 【求助】关于大脑皮层神经元的培养 [打印本页]

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 16:27 标题: 【求助】关于大脑皮层神经元的培养

各位高手，如何让培养的细胞均匀分散啊？我的细胞不是聚集就是分散很远，怎么办啊？

作者: xingyi08 时间: 2012-10-30 16:28

注意应该使用含EDTA的消化液，因为钙镁离子能够促进细胞黏附，同时加入1－4mg/ml的BSA，主要起隔离作用。另外，细胞消化不完全和消化过渡都会产生细胞成团，消化过渡与细胞内RNA、DNA释放以及剪切力有关。

作者: 园丁## 时间: 2012-10-30 16:29

楼上的意见很对呀!

可否将您在皮层神经元培养时的消化方法作一个较详细的介绍?

谢谢!

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:12

我用的是0.25%的胰酶消化。
具体是这样的：胎鼠取脑后剪碎，弃上清，加胰酶，在CO2孵箱中消化15分钟，每隔5分钟拿出吹打，然后钢网过滤。最后消化的几乎没有什么组织块了啊！细胞长的有很多是成团的，胞体聚集在一起，突起向外伸展，象刺猬一样！很难看！有的因为细胞太分散而无法连接，不爱成活。
最大的问题就是密度不均，真的要请各位多多帮忙啊！这个问题已经困扰偶好久了！大家多帮忙啊！小女子在这里先谢谢了！

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:12

另外消化过度和消化不完全怎么看啊？有没有什么可以观察的标准啊？

作者: 园丁## 时间: 2012-10-30 17:13

我用的是0.25%的胰酶消化。
具体是这样的：胎鼠取脑后剪碎，弃上清，加胰酶，在CO2孵箱中消化15分钟，每隔5分钟拿出吹打，然后钢网过滤。最后消化的几乎没有什么组织块了啊！细胞长的有很多是成团的，胞体聚集在一起，突起向外伸展，象刺猬一样！很难看！有的因为细胞太分散而无法连接，不爱成活。
最大的问题就是密度不均，真的要请各位多多帮忙啊！这个问题已经困扰偶好久了！大家多帮忙啊！小女子在这里先谢谢了！

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200目筛网过滤，

增加吹打次数，（吹打力度均匀，不要过猛。注意要把组织碎片都吸到管子里。）

作者: redbutterfly 时间: 2012-10-30 17:16

谢谢大家帮忙，看来很多问题只有靠自己的摸索了，没有什么定律的！

作者: nn255 时间: 2012-10-30 17:17

你的问题可能与多聚赖氨酸的铺板有关系，如果没有干或者积存太多，都有可能发生。还有我消化皮层时，是0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化37度30min，然后终止消化，缓慢吹打。细胞长的很好啊。

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:18

谢谢楼上，这个问题我真没有注意到，积存多的地方细胞就会聚集吗？你通常是培养之前什么时间铺板？然后怎么处理？我是提前二天铺，24小时后吸出，然后第二天培养，接种之前不再冲洗了。

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:19

已经贴壁的神经元细胞存活到第十天，用DMEM冲洗4遍（实验需要），细胞会丢失吗？

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:20

能不能把你的照片借我观赏一下？大脑皮层神经细胞最好的生长状态是什么样啊？谢谢！
如果你能发到我的邮箱，我将不胜感激！

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:21

消化后是不是应该一点胶状的物质都没有了？然后再用钢网过滤，我的细胞消化后，经钢网过滤后似乎还有一些胶状的物质，可是它是怎么通过钢网的呢？应该是细胞才能通过的吧？我用的是200目的钢网。

作者: 园丁## 时间: 2012-10-30 17:31

消化后是不是应该一点胶状的物质都没有了？然后再用钢网过滤，我的细胞消化后，经钢网过滤后似乎还有一些胶状的物质，可是它是怎么通过钢网的呢？应该是细胞才能通过的吧？我用的是200目的钢网。

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吹打完毕后，应该静止5min左右，待大块的组织沉淀后，吸取上面的细胞悬浊液进行过滤，而不是把所有的液体过滤！！

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:31

是啊，我是这么做的啊！可是在钢网已经过滤的下面还是会有很多胶状的物质呈锥形悬吊在钢网上

作者: bongte 时间: 2012-10-30 17:32

可能你吹打细胞太卖力了，一定要温柔对待细胞。你善待它，它就会善待你的。我吹打细胞的标准不是把组织吹的没有为止，而是见培养基有些混了，就可以了，因为这些细胞对我来说足够用了，不要贪多，会适得其反的。我养的是胎鼠皮层。一直没有来得及照照片，不好意思。

作者: bongte 时间: 2012-10-30 17:33

谢谢楼上，这个问题我真没有注意到，积存多的地方细胞就会聚集吗？你通常是培养之前什么时间铺板？然后怎么处理？我是提前二天铺，24小时后吸出，然后第二天培养，接种之前不再冲洗了。

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我铺多聚赖氨酸没有太长的时间，你作用的时间是不是长了呢，我的作用时间也就是10-20min吧，然后在超净台内吹干。一般前一天铺，第二天即可应用

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:33

我的也是胎鼠的皮层，你取材的时候有什么特殊的方法吗？有时候被膜剥的不是很干净，没有什么大的影响吧？

作者: bongte 时间: 2012-10-30 17:34

我想这个对于你的细胞可能不会影响不大，但是最好剥离干净，因为这样细胞会更加不纯的。

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-10-30 17:35

感谢，昨天做出了几张尼氏染色的片子，培养神经细胞的，有机会请指点一下。我们是战友，还请多多关照哦！

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