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标题: 【讨论帖】 Western blot问题解答专帖 [打印本页]

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:33 标题: 【讨论帖】 Western blot问题解答专帖

大家有什么问题可以回复本帖提问
我会尽快给大家答复。希望大家将问题描述的尽量详细一些

作者: qumm1985 时间: 2012-11-30 09:34

二抗如果特异性非常好，能不能不加BSA或奶粉呢？

作者: okhaha 时间: 2012-11-30 09:35

page 电泳时很容易出现“牵手”现象，如何改进！蛋白显影以后，会出现弥散状，而非界限十分清晰的条带，（放胶片时没有移动）是何故？难道是蛋白砖模过程中扩散了！

作者: zzzz 时间: 2012-11-30 09:40

问题同楼上，显影后会出现十分清晰的条带所谓的“杂带”，目的条带和内参都是这样的。谢谢~~

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:41

QUOTE:

原帖由 qumm1985 于 2012-11-30 09:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
二抗如果特异性非常好，能不能不加BSA或奶粉呢？

可以
二抗孵育时间一般孵育30min左右就可以了
但是最好还是在封闭体系中加二抗
good luck

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:41

QUOTE:

原帖由 okhaha 于 2012-11-30 09:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

page 电泳时很容易出现“牵手”现象，如何改进！蛋白显影以后，会出现弥散状，而非界限十分清晰的条带，（放胶片时没有移动）是何故？难道是蛋白砖模过程中扩散了！
...

蛋白量比较大
另外把分离胶凝固时间延长一点

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:41

QUOTE:

原帖由 zzzz 于 2012-11-30 09:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

问题同楼上，显影后会出现十分清晰的条带所谓的“杂带”，目的条带和内参都是这样的。谢谢~~

1，抗体质量不好，特异性不高
2，抗体的稀释比例不合适，要稀释一下

作者: loli 时间: 2012-11-30 09:42

之前有一批标本准备做冰冻切片免疫组化的，后来没做！
标本处理程序，4%多聚甲醛经心灌注，取闹后置于中性缓冲福尔马林中后固定20小时，置于梯度蔗糖脱水，后入-70保存，请问这样的组织能不能做Western?
只写！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:42

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原帖由 loli 于 2012-11-30 09:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
之前有一批标本准备做冰冻切片免疫组化的，后来没做！
标本处理程序，4%多聚甲醛经心灌注，取闹后置于中性缓冲福尔马林中后固定20小时，置于梯度蔗糖脱水，后入-70保存，请问这样的组织能不能做Western?
只写！ ...

没有处理过这样的样品
从WB的原理上来说应该是可以的

作者: 轰轰 时间: 2012-11-30 09:43

我ECL显色肉眼可观察到条带。我用柯达的胶片压片2分钟，显影1分钟，却没有条带。而且整张片子都是黑的。胶片是3年前买的，有问题吗。
另外，我在Western Blotting专题看到ECL直接成像的，也听说这种方法。不知如何操作，还是要特定的成像系统？

作者: applebook=213 时间: 2012-11-30 09:44

WESTERN电泳过后转膜失败求原因！
电极没反温度4度但就是没转出来（看不到MARKER）

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:44

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原帖由轰轰于 2012-11-30 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我ECL显色肉眼可观察到条带。我用柯达的胶片压片2分钟，显影1分钟，却没有条带。而且整张片子都是黑的。胶片是3年前买的，有问题吗。
另外，我在Western Blotting专题看到ECL直接成像的，也听说这种方法。不知如何操作，还是要 ...

胶片已经过期了
换新胶片
肉眼都能看到的条带最多压片30s
直接成像是需要真闷仪器的

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:45

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原帖由 applebook=213 于 2012-11-30 09:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

WESTERN电泳过后转膜失败求原因！
电极没反温度4度但就是没转出来（看不到MARKER）

说的具体点
电极没反，那么你的胶、膜的顺序呢？

作者: IAM007 时间: 2012-11-30 09:45

1.在蛋白印迹中，我是做大鼠脑组织的。在提取蛋白过程中，细胞裂解液和脑组织的克数要成比例吗？细胞裂解液液的配方是什么？我都见到好多版本！斑竹能否给个权威些的？还有各种蛋白酶抑制剂，像PMSF、EDTA、胰蛋白酶抑制剂等必须都要加吗？它们应该配多大浓度？
2.我用湿法转膜，所有的wattm滤纸，只要滤纸不破都可以长期使用吗？半干转就必须每做一次都要使用新的吗？
3.细胞裂解液提取蛋白后，有人说必须马上变性吗？但有人说也可以不变性，-70°冰箱能长期放，是吗？

作者: bring 时间: 2012-11-30 09:45

昨天做的WB,出现了跟前面一样的情况,肉眼观察到荧光,但是自动洗片后上面什么都没有,一片空白.胶片今年11才过期。不知道能否指点一下?
我们压片20min.

作者: ha111 时间: 2012-11-30 09:46

你好，我是提取水稻叶片中的蛋白，是用bradford方法定量的，但是用考马斯亮蓝染色后，条带不是很一致，老师说定量看Rubisco条带是否一致即可，但我想问的是，需要内参吗，比如actin抗体，这样是否更加能说明问题？
3个问题：1怎么样更好的定量
2是否需要内参，什么内参
3杂交是在常温下进行的吗

作者: ha111 时间: 2012-11-30 09:53

还有个问题，我的抗体放在-20度的冰箱1年了，还可以继续用吗，会不会降解了？

作者: tianmei001 时间: 2012-11-30 09:53

您好！我这段时间做western blot，按照“两张滤纸-NC膜-凝胶-两张滤纸”的顺序叠好三明治，然后胶向着负极，膜向着正极，100mA，2h，凝胶考染后，没有蛋白带，而NC经丽春红染色后，膜上没有蛋白带，这是怎么回事呀？另外我做过转膜时间梯度对比，100mA转膜40分钟，凝胶上marker残留部分，目的蛋白大部分都残留在凝胶里；转80分后，凝胶里残留一大分子量的marker条带，目的蛋白只有极少量残留。而NC膜经丽春红染色后，依然没有显示蛋白带。

我的电转移缓冲液是按照卢圣栋的《现代分子生物学实验技术》第二版上的方法配制，没有加甲醇。

请高手指教，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:54

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原帖由 IAM007 于 2012-11-30 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1.在蛋白印迹中，我是做大鼠脑组织的。在提取蛋白过程中，细胞裂解液和脑组织的克数要成比例吗？细胞裂解液液的配方是什么？我都见到好多版本！斑竹能否给个权威些的？还有各种蛋白酶抑制剂，像PMSF、EDTA、胰蛋白酶抑制剂等必须都 ...

1，我不知道你的目的蛋白是什么，怎么建议你配方？
2，一般选择组织重量：裂解液=1：9或者1：10，也就是1g组织加入9ml或者10ml裂解液
3，湿转滤纸我不建议重复使用，会有蛋白在上面
4，在-70度保存几个月没问题

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:55

QUOTE:

原帖由 bring 于 2012-11-30 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

昨天做的WB,出现了跟前面一样的情况,肉眼观察到荧光,但是自动洗片后上面什么都没有,一片空白.胶片今年11才过期。不知道能否指点一下?
我们压片20min. ...

这位群友，估计您胶片提前曝光了

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:55

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原帖由 ha111 于 2012-11-30 09:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我是提取水稻叶片中的蛋白，是用bradford方法定量的，但是用考马斯亮蓝染色后，条带不是很一致，老师说定量看Rubisco条带是否一致即可，但我想问的是，需要内参吗，比如actin抗体，这样是否更加能说明问题？
3个问题：1怎么样更好 ...

水稻用什么做内参我就不懂了
杂交一抗最好在4度

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:55

还有个问题，我的抗体放在-20度的冰箱1年了，还可以继续用吗，会不会降解了？

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做实验来确定
另外如果没有反复冻融的话应该没有问题

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:56

您好！我这段时间做western blot，按照“两张滤纸-NC膜-凝胶-两张滤纸”的顺序叠好三明治，然后胶向着负极，膜向着正极，100mA，2h，凝胶考染后，没有蛋白带，而NC经丽春红染色后，膜上没有蛋白带，这是怎么回事呀？ ...

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在转膜前你跑过SDS-PAGE染过吗？
如果没有
先染胶

作者: bgf5 时间: 2012-11-30 09:56

我接着做后续步骤，发现用DAB显色后，膜上可看到蛋白带。现在估计是丽春红染色一步出了问题。丽春红的配制方法是按照《分子克隆》的方法，
丽春红S储存液（10×）

丽春红S

2 g

三氯乙酸

30 g

磺基水杨酸

30 g

加水至100 ml。

用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液，使用后应予废弃。

染色5~10分钟，可是没染上颜色。后来上样量加大了一倍，还是没染上颜色，这是怎么回事呀？

作者: vcve 时间: 2012-11-30 09:57

蛋白Marker跑出来怎么总是少条带？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:57

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原帖由 bgf5 于 2012-11-30 09:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我接着做后续步骤，发现用DAB显色后，膜上可看到蛋白带。现在估计是丽春红染色一步出了问题。丽春红的配制方法是按照《分子克隆》的方法，
丽春红S储存液（10×）

丽春红S

2 g

三氯乙酸

30 g

磺基水杨酸

30 g

加水至10 ...

配方没什么问题
你用的是什么膜？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 09:58

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2012-11-30 09:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白Marker跑出来怎么总是少条带？

用的什么Marker？
胶浓度多大？
仔细看说明书

作者: bgf5 时间: 2012-11-30 09:58 标题: 回复 #26 wood533 的帖子

我用的是硝酸纤维素膜，蛋白marker凝胶染色后，条带是清晰的，但转膜后染色，最多就只能看到一根条带。有时什么条带都看不到。有时候目的蛋白能看到一两根较浓的带，现在不知道是marker的问题还是丽春红抑或者是膜的问题。希望楼主能帮我分析分析原因。我现在已经是焦头烂额了。谢谢了啊

作者: langlang 时间: 2012-11-30 09:59

我做western最近老是条带弥散或很淡抗体一年多了会不会是抗体过期了？另外那位做过免疫共沉淀电泳？谢谢！

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 09:59

最近在做western blot一直不顺利，从大鼠脑组织提取的蛋白，提取后即变性，-20度保存，最近的才半个月，上样量已经65微克，内参表达很强，可是三个目标蛋白一直没有条带，一抗全是进口的，有santa cruz的，abcam的，在有效期内，没有反复冻容，而且一抗浓度已经到了1：200，基本上是推荐浓度下限，仍然是空白一片。电泳转膜都没有问题，一抗孵育，25度，2个小时，二抗一个小时，愁死了，请大家帮我找找原因。
内参也经常是第一次压不出，再重新封闭，一抗，二抗走一遍流程就条带特别清晰了。目标蛋白同样两遍流程后还是空白一片，真是搞不懂？？？？？非常着急，请专家帮我分析一下，不胜感激！

作者: wsll 时间: 2012-11-30 10:00

我的实验中需要找出处理组和对照组的差异蛋白，用什么方法比较好？谢谢LZ。

作者: remenb 时间: 2012-11-30 10:00

请问：我的目的蛋白只有8kD,表达量少，不知道该怎么办？
我现在用Tricine-sds,16%
阳性对照也要压片一个小时才看的不是很清楚，用甘氨酸-sds就很容易

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:01

我用的是硝酸纤维素膜，蛋白marker凝胶染色后，条带是清晰的，但转膜后染色，最多就只能看到一根条带。有时什么条带都看不到。有时候目的蛋白能看到一两根较浓的带，现在不知道是marker的问题还是丽春红抑或者是膜的 ...

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第一：重新配置丽春红染色液
第二：检查转膜条件

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:01

我做western最近老是条带弥散或很淡抗体一年多了会不会是抗体过期了？另外那位做过免疫共沉淀电泳？谢谢！

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一年左右抗体如果没有反复冻融、保存条件得当是没有大问题的

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:43

最近在做western blot一直不顺利，从大鼠脑组织提取的蛋白，提取后即变性，-20度保存，最近的才半个月，上样量已经65微克，内参表达很强，可是三个目标蛋白一直没有条带，一抗全是进口的，有santa cruz的，abcam的 ...

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你的目的蛋白是什么啊
可能没有提取出来

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:43

QUOTE:

原帖由 wsll 于 2012-11-30 10:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的实验中需要找出处理组和对照组的差异蛋白，用什么方法比较好？谢谢LZ。

比较单个蛋白的表达差异还是整个蛋白组的差异啊
如果是某些特定的蛋白可以用Western
多的话可以用蛋白组学检测了

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:46

QUOTE:

原帖由 remenb 于 2012-11-30 10:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问：我的目的蛋白只有8kD,表达量少，不知道该怎么办？
我现在用Tricine-sds,16%
阳性对照也要压片一个小时才看的不是很清楚，用甘氨酸-sds就很容易

什么意思？
如果glycine-SDS很容易那你就用这个系统啊

作者: 66小飞侠 时间: 2012-11-30 10:47

我最近要测一批样品的脯氨酸含量及生物总碱的含量，样品量不超过3克。我想问一下测定这两种含量时，都需要提取。脯氨酸用5ml3%的磺基水杨酸沸水浴中加热10min，过滤，取滤液2ml然后显色测定。我想问之前样品需要烘干研碎吗？烘干的条件？我用茶叶试验了一下，想滤出2ml溶液有点困难，请问有没有好的过滤方法？还有就是生物碱的测定方法，我目前还没找到一个标准。急需！！谢谢指导！

作者: DNA 时间: 2012-11-30 10:47

请问下楼主，western blotting 用HRP标记的抗体，DAB直接显色法和常规ECL法能够检测到得蛋白灵敏度是多少啊，我如果用DAB直接显色能够检测到几个ng的目标蛋白吗？

多谢

作者: XYZQ 时间: 2012-11-30 10:48

洗完X光片后，发现条带和SDS-PAGE上的条带居然一样，没有出现特异性条带.连MARKer带都有。
请问PBS的pH是不是很重要，可能PH计不准确，导致PBS的PH不准，洗脱液没有把游离的一抗给洗掉，最终导致X光片是所有蛋白的印迹。
对于这种情况，请专家给我一些建议，谢谢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:48

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原帖由 DNA 于 2012-11-30 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问下楼主，western blotting 用HRP标记的抗体，DAB直接显色法和常规ECL法能够检测到得蛋白灵敏度是多少啊，我如果用DAB直接显色能够检测到几个ng的目标蛋白吗？

多谢 ...

具体多少ng我不清楚
ECL与DAB敏感性至少相差百倍

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:49

QUOTE:

原帖由 XYZQ 于 2012-11-30 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

洗完X光片后，发现条带和SDS-PAGE上的条带居然一样，没有出现特异性条带.连MARKer带都有。
请问PBS的pH是不是很重要，可能PH计不准确，导致PBS的PH不准，洗脱液没有把游离的一抗给洗掉，最终导致X光片是所有蛋白的印迹。
对于这 ...

pH很重要
抗体孵育的时候要有个稳定的pH环境

作者: u234 时间: 2012-11-30 10:56

楼主我做WESTERN BLOTING 时用ecl发光试剂胶片曝光显影，但是滴加ecl发光试剂时，整个pvdf膜都放光，最后胶片都是黑的，也见不到目的条带！请问是何原因？如何解决？谢谢

作者: dragonkilly 时间: 2012-11-30 10:57

我的蛋白在原核里表达的是单体，但是不知道在真核里是什么样的。据文献知道与它同源的蛋白在其他生物里都是多聚体，如何通过WB证明我的蛋白在真核里是几聚体。

作者: S6044 时间: 2012-11-30 10:57

我现在做蛋白纯化，跑PAGE电泳时，8%，10%以及12%的分离胶都只能得到一条带，而正常情况下应该都有两条，请问这是什么原因

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:58

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原帖由 u234 于 2012-11-30 10:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主我做WESTERN BLOTING 时用ecl发光试剂胶片曝光显影，但是滴加ecl发光试剂时，整个pvdf膜都放光，最后胶片都是黑的，也见不到目的条带！请问是何原因？如何解决？谢谢 ...

抗体有问题
另外增加洗膜次数

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:58

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原帖由 dragonkilly 于 2012-11-30 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的蛋白在原核里表达的是单体，但是不知道在真核里是什么样的。据文献知道与它同源的蛋白在其他生物里都是多聚体，如何通过WB证明我的蛋白在真核里是几聚体。
...

没做过这个
你查查文献

作者: wood533 时间: 2012-11-30 10:58

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原帖由 S6044 于 2012-11-30 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我现在做蛋白纯化，跑PAGE电泳时，8%，10%以及12%的分离胶都只能得到一条带，而正常情况下应该都有两条，请问这是什么原因

样品缓冲液用的是还原的还是非还原的？
非还原的打不开二硫键

作者: gogo 时间: 2012-11-30 10:59

请问：提取大鼠脑组织中的膜蛋白，如何能保证提取比较完全？同时还要提取酶？两种蛋白可以同时提取吗？等待回复！谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:00

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原帖由 gogo 于 2012-11-30 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问：提取大鼠脑组织中的膜蛋白，如何能保证提取比较完全？同时还要提取酶？两种蛋白可以同时提取吗？等待回复！谢谢！

膜蛋白的提取有专门的膜提取试剂盒或者采用RIPA强配方（如果目的蛋白丰度大的话）
你说的这种酶我就不清楚了
在细胞的那个位置？

作者: mickeylin 时间: 2012-11-30 11:03

WESTERN时,我不小心把蛋白MAKER加样电泳了,转膜后加一抗二抗显影后,居然在蛋白MAKER的那个条带,发现一条介于30~40KD的粗条带,请问是怎么回事,蛋白MAKER也可以加一抗二抗显影出来嘛?

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:03

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原帖由 mickeylin 于 2012-11-30 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
WESTERN时,我不小心把蛋白MAKER加样电泳了,转膜后加一抗二抗显影后,居然在蛋白MAKER的那个条带,发现一条介于30~40KD的粗条带,请问是怎么回事,蛋白MAKER也可以加一抗二抗显影出来嘛?
...

你用的是什么Marker？
看看Marker的背景信息
有些是可以显影的

作者: any333 时间: 2012-11-30 11:03

显影后杂带很多，目的带几乎看不到。（转膜一个半小时，加一抗封闭过夜效果也不好）。如何改进

作者: fsdd817 时间: 2012-11-30 11:04

我想请问：连续重复2次，都是白板（什么也没有，连b-actin都没有）。

这两次实验距离第一次成功的实验只有2个星期(抗体都是-20度存放的，且同学2天前用该抗体都成功了）

条件和原来做成功的一样（包括制胶，跑胶，转膜条件，抗体浓度），一抗b-acrin 是1：20000，二抗是1：5000。

蛋白也是第一次做成功提取的蛋白，但是这次连band都没有。（上次有band的）

不知道为什么连续2次什么都没有？

谢谢高手解答！不知道是哪个环节出错了？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:04

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原帖由 any333 于 2012-11-30 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
显影后杂带很多，目的带几乎看不到。（转膜一个半小时，加一抗封闭过夜效果也不好）。如何改进

把一抗浓度稀释一倍、两倍做预实验
上样量也可减小试试
如果还是不行就要考虑一抗的问题了

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:05

QUOTE:

原帖由 fsdd817 于 2012-11-30 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想请问：连续重复2次，都是白板（什么也没有，连b-actin都没有）。

这两次实验距离第一次成功的实验只有2个星期(抗体都是-20度存放的，且同学2天前用该抗体都成功了）

条件和原来做成功的一样（包括制胶，跑胶，转膜条件，抗体浓度），一 ...

操作上有没有问题啊？
另外你的样品冻融有几次？

作者: xue258 时间: 2012-11-30 11:05

我的阳性蛋白只冻融过一次，而且我的蛋白量是100ug。而待测蛋白是刚提的

会不会是所提的蛋白有问题呢？

谢谢！

作者: 101010 时间: 2012-11-30 11:06

你好:
我刚开始做western blot，结果用Quantity One凝胶分析软件拍的图像很暗，最后用数码相机拍照，请问怎么分析它的IOD值。谢谢！

图片附件: 09090313221521bdc88754eadc.jpg (2012-11-30 11:07, 550.95 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14252

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:07

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2012-11-30 11:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的阳性蛋白只冻融过一次，而且我的蛋白量是100ug。而待测蛋白是刚提的

会不会是所提的蛋白有问题呢？

谢谢！

一般10g左右beta-actin，beta-tubulin，GAPDH这三种常用内参都能检测到很强的信号
蛋白提取有没有问题咨询一下你身边的人

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:08

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原帖由 101010 于 2012-11-30 11:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好:
我刚开始做western blot，结果用Quantity One凝胶分析软件拍的图像很暗，最后用数码相机拍照，请问怎么分析它的IOD值。谢谢！

我以前用ImageQuant TL这个软件来读取IOD值
但是这个软件试用期只有14天
Quantity One好像要把图片变成白色背景，黑色条带才能读的
具体的你看看软件的使用吧

作者: bamboo16 时间: 2012-11-30 11:08

NMDA-NR2A和NMDA-NR2B的分子量各是多少，能不能在一张膜上同时检测这两种蛋白？加两种抗体

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:08

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原帖由 bamboo16 于 2012-11-30 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

NMDA-NR2A和NMDA-NR2B的分子量各是多少，能不能在一张膜上同时检测这两种蛋白？加两种抗体

分子量多少上网查啊
不能同时加两种抗体（如果两种一抗都是小鼠来源的单抗可以考虑）

作者: jkobn 时间: 2012-11-30 11:09

胶片显影是白片，连actin也没有任何条带，但丽春红染色可以看到蛋白质条带，前一天实验用同样的一抗和二抗可以看到条带。这次试验和前一次不同的是换了一瓶自己配的TBST，重复了一次还是白片。不知道这是什么缘故

作者: qianqin1977 时间: 2012-11-30 11:09

请问楼主：做western的酶的提取方法和测这种酶活性时的提取方法是一样的吗？提取做WESTERN的酶的方法有什么特别之处吗？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:10

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原帖由 jkobn 于 2012-11-30 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

胶片显影是白片，连actin也没有任何条带，但丽春红染色可以看到蛋白质条带，前一天实验用同样的一抗和二抗可以看到条带。这次试验和前一次不同的是换了一瓶自己配的TBST，重复了一次还是白片。不知道这是什么缘故
...

检测TBST的pH值

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:10

QUOTE:

原帖由 qianqin1977 于 2012-11-30 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主：做western的酶的提取方法和测这种酶活性时的提取方法是一样的吗？提取做WESTERN的酶的方法有什么特别之处吗？

测定酶的活性要求提取的时候蛋白不能变性
而WB提取蛋白的裂解液一般都会使蛋白变性，需要注意裂解液中的离子强度（有些WB的提取buffer能使提取出来的蛋白有活性）
欢迎继续交流
good luck

作者: qianqin1977 时间: 2012-11-30 11:10

了解了。另外如果文献上没有查到这种蛋白做WB的相应方法，应该怎么办？我的意思是这时候该用什么样的
裂液解液呢？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:11

了解了。另外如果文献上没有查到这种蛋白做WB的相应方法，应该怎么办？我的意思是这时候该用什么样的
裂液解液呢？

————————————————————————

查蛋白的在细胞中的定位

作者: tangxin_80 时间: 2012-11-30 11:12

我在做转膜的时侯用的Marker有六条带（14.4-97KD）,转移条件是湿转、恒压80v、2.5h。我用的电转仪是六一的40B型，电极间距离有8cm。转膜结束后Marker有间隔的三条带转到了膜上（不知道什么原因），丽春红染色液显示有目的条带。结果在做完免疫检测（HRP法，参考汪家政的《蛋白质技术手册》）后却没有条带，而且Marker的三条带也被洗掉了。

看到许多战友在帖子中提到转膜时要压紧，不知道应该进到什么程度？

另外我们如何确定转膜过程是否短路呢?看到有的战友提到在半干转时,可以让膜>= 滤纸> 胶在湿转时是否可行呢?

目的蛋白的上样量下限为多大呢？

请大侠帮忙分析一下，不吝赐教。

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:13

1，把胶、膜、滤纸弄好后可以用玻璃棒压紧即可，过分压紧会使胶破碎
2，湿转没有短路现象
3，目的蛋白上样量下限要看目的蛋白的丰度

作者: 66小飞侠 时间: 2012-11-30 11:16

我的目的蛋白是纯化后的，纯度应该达到80%-90%以上

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:16

纯化的蛋白上1ug左右足够了

作者: 小野花 时间: 2012-11-30 11:17

提取植物叶片膜蛋白的时候植物组织该如何处理？

作者: wmp1234 时间: 2012-11-30 11:17

你好，WB实验中有几个问题急需请教，谢谢：
1. 转膜后可以不用丽春红染色直接做下一步吗？
2.PVDF膜时间久了是否还能用？常温避光保存。
2. 用PVDF膜，转膜后预染Marker是否与用硝酸纤维素膜一样显示在膜上？我用PVDF转膜后预染膜上没有显示，但染色后显示转膜成功。
3. 洗膜必须用TBST吗？可以用PBS-Tween吗？我看到有的就用PBS-Tween，没用TBST。
4.ECL曝光时，膜基本全发光，曝光后胶片上膜的痕迹明显，且出现与考马斯染色相同的条带，什么原因？
期盼详细回复，再次感谢！

作者: 66+77 时间: 2012-11-30 11:18

请问楼主，如果我的脑组织样品是做了固定后的样品！是否可以用来做western，对结果的影响大否？谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:18

1，可以不染，染色只是检查转膜效果
2，看PVDF膜的保质期
3，一样能显示
4，TBST与PBST都可以，而且除了Tween-20以外，以前的文献中有用Triton X-100的
5，一抗与二抗浓度都太高，需要继续稀释抗体

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:19

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原帖由 66+77 于 2012-11-30 11:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主，如果我的脑组织样品是做了固定后的样品！是否可以用来做western，对结果的影响大否？谢谢！

可以
最近我正在看这方面的资料
我们可以探讨一下

作者: avi317 时间: 2012-11-30 11:19

请问一下楼主，我的sds-page和Western电泳结果泳道有大有小，可能是什么原因哪？

作者: whitesheep 时间: 2012-11-30 11:19

我在做ｓｕｒｖｉｖｉｎ，１６.５ＫＤ，半干转膜，２０ｖ，１０ｍｉｎ，转膜后看到膜下的滤纸上也有ｍａｋｅｒ了，是不是转过了？可是胶上也有ｍａｋｅｒ

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:21

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原帖由 avi317 于 2012-11-30 11:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问一下楼主，我的sds-page和Western电泳结果泳道有大有小，可能是什么原因哪？

相邻泳道上样体积与上样量不一致造成
上样孔大小不一致

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:23

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原帖由 whitesheep 于 2012-11-30 11:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我在做ｓｕｒｖｉｖｉｎ，１６.５ＫＤ，半干转膜，２０ｖ，１０ｍｉｎ，转膜后看到膜下的滤纸上也有ｍａｋｅｒ了，是不是转过了？可是胶上也有ｍａｋｅｒ ...

用0.22um的膜

作者: moonlight45 时间: 2012-11-30 11:23

western blot 第一种蛋白检测完后，第二种蛋白的检测时，膜的处理是什么谢谢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:23

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原帖由 moonlight45 于 2012-11-30 11:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

western blot 第一种蛋白检测完后，第二种蛋白的检测时，膜的处理是什么谢谢

1，如果把第一种目的蛋白检测后的抗体洗掉
用stripping buffer处理，之后步骤从封闭开始进行第二种蛋白的检测
2，如果不洗掉第一种目的蛋白
第一种与第二种目的蛋白之间分子量差别较大，可以用缓冲液洗去ECL等检测液，然后直接进行第二种目的蛋白的孵育与检测

作者: BOSS2011 时间: 2012-11-30 11:24

做western时，Affinity Purified和purified一抗哪种更好一些？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:24

要看抗体的亲和性及特异性了
有很多厂家抗体只用protein A或G纯化
不做亲和

作者: yonger 时间: 2012-11-30 11:25

请问版主我的蛋白是18kD的想用NC膜，版主经验什么牌子NC膜和三明治滤纸的性价比比较高？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:25

millipore，0.22um孔径NC膜，滤纸whantman 3MM

作者: BOSS2011 时间: 2012-11-30 11:26

一只抗体说是能同时做western和免疫组化，这样的多抗怎么样？会不会说做其中一个更好一点？Thanks a lot!

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:26

要看抗体的质量
有很多抗体是有很多应用的
没问题

作者: fox_79 时间: 2012-11-30 11:26

封闭时用BSA和牛奶有什么区别？如果要降低背景都有什么方法？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:27

1，多洗几次膜
2，较少二抗用量
3，在封闭体系中孵育一抗、二抗

作者: am10 时间: 2012-11-30 11:28

每次目的条带（55-70kD）可以出来，actin却经常做不出来，有时有两孔有很微弱条带，多数时候什么也没有，但是用一样的抗体也做出过很漂亮的条带，不知是何故？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:28

建议换新抗体
你现在用的抗体可能降解了

作者: c86v 时间: 2012-11-30 11:29

楼主，我想知道如何设计实验来证明小鼠的某条基因功能和人的某条基因的功能是一致的呢？

作者: 不请自来 时间: 2012-11-30 11:29

不小心用水稀释了脱脂奶粉
对封闭有没有影响啊

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:30

有影响啊
1，pH
2，缓冲体系中的试剂成分

作者: 火树银花nm 时间: 2012-11-30 11:31

请问楼主，我用的是湿转，350v，一小时，转移，用丽春红染色后不出条带，考染胶后，条带也清楚。总之，是没转到膜上去，是怎么回事啊？其他操作感觉很标准.

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:31

1，转膜缓冲液配制后预冷到四度
2，建议采用恒流 300mA（蛋白如果50K的话转移时间为1h，100K 1h30min；还要看胶浓度）
3，膜，胶之间要夹紧

作者: plaa 时间: 2012-11-30 11:31

是的抗体稀释可以使膜上的杂带看起来没有了，或者只会看见一点点。
但是这样能掩盖本质吗？
为什么会有特异性比较高的杂带呢？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:32

这是由于抗体非特异性造成的

作者: 66+77 时间: 2012-11-30 11:32

10楼，你的片子曝光了，换盒新的吧。

作者: zwsyrt 时间: 2012-11-30 11:33

1.WB的loading buffer孔显影有条带？
以前做的时候没有出现，最近出现了，不同的人做不同的东西，也换了loading buffer,但是依然有条带，可能是什么原因？
2.还有就是最近SDS-PAGE时，跑了几分钟后loading buffer总是从加样孔流下来，一直流到浓缩胶与分离胶交接处停止，跑分离胶的时候没有异常。

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:33

QUOTE:

原帖由 zwsyrt 于 2012-11-30 11:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.WB的loading buffer孔显影有条带？
以前做的时候没有出现，最近出现了，不同的人做不同的东西，也换了loading buffer,但是依然有条带，可能是什么原因？
2.还有就是最近SDS-PAGE时，跑了几分钟后loading buffer总是从加样孔流下 ...

loading buffer中混入了其他的蛋白
被污染了
建议重配试试

作者: ritou1985 时间: 2012-11-30 11:34

10%的分离胶大概一个小时能凝固,不过分离胶就要花很久2个小时有的时候甚至不凝,APS也是新配制的,还有
分离胶凝固完后拔梳子,每个孔之间都连在一起,境界不清晰,是不是胶没有完全凝固,还是梳子老化了呢?

作者: ritou1985 时间: 2012-11-30 11:35

啊哦！上面的贴子打错了,是分离胶正常凝,而浓缩胶凝固时间长或不凝

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:36

QUOTE:

原帖由 ritou1985 于 2012-11-30 11:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
10%的分离胶大概一个小时能凝固,不过分离胶就要花很久2个小时有的时候甚至不凝,APS也是新配制的,还有
分离胶凝固完后拔梳子,每个孔之间都连在一起,境界不清晰,是不是胶没有完全凝固,还是梳子老化了呢?
...

浓缩胶浓度低
多加入一些APS及TEMED

作者: wmp1234 时间: 2012-11-30 11:36

loading buffer 是新配的，
为什么会漏胶呢，就是跑胶的时候在浓缩胶里面，蓝色从一个孔漏到浓缩胶和分离胶的交界处。

作者: windy+++ 时间: 2012-11-30 11:37

我想用western blot测哮喘大鼠肺内T细胞中的Itk蛋白含量，如果直接用肺组织提总蛋白会不会丰度太低测不到？如果用淋巴细胞分离液先将肺泡灌洗液及肺组织中的淋巴细胞分出来再提总蛋白可以吗？这个过程中蛋白会不会降解？我是新手，实验还在准备，可能问题弱智了点。。。恳请前辈指导。

直接用肺组织提取蛋白

作者: windy+++ 时间: 2012-11-30 11:37

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原帖由 wmp1234 于 2012-11-30 11:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
loading buffer 是新配的，
为什么会漏胶呢，就是跑胶的时候在浓缩胶里面，蓝色从一个孔漏到浓缩胶和分离胶的交界处。

胶是不是破了？

作者: zhenxin 时间: 2012-11-30 11:41

在作GST融合蛋白纯化试验中，融合蛋白产量太低，（以至于在之后的Western Blotting中根本看不到条带）可能的原因是什么？请尽可能多列出几点

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:41

1、加GST阳性对照进行同步实验
如果GST阳性对照也不出来的话说明抗体有问题
2，你的二抗敏感性如何？

作者: H2O 时间: 2012-11-30 11:44

跑SDS-PAGE胶能破坏蛋白二硫键吗

作者: lxh031 时间: 2012-11-30 11:44

求 NC膜与PVDF膜的详细差异以及在转膜封闭及结合抗体操作步骤及浓度的详细数据

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:46

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原帖由 H2O 于 2012-11-30 11:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

跑SDS-PAGE胶能破坏蛋白二硫键吗

DTT及beta-巯基乙醇能破坏二硫键

作者: wood533 时间: 2012-11-30 11:46

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原帖由 lxh031 于 2012-11-30 11:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

求 NC膜与PVDF膜的详细差异以及在转膜封闭及结合抗体操作步骤及浓度的详细数据

建议你上Millipore网站或者Amershan网站搜索

作者: ero11 时间: 2012-11-30 11:53

请教下电泳时电压大小会不会影响到最后条带的大小呀？谢谢啦

作者: hustwb 时间: 2012-11-30 12:01

请教：我的实验目的蛋白分子量为45kD左右，所用抗体说明也是在45kD，可实验做出来见到的显带位置在40kD之下，要说Marker不准吧，GAPDH的位置可是对的。试了几次都这样。请高手帮忙看看Marker旁那个泳道的条带可不可能是目的蛋白？非常感谢！

图片附件: 0911140100ef6d08227f29f2e5.jpg (2012-11-30 12:01, 33.75 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14253

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:01

QUOTE:

原帖由 hustwb 于 2012-11-30 12:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：我的实验目的蛋白分子量为45kD左右，所用抗体说明也是在45kD，可实验做出来见到的显带位置在40kD之下，要说Marker不准吧，GAPDH的位置可是对的。试了几次都这样。请高手帮忙看看Marker旁那个泳道的条带可不可能是目的蛋 ...

会有影响
电压太大时会出现“笑脸”等情况

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:01

QUOTE:

没看懂你具体说什么意思
左边的是GAPDH？
右边是目的蛋白？
目的蛋白的条带像是在GAPDH的分子量位置

作者: hustwb 时间: 2012-11-30 12:35

没看懂你具体说什么意思？
问题就是：目的蛋白出现的带不在预计位置。

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:36

QUOTE:

原帖由 hustwb 于 2012-11-30 12:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没看懂你具体说什么意思？
问题就是：目的蛋白出现的带不在预计位置。

这个在问题在WB中很正常
目的蛋白条带特异就没有问题

作者: greenbee 时间: 2012-11-30 12:36

请问楼主，
1，封闭时候使用5%脱脂乳和使用BSA有区别吗？
2，脱脂乳用什么溶解？用TTBS可以吗？
3，一抗用什么溶解，脱脂乳封闭液还是TTBS？
4，一抗孵育过夜好，还是封闭体系2小时效果好？
5，化学发光得到的图像中除了目标蛋白的条带，还有很多比较浅的其他带，是什么原因？怎么消除？（不会是抗体特异性不好吧）
问题比较多，麻烦您了，谢谢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:37

1，有区别的，像CST公司抗体就推荐用BSA。另外有些特殊的蛋白，如磷酸化形式建议用BSA
2，可以用TBST
3，对，用奶粉-TBST或者BSA-TBST
4，我一般采用4度过夜，但是几个内参抗体我一般是RT1h
5，抗体特异性，减少曝光时间，降低ECL的敏感性

作者: langlang 时间: 2012-11-30 12:37

楼主真的懂得很多，佩服。我这一段也在做wb，做的是半干转移，bio-rad的仪器，恒压25v 遇见几次没有电流，不知道什么原因。还是用的原来的液体，感觉三明治装的大小也对，原来用的pvdf膜，后来换成nc膜也不行。最后又重新做了两次就莫名其妙的好了，想来想去找不到原因，不知道楼主遇见过相似的问题没？另外我用pvdf膜都要用100%甲醇泡半个多小时，结果也不是太好，不是说pvdf比nc好吗？我觉得还不如nc转得好。

作者: langlang 时间: 2012-11-30 12:38

另外我看网上写的转的时候恒压，电流是逐渐上升的。但是我每次都是逐渐下降，一块胶刚开始都有170多毫安，最后都能降到70多毫安。挣个过程电流都不是稳定。

作者: hold住 时间: 2012-11-30 12:39

我看我们同实验室的做western孵育1抗 2抗时都加了奶粉而我一般做的时候都不加请问一下加和不加有什么区别哪种效果好呢？谢谢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:43

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原帖由 langlang 于 2012-11-30 12:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主真的懂得很多，佩服。我这一段也在做wb，做的是半干转移，bio-rad的仪器，恒压25v 遇见几次没有电流，不知道什么原因。还是用的原来的液体，感觉三明治装的大小也对，原来用的pvdf膜，后来换成nc膜也不行。最后又重新做了两次就 ...

PVDF膜与NC膜的具体差别你可以查Millipore网站
你用原来的液体来转膜？
如果是这样的话问题应该就出现在这
转缓建议用新配

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:43

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原帖由 langlang 于 2012-11-30 12:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

另外我看网上写的转的时候恒压，电流是逐渐上升的。但是我每次都是逐渐下降，一块胶刚开始都有170多毫安，最后都能降到70多毫安。挣个过程电流都不是稳定。 ...

转膜我一般采用恒流

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:43

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我看我们同实验室的做western孵育1抗 2抗时都加了奶粉而我一般做的时候都不加请问一下加和不加有什么区别哪种效果好呢？谢谢

我采用的是加了奶粉的体系
我认为这样会降低背景及非特异性

作者: langlang 时间: 2012-11-30 12:44

我说的是用前几天配的液体。我做的是半干转，没有重复使用液体。转移缓冲液放一两个星期应该没有问题吧

作者: langlang 时间: 2012-11-30 12:45

请问楼主，考染的结果怎么确定分子量大小呢？我的是混合蛋白，跑出来条带比较多，并且有的在两个marker条带的中间。有没有什么软件可以分析某条蛋白条带的分子量呢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:45

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原帖由 langlang 于 2012-11-30 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主，考染的结果怎么确定分子量大小呢？我的是混合蛋白，跑出来条带比较多，并且有的在两个marker条带的中间。有没有什么软件可以分析某条蛋白条带的分子量呢 ...

考染只是看蛋白提取如何，不能定量
如果做定量要把你的目的蛋白纯化后才能进行
转缓建议新配使用

作者: yjf1026 时间: 2012-11-30 12:46

你好，我的是关于磷酸化蛋白的提取，要不要买磷酸酶抑制剂，之前我只用蛋白酶抑制剂提过，电泳也有条带，不知道是否影响实验的真实性

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:46

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原帖由 yjf1026 于 2012-11-30 12:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我的是关于磷酸化蛋白的提取，要不要买磷酸酶抑制剂，之前我只用蛋白酶抑制剂提过，电泳也有条带，不知道是否影响实验的真实性

一般情况下是要加磷酸酶抑制剂的
因为磷酸化蛋白含量一般较低
如果你能做出结果来应该不会影响实验的真实性

作者: yonger 时间: 2012-11-30 12:47

我知道酪氨酸磷酸酶的抑制剂是NaVO3，请问丝苏氨酸磷酸酶的抑制剂是什么呢？谢谢！另外，要长期保存做完western 的 PVDF膜以备以后再用，最好的方法是什么呢？

作者: remenb 时间: 2012-11-30 12:48

BSA封闭过的PVDF膜，TBST洗过后拿丽春红还能染吗？？
另外PVDF膜在封闭和一抗孵育的时候有没什么特殊要求？操作的时候要注意些什么？

作者: dongdongqiang 时间: 2012-11-30 12:48

辣根过氧化物酶标记的二抗，可以用氯萘酚做显色底物吗？这个是不是效率很低？另外样品中含有EDTA的话会不会影响它活性？哪些可以影响它活性的？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:49

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原帖由 yonger 于 2012-11-30 12:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我知道酪氨酸磷酸酶的抑制剂是NaVO3，请问丝苏氨酸磷酸酶的抑制剂是什么呢？谢谢！另外，要长期保存做完western 的 PVDF膜以备以后再用，最好的方法是什么呢？ ...

建议你用广谱的磷酸酶抑制剂，如Roche等的磷酸酶抑制剂cocktail
膜在-20度保存即可

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:50

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原帖由 remenb 于 2012-11-30 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
BSA封闭过的PVDF膜，TBST洗过后拿丽春红还能染吗？？
另外PVDF膜在封闭和一抗孵育的时候有没什么特殊要求？操作的时候要注意些什么？

封闭后的膜可以用丽春红来染色
但是不能染出条带来
没有什么特殊要求

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:51

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原帖由 dongdongqiang 于 2012-11-30 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

辣根过氧化物酶标记的二抗，可以用氯萘酚做显色底物吗？这个是不是效率很低？另外样品中含有EDTA的话会不会影响它活性？哪些可以影响它活性的？ ...

你说的这种方法好像是ELISA最后检测时用的吧
一般WB不会用这种方法
现在常用的是ECL
会影响HRP的活性

作者: wu11998866 时间: 2012-11-30 12:51

WB我是菜鸟~~~
想请教下，我要用WB鉴定自己纯化的一个蛋白的活性，一抗能不能直接用这个蛋白免小鼠后得到的血清？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:52

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原帖由 wu11998866 于 2012-11-30 12:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
WB我是菜鸟~~~
想请教下，我要用WB鉴定自己纯化的一个蛋白的活性，一抗能不能直接用这个蛋白免小鼠后得到的血清？

活性你想用WB来做啊？
如果你认为WB可以检测你的蛋白活性的话当然可以用这个蛋白去免疫小鼠做抗体（小鼠一般做单抗，多抗一般用兔子、山羊、大鼠）

作者: nn255 时间: 2012-11-30 12:53

您好我刚刚接触western 不太明白一抗.二抗的功能及原理拜托赐教一下喽十分感谢

作者: tie8 时间: 2012-11-30 12:53

先谢谢大侠，我想问一下，携带目的基因的质粒在大肠杆菌中表达后，筛选出阳性克隆，然后怎样才能得到目的基因表达的多肽呢？

作者: bamboo16 时间: 2012-11-30 12:53

版主，你好！我想做多巴胺D2受体，对于这种膜受体，应该用什么裂解液呢？能推荐几家国际知名公司的产品吗？大叔脑组织，和基因表达的HEK细胞，可以用同样的裂解液吗？望不吝赐教，万分感谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:56

QUOTE:

原帖由 bamboo16 于 2012-11-30 12:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

版主，你好！我想做多巴胺D2受体，对于这种膜受体，应该用什么裂解液呢？能推荐几家国际知名公司的产品吗？大叔脑组织，和基因表达的HEK细胞，可以用同样的裂解液吗？望不吝赐教，万分感谢！ ...

最好能用膜蛋白抽提试剂
也可以选择提取总蛋白的RIPA做预试

作者: star#room 时间: 2012-11-30 12:56

我从导师那里获得一些质粒，但是我不清楚这个质粒载体是pUC19还是pET32？请问我应该怎么设计实验去区别啊？还有就是怎么知道这个质粒载体是否含有外源基因？有的话，怎么确定外源基因的大小啊？我该怎么设计实验？谢谢了

作者: kuaizige 时间: 2012-11-30 12:57

我最近在做WB，显影时，看到整块膜都发亮，荧光很强，显影结束后，背景很深，而且条带也有弥散状，

不知道是什么原因？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:57

二抗浓度高
或者洗膜不充分

作者: 2541 时间: 2012-11-30 12:57

本人是做有机合成的，合成了一个荧光探针染料，想把它染到细胞里面，由于对动物细胞染色不十分了解，只是按照一方法来尝试，结果没有染进去。不只有没有别的办法？
我用的细胞是从生化组要来的，好像是肝癌细胞，操作时将我的染料用DMSO溶解（浓度为10-3 M）取5uM后，加入到1ml的细胞培养液中，染色10min后洗掉多余的染料，荧光显微镜观测荧光。
结果发现染料因为溶解性不好，没有溶解，更没有进入到细胞中，不知楼主能给点解决办法？染料在有机溶剂和水的混合溶剂（体积比4：6）中能溶解，
我的目的就是要将染料染到细胞内，活细胞最好，然后再加入金属离子来观测离子在细胞内的与探针的响应。
拜托了！！

作者: 大白菜 时间: 2012-11-30 12:58

同时做两组蛋白，电泳和转膜显影都是同样条件，一组是磷酸化的，一组是普通的，结果磷酸化得蛋白条带显影结果非常好，反而普通蛋白的内参一直处于不稳定状态，每次都会出现条带强度不一致，加样时很肯定都是混匀后取等量的蛋白，现在居然出现了V和W的畸形条带，百思不解，难道是蛋白降解还是挥发了浓度不均？亟待您的解答！不甚感激！

作者: 831226 时间: 2012-11-30 12:58

建议先跑SDS-PAGE染胶看蛋白定量误差如何

作者: 大白菜 时间: 2012-11-30 12:59

谢谢你的建议！我之前怀疑是定量误差的问题，可是重新定量了一次还是差不多，跑了一个多月了都是这样，简直无语。。。

作者: wood533 时间: 2012-11-30 12:59

通过内参WB预实验结果计算后可重新调整上样量进行后续的WB
这个太费事
你用什么定量方法？
建议用BCA

作者: yhz1973 时间: 2012-11-30 13:00

我做wb中，转膜后用丽春红染色后有条带出现，但封闭，一抗二抗孵育后，加DAB显色后，不能出现目的条带。不知什么原因？一抗是一老师的提取和纯化。他已经用过，应该没问题。

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:00

样品相同吗？
抗体是什么时候的？

作者: star#room 时间: 2012-11-30 13:01

你好，我刚接触WB时间不是很长，我想请教下做磷酸化蛋白有哪些需要注意的事项啊？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:01

1，要加磷酸酶抑制剂与蛋白酶抑制剂
2，封闭及稀释抗体用BSA
3，样品制备后尽快进行WB

作者: finger 时间: 2012-11-30 13:01

pvdf膜用ecl检测之后，如果想清除一抗和二抗但是保留蛋白，怎么处理？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:02

现在有商品化的stripping buffer（抗体清除液）
不过要选一家好用的才行

作者: 鹅鹅鹅 时间: 2012-11-30 13:02

显色时只有其中几个泳道有条带，或者有的泳道深有的泳道浅，是不是转膜的问题呢？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:03

1，转膜时有气泡
2，一抗孵育时速度过快、等照成孵育不完全
3，ECL孵育时用的量太少，孵育不充分

作者: bongte 时间: 2012-11-30 13:04

最近在做MBP标签的 western，一抗为国产的多抗，一抗稀释比为1：1000时出现非特异条带，好像考马斯亮蓝染色似的。一抗稀释比为1：800和1：500时，只有黑色背景，无目的条带。一抗都是4度过夜，二抗室温反应90分钟，曝光时片子都是压30分钟，请问楼主怎么改进啊？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:04

调整稀释比例试试
1：2000，1：4000，1：8000等

作者: 33号 时间: 2012-11-30 13:04

请问斑竹，怎样去鉴定提取的蛋白样品没有被降解？听有人说，通过跑电泳，看电泳条带是否“shape”,就能大致分析出蛋白样是不是降解，您觉得这个方法可行吗？可行的话，具体该怎么去看？谢谢！

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-11-30 13:05

菌蛋白如何保存，请指教！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:05

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原帖由 小鱼鱼 于 2012-11-30 13:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

菌蛋白如何保存，请指教！

你是指纯化后的蛋白还是未纯化的（在菌体中的蛋白）？
纯化后的蛋白可以保存在-70，或者冻干长期保存
如果还在菌体中，可以保存在-20或者-70长期保存

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:06

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原帖由 33号 于 2012-11-30 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问斑竹，怎样去鉴定提取的蛋白样品没有被降解？听有人说，通过跑电泳，看电泳条带是否“shape”,就能大致分析出蛋白样是不是降解，您觉得这个方法可行吗？可行的话，具体该怎么去看？谢谢！
...

目前还没有确切的方法来看提取的总蛋白降解如何
如果说降解非常严重了用SDS-PAGE染胶可能会看出来

作者: redbutterfly 时间: 2012-11-30 13:06

NC膜用一抗二抗孵育过了，但是没有药品没去显影定影，现在有药品了，我想请问一下之前孵育过的NC膜用什么方法可以处理一下，然后再重新和一抗二抗孵育啊？

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-11-30 13:07

我用PVDF做WB，不知道为什么老转过？
我用的转膜缓冲液配方：甘氨酸,14.4 Tris,3.03 甲醇 200ml ddH2O 定容至1L
我的目的蛋白~34KD，用的是12%的胶，100V转膜，1小时30分钟，转完后发现滤纸上有转过的Marker
谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:07

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NC膜用一抗二抗孵育过了，但是没有药品没去显影定影，现在有药品了，我想请问一下之前孵育过的NC膜用什么方法可以处理一下，然后再重新和一抗二抗孵育啊？
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重新加二抗孵育一次就可以

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:07

我用PVDF做WB，不知道为什么老转过？
我用的转膜缓冲液配方：甘氨酸,14.4 Tris,3.03 甲醇 200ml ddH2O 定容至1L
我的目的蛋白~34KD，用的是12%的胶，100V转膜，1小时30分钟，转完后发现滤纸上有转过的Marker
谢 ...

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Marker转到滤纸上很正常
不要在意这个
你要用丽春红等染膜，看蛋白条带

作者: ha111 时间: 2012-11-30 13:08

您好！我想问下，我在做多个蛋白样品中目的蛋白含量的比较，但是蛋白定量不是很准，内参老是不一致，有没有比较好的解决办法呀？谢谢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:10

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原帖由 ha111 于 2012-11-30 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！我想问下，我在做多个蛋白样品中目的蛋白含量的比较，但是蛋白定量不是很准，内参老是不一致，有没有比较好的解决办法呀？谢谢

你用什么定量方法？
步骤如何？
建议用BCA法
蛋白一定要稀释到合适的范围内

作者: BUK 时间: 2012-11-30 13:10

我用的就是BCA测的，显色后内参还是有不少差异，我想跟据我的结果调一下上样量来使它们一致，但是比较难控制，不知道您有没有什么好的建议？谢谢

作者: zsxan1990 时间: 2012-11-30 13:11

pulldown技术，一般做的都是两个已知蛋白之间的相互作用，1、我们要做的一个已知蛋白和一个未知蛋白之间的相互作用，从而筛选未知蛋白。2、还要构建一个载体，如何构建呢？这个实验该怎么做呢？

作者: JK.jon 时间: 2012-11-30 13:11

版主好,最近刚做Western blot有点不清白，今天做Western blot用碧云天的裂解液提取的蛋白样品，12000转下高速离心5分钟，取上清测完蛋白浓度后本来要加loading buffer在100度水中煮沸5分钟，但是我忘了加loading buffer 直接煮了5分钟，结果样品出现絮状物，不知道是离心不够，还是蛋白在高温下变性了，我犹豫了很久做了下面步骤：
1.又拿着去高速离心了10分钟，再取上清，重新测蛋白浓度，
2.加loading buffer100度水中煮10分钟分装负20度保存。

不知可否，错误在哪？请赐教，急急急

作者: vcve 时间: 2012-11-30 13:11

我纯化的抗体，加DTT后只有一条带下边25左右有一片而不是一条清晰的条带是怎么回事？我跑了几次都是这样？另外每次我配完剩余的胶在瓶子里，以前好像都是整体凝固，现在都是在瓶底有凝固的，上面还有液体，这是我的过硫酸铵有问题吗？

作者: eric930 时间: 2012-11-30 13:12

辛苦做Western快2年了，用表皮提取的蛋白为底物跑胶，然后对患者的血清进行检测，血清中能检测到抗皮肤230kd的抗体，问题是我现在没法仅通过Western证明230kd那个位置结合的抗体就是抗BPAG1抗体（分子量也为230kd）。
真诚拜求各位高手、各位大哥帮忙给个主意，或者看一下我的方案是否可行（从丽春红染色的NC膜上提取结合的目标抗体，然后送去测序？）
——万分感谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:12

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原帖由 BUK 于 2012-11-30 13:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的就是BCA测的，显色后内参还是有不少差异，我想跟据我的结果调一下上样量来使它们一致，但是比较难控制，不知道您有没有什么好的建议？谢谢 ...

1、要确保蛋白定量准确
2、蛋白浓度调整过程中注意样品缓冲液挂壁现象
3、通过预实验结果读取条带数值，根据数值来调整总蛋白的上样量

作者: KGZ564 时间: 2012-11-30 13:13

我要用L-乳酸脱氢酶（来源于猪心、来源于兔肌）来做乳酸脱氢酶X同工酶（LDH-X）定量检测实验，因不知道这两种不同来源的乳酸脱氢酶同工酶用什么稀释液稀释才能使酶最稳定，保存的时间最长，希望版主指点用什么样的稀释液稀释和怎么样保存！谢谢……

作者: H2O 时间: 2012-11-30 13:13

我称量了0.1g的小麦根（只长了10天），加2毫升缓冲液研磨，电泳时点样15微升样品，考马斯亮蓝染色过夜，脱色24小时，MARKER很清楚，但是样品不清楚，颜色特别特别浅，几乎看不到，请问是什么原因啊？是不是蛋白含量太低了啊？有什么好的办法解决吗？谢谢！

作者: avi317 时间: 2012-11-30 13:14

10~20KD的小分子量蛋白做western需要注意哪些？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:14

版主好,最近刚做Western blot有点不清白，今天做Western blot用碧云天的裂解液提取的蛋白样品，12000转下高速离心5分钟，取上清测完蛋白浓度后本来要加loading buffer在100度水中煮沸5分钟，但是我忘了加loading buf ...

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1、不能直接变性，需要加入loading后才能变性
2、不加loading煮后、离心、取上清、上清中基本无蛋白了

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:15

我纯化的抗体，加DTT后只有一条带下边25左右有一片而不是一条清晰的条带是怎么回事？我跑了几次都是这样？另外每次我配完剩余的胶在瓶子里，以前好像都是整体凝固，现在都是在瓶底有凝固的，上面还有液体，这是我的 ...

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1、多抗还是单抗？25K会有弥散的带存在，是轻链
2、由于室温降低的引起的聚合不充分

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:16

我称量了0.1g的小麦根（只长了10天），加2毫升缓冲液研磨，电泳时点样15微升样品，考马斯亮蓝染色过夜，脱色24小时，MARKER很清楚，但是样品不清楚，颜色特别特别浅，几乎看不到，请问是什么原因啊 ...

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1、裂解液量加的太多了
植物中本身就没有蛋白，你还加这么多裂解液
2、加大上样量

作者: am10 时间: 2012-11-30 13:16

请问12%的胶要跑多大的电压，大概要跑多久？我们想把isoform分离开来，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:17

10~20KD的小分子量蛋白做western需要注意哪些？

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胶浓度
转膜时间
膜的孔径

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:17

请问12%的胶要跑多大的电压，大概要跑多久？我们想把isoform分离开来，谢谢！

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跑多大分子量的蛋白啊

作者: 49888 时间: 2012-11-30 13:17

WB做出来发现背影杂色太多，带不清晰
二抗量已减半，是否还需稀释？

作者: yapuyapu 时间: 2012-11-30 13:18

请问我的目的蛋白和b-actin分子量很近，怎么在一张膜上加一抗，
我是封闭后加b-actin孵育，TBST洗三次再次封闭上目的蛋白的一抗，
请问还有更好的方法吗

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:18

WB做出来发现背影杂色太多，带不清晰
二抗量已减半，是否还需稀释？

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1、增加洗膜次数
2、继续稀释二抗

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:18

请问我的目的蛋白和b-actin分子量很近，怎么在一张膜上加一抗，
我是封闭后加b-actin孵育，TBST洗三次再次封闭上目的蛋白的一抗，
请问还有更好的方法吗

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用beta-tubulin或者GAPDH

作者: standbyme 时间: 2012-11-30 13:19

有劳版主，问一下我做的蛋白105KDa,想采用湿转的方式转膜,理想的转膜电压,膜电流,转膜时间大概要多少?

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:20

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原帖由 standbyme 于 2012-11-30 13:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有劳版主，问一下我做的蛋白105KDa,想采用湿转的方式转膜,理想的转膜电压,膜电流,转膜时间大概要多少?

湿转：恒流 300mA 2h30min

作者: ritou1985 时间: 2012-11-30 13:21

最近做用内参做WB，发现最后曝光后，胶片的条带的浓度大小和加样多少有很大差异，也就是说，有的孔加样加的很多，可最后出现的条带很淡。请问，这是不是跟膜的质量有关系啊？是否是因为同一张膜上各个地方对蛋白的吸附能力有差异啊？
如果不是，那是其他的什么原因吗？

作者: tuuu2 时间: 2012-11-30 13:22

提取培养细胞全蛋白的时候，应该用什么样的裂解液？RIPA之外还有什么？还有用不用超声波的根据是什么？

作者: tuuu2 时间: 2012-11-30 13:23

请教版主，有没有权威而的蛋白实验手册之类的？介绍一下，谢谢！

作者: c86v 时间: 2012-11-30 13:23

现有实验条件：转膜设备Hoefer™ miniVE，NC膜Milipore 0.22um，6%SDS丙烯酰胺凝胶。
请教版主，55kd和160kd大小的蛋白使用6%的凝胶能在一张膜上转印吗？若不能，请问两种不同的分子量蛋白的转膜条件？谢谢！

作者: fox_79 时间: 2012-11-30 13:24

请教版主：
最近跑SDS-PAGE电泳时，发现一个奇怪现象，分离胶在进行到30分钟后（120V），分离胶下端出现了两条透明的折线，有点类似压缩胶和分离胶之间的透明界限，样本和Marker跑到这里时都被压缩成细、窄、浓的条带。导致Marker等变形。正常的Marker是6条带，随着电泳时间的延长，条带逐渐被压缩合并成5条带。而且整体电泳的时间也大大延长。
曾经考虑是配的胶问题，将40%丙烯酰胺、AP,TEMED,电泳缓冲液，配胶的缓冲盐等都新配了个遍，问题依旧，已经尝试电泳1周了，故障仍没解决，我快抓狂了，技穷了！:<
我上个月的电泳、Western blot都还正常，请版主帮忙给分析下。谢谢！
随后附张图。

这是我跑的Marker,19KDa,26KDa被挤压到一起了。

图片附件: 100118113695038b06118976f8.jpg (2012-11-30 13:24, 5.38 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14254

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:24

QUOTE:

原帖由 ritou1985 于 2012-11-30 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近做用内参做WB，发现最后曝光后，胶片的条带的浓度大小和加样多少有很大差异，也就是说，有的孔加样加的很多，可最后出现的条带很淡。请问，这是不是跟膜的质量有关系啊？是否是因为同一张膜上各个地方对蛋白的吸附能力有差异 ...

加的样品浓度一致吗？
上样量都是一致的吗？
如果说同一张膜不同地方对蛋白的吸附不同，那说明你的膜过期了
一般不会出现这样的情况
有可能是一抗孵育不好导致

作者: wood533 时间: 2012-11-30 13:25

有啊
《抗体实验技术指南》
《蛋白质技术手册》
这两本比较基础

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:25

现有实验条件：转膜设备Hoefer™ miniVE，NC膜Milipore 0.22um，6%SDS丙烯酰胺凝胶。
请教版主，55kd和160kd大小的蛋白使用6%的凝胶能在一张膜上转印吗？若不能，请问两种不同的分子量蛋白的转膜条件？谢谢！

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1、选用中型电泳槽，如DYCZ-24E，分离胶高度大
可以有效分离这些蛋白
2、55与160K蛋白不需要用6%的
你试试8%就能分离，而且两者都能保留在膜上
3、可以采用相同的转膜条件，按照160K蛋白设定

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:26

请教版主：
最近跑SDS-PAGE电泳时，发现一个奇怪现象，分离胶在进行到30分钟后（120V），分离胶下端出现了两条透明的折线，有点类似压缩胶和分离胶之间的透明界限，样本和Marker跑到这里时都被压缩成细、窄、浓的条 ...

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1、透明线是甘油
2、电泳时间延长你检查下设备、pH

作者: jrwyyplt 时间: 2012-11-30 14:28

分子量越大结合的SDS不就越大么，所带负电就越多，迁移率为什么只与分子量有关呢，与电荷不也有关么？谢谢

作者: www.1 时间: 2012-11-30 14:28

做WB时可用小鼠源性一抗检测小鼠体内蛋白吗

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-11-30 14:29

您好！我这段时间做western blot，按照“两张滤纸-NC膜-凝胶-两张滤纸”的顺序叠好三明治，然后胶向着负极，膜向着正极，100mA，2h，凝胶考染后，没有蛋白带，而NC经丽春红染色后，膜上没有蛋白带，这是怎么回事呀？ ...

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转膜缓冲液用的是takala公司的产品目录后面的配方配的，很好用
我一般转膜100v，1h
效果很好
祝成功

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:31

做WB时可用小鼠源性一抗检测小鼠体内蛋白吗

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可以的

作者: 00无名指00 时间: 2012-11-30 14:32

1、透明线是甘油
2、电泳时间延长你检查下设备、pH

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1. 我考虑不是甘油，因为透明线是整块胶上都有（包括没有上样的地方）；另外，在我的试剂、缓冲液等配方中也没有加甘油。而且，透明线还是两条。
2. 电泳仪一直用的好好的，试剂又重新配的，pH值都是新校正过。

实在不知道何地方出现了问题？

作者: 白白的 时间: 2012-11-30 14:32

RIPA裂解完细胞或者组织后，离心取上清蛋白样，煮沸以后怎么又出现浑浊（沉淀）？这是什么原因？怎么避免？

作者: utt0989 时间: 2012-11-30 14:33

版主,问一个问题,这个电泳液,转膜液在室温下怎么老是混浊的,里面的SDS在室温下很不易溶解,加热了就变清澈了,但是原则上电泳和转膜(我用的是湿转)都要在低温下进行,加热后的电泳和转膜液是不是影响效果,不知版主有什么好的方法让电泳液和转膜液在常温下变清澈

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:33

1. 我考虑不是甘油，因为透明线是整块胶上都有（包括没有上样的地方）；另外，在我的试剂、缓冲液等配方中也没有加甘油。而且，透明线还是两条。
2. 电泳仪一直用的好好的，试剂又重新配的，pH值都是新校正过。 ...

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这个我就不知道了
不好意思
如果能看到现象的话可能还能帮你分析下

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:34

RIPA裂解完细胞或者组织后，离心取上清蛋白样，煮沸以后怎么又出现浑浊（沉淀）？这是什么原因？怎么避免？

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1、在吸取上清时带上了部分悬浮在最上面的油脂
2、蛋白浓度较高，没有用RIPA等稀释，导致loading中的SDS不能全融蛋白

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:35

版主,问一个问题,这个电泳液,转膜液在室温下怎么老是混浊的,里面的SDS在室温下很不易溶解,加热了就变清澈了,但是原则上电泳和转膜(我用的是湿转)都要在低温下进行,加热后的电泳和转膜液是不是影响效果,不知版主有什么 ...

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在RT状态下，一般20度左右是不会有浑浊的现象的
你的温度较低，只能在用的时候37度水浴一下

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 14:36

现正在做WB，想请教一下斑竹
1、我的一抗来源于兔，在订购二抗时没留意用的是山羊抗大鼠的，不知有没有影响？
2、经常听说湿转、半干转、干转究竟是怎么回事？3、Marker是否需要变性？4、还原型和非还原型上样缓冲液有什么区别？先谢谢啦，恳请赐教！

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 14:37

RIPA裂解完细胞或者组织后，离心取上清蛋白样，煮沸以后怎么又出现浑浊（沉淀）？这是什么原因？怎么避免？
suoyigao 发表于 2010-1-18 16:22
1、在吸取上清时带上了部分悬浮在最上面的油脂
2、蛋白浓度较高，没有用RIPA等稀释，导致loading中的SDS不能全融蛋白

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谢谢楼主了，那按照楼主的意思，是不是可以适当的加大裂解液的量？还有，要是出现煮沸上清后又重新出现沉淀的情况，是不是可以再次离心取上清做后继实验啊？？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:39

现正在做WB，想请教一下斑竹1、我的一抗来源于兔，在订购二抗时没留意用的是山羊抗大鼠的，不知有没有影响？2、经常听说湿转、半干转、干转究竟是怎么回事？3、Marker是否需要变性？4、还原型和非还原型上样缓冲液有 ...

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1、要用某某抗兔的二抗才行
2、湿转与半干转缓冲液不同、设备不同
3、是否需要变性要看说明书
4、还原型：有DTT或者beta-巯基乙醇
非还原性：无上述还原剂

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:40

RIPA裂解完细胞或者组织后，离心取上清蛋白样，煮沸以后怎么又出现浑浊（沉淀）？这是什么原因？怎么避免？
suoyigao 发表于 2010-1-18 16:22
1、在吸取上清时带上了部分悬浮在最上面的油脂
2、蛋白浓度较高，没 ...

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不可以
在调整蛋白浓度的时候把蛋白浓度调整至2-4mg/ml一般就不会有沉淀了

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 14:40

不可以
在调整蛋白浓度的时候把蛋白浓度调整至2-4mg/ml一般就不会有沉淀了

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为什么重新离心取上清不可以呢？
如果刻意的把蛋白浓度调整到2-4mg/ml，这样实际操作中有困难啊，不好控制裂解液的量啊？
请楼主给个解决的办法，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:41

为什么重新离心取上清不可以呢？
如果刻意的把蛋白浓度调整到2-4mg/ml，这样实际操作中有困难啊，不好控制裂解液的量啊？
请楼主给个解决的办法，谢谢！

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2-4mg/ml不是说裂解液的时候
而是提取蛋白后，加入loading变性的时候把浓度调整到这个

作者: caihong 时间: 2012-11-30 14:42

WESTERN电泳过后转膜失败求原因！
电极没反温度4度但就是没转出来（看不到MARKER）

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转膜时间不够吧？

作者: 969 时间: 2012-11-30 14:43

你好

我想請問我loading sample的時，15ul/孔，樣品事先調好濃度后加入SDS Buffer 95度boiling, 在run gel時開始sample藍色指示帶呈一直線，但是進入分離gel后指示帶就開始不規則了，跑得歪歪扭扭，可以呈M形或者S形，并不是一直線！但最后的western結果顯示protein 還是一直線，請問這樣會是什么原因？對結果會否有影響？謝謝
（我用的是invitrogen NuPAGE4%-12%Bis-Tris Gel）

作者: H2O 时间: 2012-11-30 14:45

我最近做了两次western blot ,空载体诱导对照没有条带，诱导的蛋白样品除了目的带外下面还有很多杂带，未诱导的样品对照在目的带大小处同样出现条带，而且只有一条。不知道为什么

作者: wsll 时间: 2012-11-30 14:46

推荐我一个比较好用的蛋白定量试剂盒！简单、快速地！谢谢了！

作者: yes4 时间: 2012-11-30 14:47

我想請問我loading sample的時，15ul/孔，樣品事先調好濃度后加入SDS Buffer 95度boiling, 在run gel時開始sample藍色指示帶呈一直線，但是進入分離gel后指示帶就開始不規則了，跑得歪歪扭扭，可以呈M形或者 ...

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可能与你的loading buffer有关
或者在变性时有沉淀

作者: S6044 时间: 2012-11-30 14:48

推荐我一个比较好用的蛋白定量试剂盒！简单、快速地！谢谢了！

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BCA

作者: flower-201 时间: 2012-11-30 14:49

做了一个多星期western blot ,先做的内参,超级郁闷,最后显影片子上啥都没有,我怀疑可能转膜出了问题,我的内参是B-tubulin,分子量大约50KD，半干转2mA/cm*2 PVDF膜,1.5小时,转膜后用丽春红染色条带不是很清楚,考马斯亮蓝染胶又没有条带,请版主指点一下,另外如果采用β-actin,推荐半干转转膜电流,转膜时间是多少?

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:49

beta-tubulin分子量约55KD
beta-actin可以采用与beta-tubulin一样的转膜条件

作者: ending 时间: 2012-11-30 14:50

请问楼主核蛋白应该怎么提取，注意些什么，如果可以介绍下具体lysis buffer配方，还有核蛋白的内参选什么好呢？

作者: is2011 时间: 2012-11-30 14:51

我想把我的一个免疫印迹法改良，缩短反应时间，它原本一抗和二抗反应时间均为RT下45分钟，如果我把温度调整到37度恒温，反应时间可缩短到多少分钟？谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:51

QUOTE:

原帖由 ending 于 2012-11-30 14:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主核蛋白应该怎么提取，注意些什么，如果可以介绍下具体lysis buffer配方，还有核蛋白的内参选什么好呢？

我晕
你这问题太笼统了
请详细点

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:52

我想把我的一个免疫印迹法改良，缩短反应时间，它原本一抗和二抗反应时间均为RT下45分钟，如果我把温度调整到37度恒温，反应时间可缩短到多少分钟？谢谢！

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没试过
你可以试试
把你的最后结果挂上来供大家参考

作者: gmjghh 时间: 2012-11-30 14:53

您好！我是刚开始接触western blot的。用ECL方法曝光之后总出现白片。一抗1：1000是新的，二抗1：2000是HRP应该没有问题，加了Anti-Biotin1:1000.缓冲液用5%BSA（在TBST里）。但是最后出的片子连蛋白marker都看不见，一片空白。鲁米那和过氧化物试剂都是新的，别人做过有结果。我总结一下经验教训，发现只要用5%脱脂奶粉做缓冲液就有信号还很清晰，只要一用5%BSA必出白片。会是BSA的问题么？我不是用白蛋白粉配的，是用30%的BSA稀释在TBST里面，会不会是这个东西把底物作用光了啊。

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:53

您好！我是刚开始接触western blot的。用ECL方法曝光之后总出现白片。一抗1：1000是新的，二抗1：2000是HRP应该没有问题，加了Anti-Biotin1:1000.缓冲液用5%BSA（在TBST里）。但是最后出的片子连蛋白marker都看不见， ...

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anti-biotin是哪一步？

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 14:54

楼主，不行啊，今天又裂解了几个样品了，按照你的方法，裂解后测定蛋白浓度，然后用裂解液把蛋白样品稀释到3.5mg/ml的浓度，经过5分钟的煮沸，发现又有浑浊出现了，该怎么办啊？样品如何处理才可以用作上样液啊？

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-11-30 14:55

一抗用的是1：1000稀释的sEH抗体，二抗用的是1：2000稀释的同源兔抗体，因为加样的时候加了蛋白标记（protein marker）所以在二抗里又加了anti-biotin（ 1：1000），为了让marker出带。我用的blocking buffer是sigma的30%BSA在TBST里面稀释到5%，我就怀疑是这个东西把我的底物作用了，导致我一用它封闭就不出信号，用脱脂奶粉就很少出现这种情况。谢谢版主，帮帮我吧，再不出结果老板都要疯了

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-11-30 14:56

楼主：
请教Western最后用化学发光成像后，经常发现不同批次的实验需要曝光的时间经常不一致，这样就导致了条带深浅不一样，包括同样的内参。请问，这样的结果如何分析？同样的样本，结果会因曝光强度差异导致最后计算的灰度比值差别很大，没法统一进行分析。
请教版主，如何让不同批次的样本（不同时间曝光）结果能有更好的可比性？
谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2012-11-30 14:57

楼主：
请教一下，我是做的是HSP70，用的是自己配制的RIPA裂解液，配方如下：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS，用前加PMSF至1 mM 。Western转膜后出现很弥散的条带，条带浓度很高，特别宽，怎么回事？是不是蛋白降解了？谢谢

作者: yes4 时间: 2012-11-30 14:57

因为我用的内参是tublin,两者条带间隙小，就采用的两块胶转膜的，结果Western内参和HSP70的条带相似，都是那种粗粗的很宽的带，不知道是什么东西？是胶的问题还是蛋白提取的问题？

作者: standbyme 时间: 2012-11-30 14:57

我的western 做出来的结果和indirect ELISA 结果正好相反，这可怎么办呢？分析了一下除了样品的问题，真的不知道问题在哪里。请教

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:58

楼主，不行啊，今天又裂解了几个样品了，按照你的方法，裂解后测定蛋白浓度，然后用裂解液把蛋白样品稀释到3.5mg/ml的浓度，经过5分钟的煮沸，发现又有浑浊出现了，该怎么办啊？样品如何处理才可以用作上样液啊？

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换掉你的sample buffer

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:58

一抗用的是1：1000稀释的sEH抗体，二抗用的是1：2000稀释的同源兔抗体，因为加样的时候加了蛋白标记（protein marker）所以在二抗里又加了anti-biotin（ 1：1000），为了让marker出带。我用的blo ...

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不要为了你的marker出条带而这么麻烦
你可以直接选择可以曝光的WB marker

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:59

楼主：
请教Western最后用化学发光成像后，经常发现不同批次的实验需要曝光的时间经常不一致，这样就导致了条带深浅不一样，包括同样的内参。请问，这样的结果如何分析？同样的样本，结果会因曝光强度差异导致最后计 ...

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在每张膜上都加上空白对照

同一张膜上的目的蛋白/内参

之后与空白对照normalize

这样不同膜之间才有可比性，不会因为不同曝光时间而造成太大的误差

作者: wood533 时间: 2012-11-30 14:59

楼主：
请教一下，我是做的是HSP70，用的是自己配制的RIPA裂解液，配方如下：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS，用前加PMSF至1 mM 。Western转膜后出现很弥 ...

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你已经做完WB了？
最后结果条带弥散还是转膜后条带就弥散？
裂解液没有问题

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:00

因为我用的内参是tublin,两者条带间隙小，就采用的两块胶转膜的，结果Western内参和HSP70的条带相似，都是那种粗粗的很宽的带，不知道是什么东西？是胶的问题还是蛋白提取的问题？

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提取的蛋白跑过电泳，染过胶吗？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:01

我的western 做出来的结果和indirect ELISA 结果正好相反，这可怎么办呢？分析了一下除了样品的问题，真的不知道问题在哪里。请教

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很正常啊
ELISA不能区分真、假阳性

作者: 兔唇 时间: 2012-11-30 15:01

请问WB不适用于哪类蛋白质啊？适用于胶原蛋白吗

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:02

可以用WB检测Collagen

作者: 04906 时间: 2012-11-30 15:03

只有一个办法
在每张膜上都加上空白对照

同一张膜上的目的蛋白/内参

之后与空白对照normalize

这样不同膜之间才有可比性，不会因为不同曝光时间而造成太大的误差

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谢谢版主，你所说的空白对照是否可以是同样的待测样品？只要有该目的蛋白表达即可？
谢谢！

作者: 生物迷 时间: 2012-11-30 15:04

显影时间太长了，所以胶片会变黑

作者: nut6694 时间: 2012-11-30 15:04

目的蛋白在12KD-17KD，考染，有目的条带。转膜，marker转上。DAB没看到目的条带。可能的原因有哪些呀？谢谢LZ 。。。

作者: jujuba 时间: 2012-11-30 15:05

为什么ECL显影肉眼可见荧光条带但胶片显不出来

作者: 831226 时间: 2012-11-30 15:05

为什么ECL显影肉眼可见荧光条带但胶片显不出来

作者: vivian4123 时间: 2012-11-30 15:06

请问一下，我把胶考染了，我想把它转膜，可行吗？转膜后还能用丽春红吗？我想知道考马斯亮蓝会不会也转到膜上，谢谢

作者: 8princess8 时间: 2012-11-30 15:07

最近在做WB,丽春红膜染色发现只有上部有蛋白条带，而在34KD处以下则无，不知什么原因，我的实验基本步骤如下，恳请斑竹能指点一下。目的蛋白37KD，21KD。
1、电泳：积层胶65-70V*60-90分钟；分离胶（12%）100V*5-6小时；电泳仪是Tanon公司EPS300，电泳液的PH值问题已经过仔细核对，应该不存在，电泳时间过长不知还应考虑哪些方面的影响？
2、转膜：转膜液现配先用，湿转，配方：甘氨酸2.9，Tris碱5.8，SDS0.37,甲醇200ml，加水至1000ml,280mA*60分钟。

请赐教，谢谢！

作者: tangxin_80 时间: 2012-11-30 15:08

请问这个胶跑成这样是怎么回事
这个蛋白质样品是来自Nacl 梯度纯化后的样品开始我怀疑是盐分过多做了2天的dialysis 可是样品还是这样，是不是需要用脱盐的柱子过一下？
胶本身没问题我确定

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14255

作者: tangxin_80 时间: 2012-11-30 15:11

目标蛋白是100左右我用的是50KD的膜浓缩的
下面应该没有带

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:25

谢谢版主，你所说的空白对照是否可以是同样的待测样品？只要有该目的蛋白表达即可？
谢谢！

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就是control组

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:25

目的蛋白在12KD-17KD，考染，有目的条带。转膜，marker转上。DAB没看到目的条带。可能的原因有哪些呀？谢谢LZ 。。。

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你说的范围太大了
什么蛋白？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:32

为什么ECL显影肉眼可见荧光条带但胶片显不出来

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1、胶片过期了
2、胶片与显影液不匹配

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:32

请问一下，我把胶考染了，我想把它转膜，可行吗？转膜后还能用丽春红吗？我想知道考马斯亮蓝会不会也转到膜上，谢谢

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胶考染后蛋白就被固定了
不能再转膜了

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:33

31770请问这个胶跑成这样是怎么回事
这个蛋白质样品是来自Nacl 梯度纯化后的样品开始我怀疑是盐分过多做了2天的dialysis 可是样品还是这样，是不是需要用脱盐的柱子过一下？
胶本身没问题我确定

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换一新的sample buffer
可能是DTT或者巯基乙醇降解了

作者: youyou99 时间: 2012-11-30 15:33

封闭的时候BSA和脱脂奶粉哪个效果好？都可以用striping buffer洗吗？

作者: tianmei001 时间: 2012-11-30 15:34

版主好,最近刚做Western blot有点不清白，今天做Western blot用碧云天的裂解液提取的蛋白样品，12000转下高速离心5分钟，取上清测完蛋白浓度后本来要加loading buffer在100度水中煮沸5分钟，但是我忘了加loading buffer 直接煮了5分钟，结果样品出现絮状物，不知道是离心不够，还是蛋白在高温下变性了，我犹豫了很久做了下面步骤：
1.又拿着去高速离心了10分钟，再取上清，重新测蛋白浓度，
2.加loading buffer100度水中煮10分钟分装负20度保存。

我也犯过类似错误，先煮蛋白了，后来发现根本不能显示条带。最后还是重新取了另一份蛋白加loading buffer 煮了5分钟，做实验就有条带

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:35

封闭的时候BSA和脱脂奶粉哪个效果好？都可以用striping buffer洗吗？

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效果好坏要看目的蛋白及抗体
可以用stripping buffer洗脱抗体

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 15:35

楼主你好！我的目的条带30，60，115，130，250千道尔顿。跨度比较大，能给我推荐一下半干转印的具体条件和时间么？我每次转完条带都不明显

作者: kuohao17 时间: 2012-11-30 15:36

最近做western, 内参都做不出。电泳后一半用考马斯亮蓝染胶，没问题; 另一半转膜，MAKER转上去了，但是丽春红染不出来（丽春红没问题）。接着往下做也都是空空如也。真是急死人了。请版主帮忙啊！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:36

楼主你好！我的目的条带30，60，115，130，250千道尔顿。跨度比较大，能给我推荐一下半干转印的具体条件和时间么？我每次转完条带都不明显

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你用什么胶？
这么大跨度想一次转？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:37

最近做western, 内参都做不出。电泳后一半用考马斯亮蓝染胶，没问题; 另一半转膜，MAKER转上去了，但是丽春红染不出来（丽春红没问题）。接着往下做也都是空空如也。真是急死人了。请版主帮忙啊！

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先确定蛋白转到膜上了

作者: xueyouzhang 时间: 2012-11-30 15:37

我用压过片的膜染丽春红染出来了但是片子没压出来抗体没问题难道是TBST PH值的问题？那这样是不是至少说明转膜成功了呢？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:38

QUOTE:

原帖由 xueyouzhang 于 2012-11-30 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用压过片的膜染丽春红染出来了但是片子没压出来抗体没问题难道是TBST PH值的问题？那这样是不是至少说明转膜成功了呢？

抗体不同的稀释度做了吗？

作者: xueyouzhang 时间: 2012-11-30 15:38

我用的15%分离胶，5%浓缩胶，是想一次都转好；另外我想问下抗体做浓度梯度的作用是什么啊

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:39

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原帖由 xueyouzhang 于 2012-11-30 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的15%分离胶，5%浓缩胶，是想一次都转好；另外我想问下抗体做浓度梯度的作用是什么啊

不太好弄
用梯度胶吧

作者: okhaha 时间: 2012-11-30 15:39

请问NC膜和PVDF膜应该怎样选用呢，我看到文献上几乎都是PV DF，这个是不是要好些

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:39

PVDF膜载量要大一些，机械强度要高一些，但是需要用甲醇活化处理
NC用起来方便一些
我是两种均用

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 15:40

我用2倍的sds上样缓冲液，出来的条带考染后很浅，而且小分子条带都没出来，我以为是浓度的问题了，就换成5倍的上样缓冲液，相同的上样量，结果跑出来染完后更浅，应该不是脱色时间过长，都一样时间，请教是怎么回事啊？相同体积上样量5倍的理论上应比两倍的蛋白量更大啊为什么反倒浅了呢。非常感谢！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:40

前后两次考染的时间（程度）一致吗？

作者: 3648755 时间: 2012-11-30 15:40

都都一致。是不是我用的5倍上样缓冲液不对呀？5倍的和2倍的区别是更浓缩吗？2倍的SDS含量4%（分子克隆），5倍的SDS含量2%（汪家政），怎么倍数越高含量越低呢？

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:41

不对
2%的SDS是一倍的
5倍的应该是10% SDS

作者: zzzz 时间: 2012-11-30 15:41

版主你好,我准备做WB,是第一次做,但是对于抗体的选择却束手无策.
1,由于之前没有经验,所以不敢买多了抗体,免得做不出来浪费,想先用分装试一下;
2,看到相关文献报道做本实验室细胞测相同指标的抗体,用的好多是羊抗,但大多数人都说羊抗的效果不怎么好,反而兔,鼠的更好些;
3,看到该羊抗有许多文章使用,那我现在是按照文献来还是自己先按照实验室的经验用兔,鼠抗尝试一下?
4,准备SANTA的产品尝试,算是预实验吧.用分装的练练手.

谢谢你于百忙之中解答.

作者: DDD 时间: 2012-11-30 15:42

抗体和二抗能否回收，再次利用？

作者: qqq111 时间: 2012-11-30 15:42

你好，我刚开始做实验，不知如何循着抗体。主要看哪些方面？谢谢

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:43

QUOTE:

原帖由 DDD 于 2012-11-30 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

抗体和二抗能否回收，再次利用？

有些一抗可以
二抗就算了吧

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:44

你好，我刚开始做实验，不知如何循着抗体。主要看哪些方面？谢谢

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你这个问题范围很大
不知道怎么回答

作者: avi317 时间: 2012-11-30 15:45

请问显示的条带杂带比主带明显的多,并且主带经常会出现背景特别花以至于主带都看不清楚如何处理
谢谢!

作者: jujuba 时间: 2012-11-30 15:46

您好，我即将做western，正在学习中，看到有的资料上提到转膜后PVDF膜应该干燥后再做后边的免疫检测，说是可以提高蛋白吸附到PVDF聚合物上的能力，有助于降低随后分析过程中的解吸，但是干燥时间及方法没有提到，请问您了解干燥的细节过程吗，干燥与不干燥结果差异大吗？非常感谢！！

作者: bling 时间: 2012-11-30 15:46

大家好！！我是新手，最近开始做western，过程如下：1.年前提取的脑组织蛋白，测浓度1-2mg/ml，制成样品后于-20度保存2.用碧云天配胶试剂盒配12%分离胶，上样25ul，电泳浓缩胶80v 30min
分离胶100v 1h30min3.转膜：目的31kd 250mA45min，膜孔径0.22 4.37度封闭90min(封闭液为5%脱脂奶粉) 5.一抗4度过夜（1：500，为abcam多克隆抗体）6.二抗37度90min(1:5000)7.碧云天ecl发光试剂盒。
问题如下：1.每次显色是条带下方均有杂带2.显色1-2min后出现粗、深条带
期待各位高手指点！

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:55

请问显示的条带杂带比主带明显的多,并且主带经常会出现背景特别花以至于主带都看不清楚如何处理
谢谢!

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花的原因：如果是用奶粉封闭的话换用BSA或者其他封闭试剂试试
杂带：通过降低一抗浓度来调整

作者: wood533 时间: 2012-11-30 15:55

您好，我即将做western，正在学习中，看到有的资料上提到转膜后PVDF膜应该干燥后再做后边的免疫检测，说是可以提高蛋白吸附到PVDF聚合物上的能力，有助于降低随后分析过程中的解吸，但是干燥时间及方法没有提到，请问 ...

干燥后不能用于后续检测
我的理解是
PVDF膜需要活化
干燥后需要重新甲醇活化，会使蛋白发生变化
仅供参考

作者: duoduo 时间: 2012-11-30 15:56

您好！！我是新手，最近开始做western，过程如下：
1.提取的心组织蛋白和动脉组织蛋白，上样量为80ug和50ug
2.用生工配胶试剂盒配7.5%分离胶，上样20ul，电泳浓缩胶80v
分离胶120v
3.转膜：目的195kd 400mA 90min，膜孔径0.22
4.37度封闭90min(封闭液为5%脱脂奶粉)
5.一抗4度过夜（1：200，为santa多克隆抗体）,过夜之后平衡一个小时。
6.TBST洗8分钟5次，
7.二抗室温60min(1:5000)
8。TBST洗8分钟5次
9.碧云天ecl发光试剂盒。
问题如下：1.对上面的ACE来说，动脉的比心脏的较好，但仍见竖条纹，不知道是什么原因
2.ACE2不管是心脏还是动脉的结果都比较差，哪些还能有改善的地方呢？
附图如下，期待各位高手指点！

图片附件: 10031211590eb2f7849b48e857.jpg (2012-11-30 15:56, 16.33 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14256

作者: 幽兰君 时间: 2012-12-1 12:00

版主你好，我想问三个问题：
１.我在蛋白上样时已经用１×的　SDS　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　将各孔的上样体积补齐了，为什么我冲出来的片子还是能明显地看到，条带有的宽有的窄，而且有时会很明显？
２.我蛋白定量用的是ＢＣＡ法，我这蛋白比较浓，请问稀释时是用水好还是用ＲＩＰＡ好（我的蛋白是用ＲＩＰＡ抽提的）？
３.我是做组织的Western　ｂｌｏｔ的，每次用ＢＣＡ定量结果去上样，内参都不是很齐。请问版主有没有什么好的组织蛋白定量方法？
终于写完了，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:01

您好！！我是新手，最近开始做western，过程如下：
1.提取的心组织蛋白和动脉组织蛋白，上样量为80ug和50ug
2.用生工配胶试剂盒配7.5%分离胶，上样20ul，电泳浓缩胶80v
分离胶120v
3.转膜：目的195kd 400mA 90 ...

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用BSA封闭试试

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:01

QUOTE:

原帖由 幽兰君 于 2012-12-1 12:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
版主你好，我想问三个问题：
１.我在蛋白上样时已经用１×的　SDS　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　将各孔的上样体积补齐了，为什么我冲出来的片子还是能明显地看到，条带有的宽有的窄，而且有时会很明显？
２.我蛋白定量用的是ＢＣＡ法，我这蛋白比较浓，请问稀释时是用水 ...

1、与上样孔本身大小也有关系
2、用RIPA调整
3、BCA定量已经很准确了，但是一定要在BCA的线性范围内才行

作者: DNA 时间: 2012-12-1 12:04

您好,谢谢,但用BSA封闭的效果如下，感觉效果还不如奶粉封闭的，请指点，谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14260

作者: tuuu2 时间: 2012-12-1 12:44

请教一下：我要做145kD的膜蛋白，电泳用哪种浓度的胶？转膜用半干还是湿转，具体转膜时间、电压或电流？

作者: kswl870 时间: 2012-12-1 12:46

在配制Western bloting转膜缓冲液的时候必须要加SDS吗？如果加的话，多少的量是最适合的？

作者: H2O 时间: 2012-12-1 12:47

楼主您好！我的目的条带250，130，115，70，60，25Kda，浓缩胶5%，分离胶15%；跨度很大，转膜想一次都转上，您给推荐个转膜条件，半干的。非常感谢！

作者: dongdongqiang 时间: 2012-12-1 12:48

蛋白质羰基测定用DNPH法测出的吸光度，如何算出PCO的含量？

作者: INK 时间: 2012-12-1 12:49

loading buffer 有可能影响显色吗？都是空白道显色了？

作者: woshituzhu 时间: 2012-12-1 12:50

做WB快半年了，一直出不了好条带，不是条带歪歪斜斜的就是背景像黑白电视那种花的要么就有黑点，有时又是条带那有几块布规则的白斑，问题一大堆，不知道该怎么解决。我做的方法是 5%积层电泳60V 25min/80V 20min 然后12%分离胶110V 约100min 湿转 320mA 1h 5%BSA封闭1h,一抗（1：200-1：1000）过夜（TBST配）洗三次，每次约20min 二抗CY3（1：1000-1：8000）1h（TBST配）洗三次，没词约20min 烘干台风扫描。millipre的PVDF荧光膜，请版主帮我看看操作有什么问题吗？WB都做的没一点脾气了，老板还老说，真不想做了。

作者: c86v 时间: 2012-12-1 12:52

肠衣中提取胶原蛋白试验中，肠衣如何制得，以及脱脂方法，多谢了

作者: utt0989 时间: 2012-12-1 12:52

制定酪氨酸浓度的标准曲线是为什么要在加福林酚前加Na2CO3?福林酚本身不是含有碳酸钠吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:53

您好,谢谢,但用BSA封闭的效果如下，感觉效果还不如奶粉封闭的，请指点，谢谢！ 323# fangweibin

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从你的结果看是这样
再次改变条件
还是用奶粉封闭，调整二抗的稀释度

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:53

请教一下：我要做145kD的膜蛋白，电泳用哪种浓度的胶？转膜用半干还是湿转，具体转膜时间、电压或电流？

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用8%的胶就可以
湿转：300mA 恒流、2h30min

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:54

在配制Western bloting转膜缓冲液的时候必须要加SDS吗？如果加的话，多少的量是最适合的？

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小分子量的可以不加
一般浓度在0.01-0.0375%

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:54

楼主您好！我的目的条带250，130，115，70，60，25Kda，浓缩胶5%，分离胶15%；跨度很大，转膜想一次都转上，您给推荐个转膜条件，半干的。非常感谢！

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建议分开做
一次想搞定这么多有难度
一定想搞的话就试试梯度胶
5%-12%的梯度胶

作者: wood533 时间: 2012-12-1 12:55

loading buffer 有可能影响显色吗？都是空白道显色了？

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应该不会的
有可能串道
或者污染

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:26

做WB快半年了，一直出不了好条带，不是条带歪歪斜斜的就是背景像黑白电视那种花的要么就有黑点，有时又是条带那有几块布规则的白斑，问题一大堆，不知道该怎么解决。我做的方法是 5%积层电泳60V 25min/80V 20min ...

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我认为你从SDS-PAGE开始就有问题
蛋白定量、上样、转膜
问题说的都太简单了、没法分析啊

作者: 王蜜蜜 时间: 2012-12-1 14:27

您好，我初学W，做了几次都没有带出现，膜上什么都没有，有一次是有Marker但其他道还是没有带，不知是什么原因，今天又做了一次，加了一个阳性对照，其他道竟然神奇的显带了，这次和以前只有一点不同，我以前加了过多的显影增强剂C液，今天加的是正常的量。想请问以前不显带是C液的原因么？貌似不可能啊

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-1 14:31

请问人的软骨用Western Blot 检测内含的蛋白浓度，标本怎么处理呢？谢谢，研磨还是酶消化了。

作者: standbyme 时间: 2012-12-1 14:31

我用bio-rad半干转印，恒流时即使放在冰箱里，维持250mA也只能15min，最后一直降到90mA，用的也是新配的缓冲液，怎样才能改进呢？我换恒压可以么，我的目的条带有250kda。

作者: mamamiya 时间: 2012-12-1 14:31

请问我要提取的蛋白有胞浆蛋白，胞核蛋白和总蛋白，是不是用的裂解液不一样？我该怎么提取，谢谢！

作者: XYZQ 时间: 2012-12-1 14:32

昨天显影的时候，胶片放在显影液里，没多久（一分钟内把）就全变黑了，但是直接把胶片放在定影液里仍然是透明的，请问下是胶片被曝光了还是显影液有问题啊。今天看到一句话“在加荧光剂后，反应大概一到四分钟。小心把膜放到暗盒里，放好后再也不要移动膜，否则荧光会消失。”这个是真的吗？？？谢谢你的回答~~~

作者: birdfish 时间: 2012-12-1 14:34

初学WB，请问什么是预染marker？有什么实验上的优势吗？另外，我的目的蛋白，34KD和38KD，湿转膜，多少电压和多长时间合适？

作者: vivian4123 时间: 2012-12-1 14:44

请问人的软骨用Western Blot 检测内含的蛋白浓度，标本怎么处理呢？谢谢，研磨还是酶消化了。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-12-1 14:44

我用bio-rad半干转印，恒流时即使放在冰箱里，维持250mA也只能15min，最后一直降到90mA，用的也是新配的缓冲液，怎样才能改进呢？我换恒压可以么，我的目的条带有250kda。

作者: yjf1026 时间: 2012-12-1 14:45

请问我要提取的蛋白有胞浆蛋白，胞核蛋白和总蛋白，是不是用的裂解液不一样？我该怎么提取，谢谢！

作者: 49888 时间: 2012-12-1 14:47

昨天显影的时候，胶片放在显影液里，没多久（一分钟内把）就全变黑了，但是直接把胶片放在定影液里仍然是透明的，请问下是胶片被曝光了还是显影液有问题啊。今天看到一句话“在加荧光剂后，反应大概一到四分钟。小心把膜放到暗盒里，放好后再也不要移动膜，否则荧光会消失。”这个是真的吗？？？谢谢你的回答~~~

作者: 04906 时间: 2012-12-1 14:50

初学WB，请问什么是预染marker？有什么实验上的优势吗？另外，我的目的蛋白，34KD和38KD，湿转膜，多少电压和多长时间合适？

作者: eric930 时间: 2012-12-1 14:51

请教版主：我们做的是190KD的蛋白，原来师姐用的是厚度为1mm的胶，转膜条件为恒流300mA，1h20min；我们现在用的是厚度为1.5mm的胶，转膜条件为恒流300mA，1h30min。师姐的能做出来，我们的不行。考虑到可能是没转上去。请问胶的厚度是主要的原因吗？

作者: 831226 时间: 2012-12-1 14:51

请教版主：我们做的是190KD的蛋白，原来师姐用的是厚度为1mm的胶，转膜条件为恒流300mA，1h20min；我们现在用的是厚度为1.5mm的胶，转膜条件为恒流300mA，1h30min。师姐的能做出来，我们的不行。考虑到可能是没转上去。请问胶的厚度是主要的原因吗？

作者: hyuu 时间: 2012-12-1 14:52

本人刚开始做western，做了两次ECL发光后膜上均没有条带，
一抗和二抗都是按照说明书上推荐的稀释度，一抗1：1000
二抗1：3000，转膜后marker全部转导膜上，
蛋白跑过胶后用过考马斯亮蓝染色能看多条带。只是浓度
不是很高，我做的是内参ACTIN，实在是不知道问题出在什么地方了！
很是着急，希望师兄师姐给点帮助，万分感谢！！

作者: 66小飞侠 时间: 2012-12-1 14:52

有个问题一直不太明白，Western显影，有时在50KD出现一条特别浓的带，理论上说应该是免疫球蛋白的重链，在30KD左右对应的是轻链。但是它们究竟是如何产生的，即如何显在膜上的？不太明白。请高手指点。

作者: glass 时间: 2012-12-1 14:53

我做家蚕各个组织中PNPO蛋白的western，想问问楼主家蚕总蛋白怎么提取效果最好

作者: dog002 时间: 2012-12-1 14:53

我现在做的蛋白是3K左右的，电泳条件为非变性电泳，电泳结束后部分GEL进行考染（脱色后可见目的条带），部分GEL进行转膜（0.1umNC膜），半干式转移，时间为20min，条件为恒压18V，转印结束后进行一、二抗（HRP）孵育。用DAB显色后看不到目的条带，请赐教。

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:54

请问我要提取的蛋白有胞浆蛋白，胞核蛋白和总蛋白，是不是用的裂解液不一样？我该怎么提取，谢谢！

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不一样的
总蛋白有总蛋白提取的试剂
胞浆、胞核有提取的试剂盒

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:55

昨天显影的时候，胶片放在显影液里，没多久（一分钟内把）就全变黑了，但是直接把胶片放在定影液里仍然是透明的，请问下是胶片被曝光了还是显影液有问题啊。今天看到一句话“在加荧光剂后，反应大概一到四分钟。小心 ...

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应该是胶片走光了

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:55

初学WB，请问什么是预染marker？有什么实验上的优势吗？另外，我的目的蛋白，34KD和38KD，湿转膜，多少电压和多长时间合适？

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预染marker可以肉眼看见跑电泳时蛋白条带
可以实时判断电泳程度
当然也有很多缺点

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:55

初学WB，请问什么是预染marker？有什么实验上的优势吗？另外，我的目的蛋白，34KD和38KD，湿转膜，多少电压和多长时间合适？

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湿转：300mA 1h

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:56

请教版主：我们做的是190KD的蛋白，原来师姐用的是厚度为1mm的胶，转膜条件为恒流300mA，1h20min；我们现在用的是厚度为1.5mm的胶，转膜条件为恒流300mA，1h30min。师姐的能做出来，我们的不行。考虑到可能是没转上去 ...

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样品一样吗？
蛋白提取出来没有？
和你师姐还有什么地方不同？
建议：300mA 2h30min

作者: owanaka 时间: 2012-12-1 14:57

考马斯亮蓝G-250容易变质吗？
我的考马斯亮蓝G-250 （固体粉末）amersco 的，用来测蛋白浓度，买了半年，室温放置，刚买时配制的考马斯亮蓝G-250染料试剂，配制出来为棕红色，使用起来很稳定，现在配制的成了青色，使用紫外分光光度计，测定数值也很不稳定，数值逐步在减小，这是怎么回事呢？请高手解答，谢谢！

作者: 831226 时间: 2012-12-1 14:57

其他试剂换了没有？

作者: 8princess8 时间: 2012-12-1 14:58

请问电转时如果时间过长对蛋白转到膜上会有影响么？

作者: 9900 时间: 2012-12-1 14:58

蛋白提取没问题，用考马斯染过以后能看见蛋白条带。跟师姐主要就是胶的厚度不同。
谢谢版主。

作者: wood533 时间: 2012-12-1 14:59

请问电转时如果时间过长对蛋白转到膜上会有影响么？

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时间过长蛋白会穿过膜

作者: ero11 时间: 2012-12-1 14:59

请问显影液和定影液怎么回收处理？

作者: 987789 时间: 2012-12-1 15:00

裂解组织用什么裂解液?我以前做western bolt都是裂解细胞的，用RIPA弱裂解的，现在要裂解老鼠的肝脏和肿瘤组织做western，请问该用什么样的裂解液？是要将剪碎的组织加裂解液匀浆然后离心吗？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-12-1 15:02

我昨天做的WB，转膜后MARK的的几条带都显示很清晰，但是我的样品一个带没显示，我取了0.2克的组织，加了1毫升的裂解液，裂解2个小时，请问楼主是哪里出现问题了？谢谢

作者: PINK 时间: 2012-12-1 15:02

用密封的容器回收
隔绝空气能用很多次

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:03

裂解组织用什么裂解液?我以前做western bolt都是裂解细胞的，用RIPA弱裂解的，现在要裂解老鼠的肝脏和肿瘤组织做western，请问该用什么样的裂解液？是要将剪碎的组织加裂解液匀浆然后离心吗？

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选择组织蛋白抽提试剂啊
也可以用RIPA试试

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:03

我昨天做的WB，转膜后MARK的的几条带都显示很清晰，但是我的样品一个带没显示，我取了0.2克的组织，加了1毫升的裂解液，裂解2个小时，请问楼主是哪里出现问题了？谢谢

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加裂解液后匀浆了？

作者: junjie05 时间: 2012-12-1 15:03

请问下电泳的时候条带离散是什么原因，谢谢

作者: 3N4G 时间: 2012-12-1 15:04

没有匀浆，直接做下面的步骤了。还有没有别的可能性呢？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:05

没有匀浆就做后面的步骤怎么能提出蛋白呢？
另外提取的时候注意在冰上进行
加蛋白酶抑制剂

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-1 15:05

可能抗体为多克隆的，另外就是封闭和抗体的比例

作者: zranqi_1 时间: 2012-12-1 15:06

问个内参选择的问题。
检测fibronectin，现在用的beta-actin作内参，结果fibronectin条带已经很粗了，actin的条带只是隐约可见的一条，actin只稀释了250倍，250mA，转膜2h，伯乐湿转。
我现在想的是，actin的含量相比fibronectin太低，换一个内参，那哪种内参含量高点呢？或者是不是其他地方出了问题？
谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:06

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2012-12-1 15:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

问个内参选择的问题。
检测fibronectin，现在用的beta-actin作内参，结果fibronectin条带已经很粗了，actin的条带只是隐约可见的一条，actin只稀释了250倍，250mA，转膜2h，伯乐湿转。
我现在想的是，actin的含量相比fibronectin太 ...

可能是内参抗体的特异性不强
建议你换个内参抗体试试

如果说你要换内参蛋白
可以试试GAPDH

作者: sunnyB 时间: 2012-12-1 15:07

楼主您好，我测血清样品，ELISA结果和WESTERN-blot结果不相符合。ELISA值低的（阴性样品）western是阳性有条带。侧过多次一样。不知是哪方面问题？希望楼主指点。

作者: caihong 时间: 2012-12-1 15:07

我ECL显色肉眼可观察到条带。我用柯达的胶片压片2分钟，显影1分钟，却没有条带。而且整张片子都是黑的。胶片是3年前买的，有问题吗。
另外，我在Western Blotting专题看到ECL直接成像的，也听说这种方法。不知如何操 ...

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有发光应该是会有条带的，我也出现过这种情况，你把曝光和显影的时间延长看看。

作者: caihong 时间: 2012-12-1 15:08

ECL直接成像操作比较简单，效果也要好，如果是做半定量用显影仪最好了。不用显影和定影，也不用胶片。具体操作，你们如果有仪器的话，问一下老师就行了

作者: yapuyapu 时间: 2012-12-1 15:08

我做western ，用丽春红染色有条带出现，但是加一抗二抗之后没有任何东西，换了两家的抗体了，均没有条带产生。中间会有什么原因？

作者: 9900 时间: 2012-12-1 15:10

WB反复做了几个月了，由于蛋白为160KD（rock2）大小大鼠组织胞浆蛋白，就是不出阳性条带。过程：液氮磨碎组织，凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白，之前试过裂解液。蛋白浓度在7ug/ul左右，上样15-20ul，100度变性5min，以8%分离胶，80V 30 min ,120V 60min,用PVDF膜，0.4A湿转转过2-5.5小时，封闭5%脱脂奶粉/TBST(TBS+0.05%TWEEN20）1h,一抗（稀释液脱脂奶粉/脱脂+BSA/碧云天的专用稀释液）（1：500，abcom多克隆抗体）4度过夜，2抗（1：300）37度孵育1h，ECL发光，结果显示，95KD及72KD处出现两条明显亮带，160KD处只出现过一次浅带，跑β-actin没问题。请问这是什么原因，找人咨询说可能是蛋白断裂为两个段，实在找不出其他原因，请斑竹帮忙分析下，需要在提供详细的资料，我再发帖，非常感谢！

作者: kuohao17 时间: 2012-12-1 15:10

你好：
我做的Western blot结果中各泳道同一位置的条带都连了起来，由于我要比较各道量的差异，所以这样的结果不能用呀，我上样量为每泳道上293T 细胞 6孔板一孔的六分之一，约12微升，检出的目的条带并不粗，还有杂带（抗体是自己打的），请问条带“牵手”是怎么回事呢？怎么解决呢？谢谢！

作者: bs4665 时间: 2012-12-1 15:10

您好！
我的蛋白5kD，跑的Tricine胶，转0.45um的NC膜0.8mA/平方厘米40min，失败。
现在想换0.45um的PVDF膜,因为实验室只有0.45的，请问可行吗？有什么建议？
谢谢！

作者: pencil菲 时间: 2012-12-1 15:11

电泳蛋白上样量必须在20--40ug 之间嘛？？我的蛋白含量10ug 难道就跑不出条带吗

作者: www.1 时间: 2012-12-1 15:12

我想测一下血液中是否有目的蛋白的表达，有的只是目的蛋白的多克隆抗体，是否跑血清电泳的话会有很大的影响，是否都可能没结果啊？

作者: PCR 时间: 2012-12-1 15:16

请问楼主，我做western也很久了，最近出现一个问题是，转nc膜（高质量的watermannc膜超贵）后看到：预染marker转过去了，靠马斯亮蓝染色剩余的胶，也基本没有条带了。但是发现1-2抗杂交和洗涤后，marker慢慢的变浅色，最后显色，背景异常干净，全白，什么条带都没，目的条带也没！请问是什么问题？总蛋白上20ug每个孔。以前杂出来过结果，唯一不同就是上样buffer换了个公司，里面有dtt，样品蛋白都是同一管，-80存着，反复冻融使用。marker质量很好的绝对没问题。请指点下这个现象何解？为何会掉色？！蛋白也洗掉了所以没带？

再问几个问题：
1，蛋白loading buffer里面的加dtt和巯基乙醇作用有什么区别？
2，加入dtt后会影响目的蛋白和1抗的结合？或者说改变了目的蛋白的高级结构，影响抗原结合位点啥的？我的一抗是单抗。
3. 蛋白反复冻融对western有什么影响？
4.ap标记的二抗的显色一般要多久？用的是化学法，显色剂是ncip/nbt那种。几分钟不出条带可以放弃视为没有？

作者: cocacola 时间: 2012-12-1 15:17

我的目的条带做出来了，可内参beta-actin却没有出现条带，这可能是什么原因？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:17

我做western ，用丽春红染色有条带出现，但是加一抗二抗之后没有任何东西，换了两家的抗体了，均没有条带产生。中间会有什么原因？

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目的蛋白是什么？
抗体是那两家的？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:17

WB反复做了几个月了，由于蛋白为160KD（rock2）大小大鼠组织胞浆蛋白，就是不出阳性条带。过程：液氮磨碎组织，凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白，之前试过裂解液。蛋白浓度在7ug/ul左右，上样15-20ul，100度变性5min， ...

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整个操作基本没有问题
上样量已经足够大了（我一般上样量采用30ug）
这么大的上样量已经超出了凝胶的分辨率了
试一下不同的一抗稀释度，如果条带结果没有改善只能换抗体了

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:18

你好：
我做的Western blot结果中各泳道同一位置的条带都连了起来，由于我要比较各道量的差异，所以这样的结果不能用呀，我上样量为每泳道上293T 细胞 6孔板一孔的六分之一，约12微升，检出的目的条带并不粗，还有杂 ...

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减少上样量

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:18

您好！
我的蛋白5kD，跑的Tricine胶，转0.45um的NC膜0.8mA/平方厘米40min，失败。
现在想换0.45um的PVDF膜,因为实验室只有0.45的，请问可行吗？有什么建议？
谢谢！

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0.45的估计不行
还是换用0.22的吧

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:20

电泳蛋白上样量必须在20--40ug 之间嘛？？我的蛋白含量10ug 难道就跑不出条带吗

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要看目的蛋白的丰度如何
如果说20ug能做出来
那么10ug也会有条带，不可能存在有与无得差别

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:21

我想测一下血液中是否有目的蛋白的表达，有的只是目的蛋白的多克隆抗体，是否跑血清电泳的话会有很大的影响，是否都可能没结果啊？

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人血清？
什么蛋白？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:21

请问楼主，我做western也很久了，最近出现一个问题是，转nc膜（高质量的watermannc膜超贵）后看到：预染marker转过去了，靠马斯亮蓝染色剩余的胶，也基本没有条带了。但是发现1-2抗杂交和洗涤后，marker慢慢的变浅色 ...

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DTT与巯基乙醇作用相同，打断二硫键

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:22

我的目的条带做出来了，可内参beta-actin却没有出现条带，这可能是什么原因？

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1、一抗是否识别你这个五种
2、换一抗

作者: bring 时间: 2012-12-1 15:23

做289kD的mTOR蛋白，请教用多大浓度的胶电泳，转膜的条件（电压或电流为多少？）和时间。

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:23

QUOTE:

原帖由 bring 于 2012-12-1 15:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做289kD的mTOR蛋白，请教用多大浓度的胶电泳，转膜的条件（电压或电流为多少？）和时间。

8%分离胶
转膜：湿转，横流 300mA 2h30min或者3h

作者: bring 时间: 2012-12-1 15:24

如果做21kD的VEGF-C呢？用多大浓度的胶电泳，转膜的条件和时间。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-12-1 15:25

老师你好！我最近几张膜做的MARKER很模糊，条带不清楚。转膜条件一直都没有变，半干转一个半小时，以前做的很好，这两次做的不知怎么了膜上MARKER都不清楚，胶上也没有MARKER。请教老师可能是什么原因？

作者: hyuu 时间: 2012-12-1 15:27

您好我想问一下在做WB能不能用目的蛋白的一部分序列作为抗原来得到抗体
因为我所做的蛋白在大肠杆菌中很难表达，所以很难得到相应的蛋白抗原来做抗体，不知道只用前端几十个氨基酸或者后端几十个氨基酸行么？

作者: guagua 时间: 2012-12-1 15:28

请问如果欲检测的蛋白理论pI值9.56，跑得虽然是sds-page变性胶，平时所用的tris-glycine transfer buffer是否可行呢？因为PH大约8.2左右。还是需要pH更高的缓冲系统？因为我用 tris-glycine 在110V下转了两个小时（湿转），发现仍有一小部分蛋白条带留在了胶上。蛋白大小26KD，用0.45um的PVDF不会转出去吧？检测到的条带非常浅。蛋白会不会转到胶的另一面，而不是PVDF膜上？
Thank you at first!

作者: one 时间: 2012-12-1 15:29

请问在暗室中加入化学荧光物质后，能看到强烈的荧光，但底片总是显影不出来，这是为什么啊？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:29

如果做21kD的VEGF-C呢？用多大浓度的胶电泳，转膜的条件和时间。

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15%分离胶
半干转，恒流，1.2mA/平方厘米膜面积
30min

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:35

老师你好！我最近几张膜做的MARKER很模糊，条带不清楚。转膜条件一直都没有变，半干转一个半小时，以前做的很好，这两次做的不知怎么了膜上MARKER都不清楚，胶上也没有MARKER。请教老师可能是什么原因？

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是电泳的时候胶上就没有marker还是转膜后胶上、膜上都没有marker呢？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:36

您好我想问一下在做WB能不能用目的蛋白的一部分序列作为抗原来得到抗体
因为我所做的蛋白在大肠杆菌中很难表达，所以很难得到相应的蛋白抗原来做抗体，不知道只用前端几十个氨基酸或者后端几十个氨基酸行么？

++++++++++++++++++++++++++

可以啊
做抗体用合成多肽做的
就是蛋白的一部分序列啦

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:37

请问如果欲检测的蛋白理论pI值9.56，跑得虽然是sds-page变性胶，平时所用的tris-glycine transfer buffer是否可行呢？因为PH大约8.2左右。还是需要pH更高的缓冲系统？因为我用 tris-glycine 在 ...

+++++++++++++++++++++++++

这种条件我没摸索过
值得试试
蛋白名称是什么？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:37

请问在暗室中加入化学荧光物质后，能看到强烈的荧光，但底片总是显影不出来，这是为什么啊？

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显影液、定影液配套吗？
胶片有没有过期？

作者: ffooll 时间: 2012-12-1 15:38

Junctin, a protein interacting with RyR in Sarcoplasmic reticulum.

作者: ha111 时间: 2012-12-1 15:40

您好！请问我提取蛋白质后为了防止被蛋白酶水解而加了各种蛋白酶抑制剂后（因为取样地方离实验室很远，只能在取样地方把蛋白先提出来）拿到实验室来做WB，会对实验有影响吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:40

QUOTE:

原帖由 ha111 于 2012-12-1 15:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！请问我提取蛋白质后为了防止被蛋白酶水解而加了各种蛋白酶抑制剂后（因为取样地方离实验室很远，只能在取样地方把蛋白先提出来）拿到实验室来做WB，会对实验有影响吗？
...

放置在冰上，时间不要太长
尽快冻存

作者: ha111 时间: 2012-12-1 15:44

2 3天的样子行吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:45

QUOTE:

原帖由 ha111 于 2012-12-1 15:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
2 3天的样子行吗？

那肯定不行撒

作者: ha111 时间: 2012-12-1 15:45

那怎么办，楼主有可行的方案吗？加了蛋白质保护剂后放保温盒里可以撑2 3天么

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:46

QUOTE:

原帖由 ha111 于 2012-12-1 15:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那怎么办，楼主有可行的方案吗？加了蛋白质保护剂后放保温盒里可以撑2 3天么

2-3天扛不住啊

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:46

别灰心
可以用液氮罐保存啊

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:47

用液氮罐运输起来也比较方便啦
打车就行

作者: ha111 时间: 2012-12-1 15:48 标题: 回复 #387 wood533 的帖子

这个办法想到过，但是我要取的动物的肝脏在青海海北一个观测站，别说液氮，就连冷冻离心机都没。我实验室在江苏，就算坐飞机+转车起码得一天左右，何况学校只提供火车。
另外请问下楼主，我取完肝脏后放在-20度的冰箱保存2 3个月，拿出来做WB会对结果又影响吗？到时候在那边想办法看能否买到个小的液氮灌装上样品看能撑40个小时不。
我在那边待3个月，每个月要取20只动物肝脏做实验，到9月份一起给拿回来做实验。

作者: wood533 时间: 2012-12-1 15:48

这个办法想到过，但是我要取的动物的肝脏在青海海北一个观测站，别说液氮，就连冷冻离心机都没。我实验室在江苏，就算坐飞机+转车起码得一天左右，何况学校只提供火车。
另外请问下楼主，我取完肝脏后放在-20度的冰 ...

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可以用干冰啊
-20度保存2个月应该没大问题

作者: u234 时间: 2012-12-1 15:49

同时做21KD的VEGF-C和37KD的GAPDH，因此用了10%的分离胶电泳，转膜用半干转，20V，30min，发现17和26KD的marker都在膜上，未见滤纸上有转过的痕迹。将21KD和37KD蛋白剪开分别孵育一抗，但是结果目的条带完全没有（在目的细胞中应该为高表达），内参GAPDH却表达良好。原因是21KD的蛋白转过头了么还是其他原因？是不是应该用0.2um的膜呢？要同时做这两个蛋白，电泳和转膜的条件又是怎样的？

作者: u234 时间: 2012-12-1 15:49

补充：一抗是用的CST的抗体，转膜缓冲液用的是CST推荐的无SDS的缓冲液。上样总蛋白量为30ug。

作者: wsll 时间: 2012-12-1 16:26

请教个问题 , WB跑完胶后,转膜现在暂时不打算做,怎么保存呢?能保存多久呢?

作者: wood533 时间: 2012-12-1 16:26

封闭后-20度冻存

作者: wood533 时间: 2012-12-1 16:27

补充：一抗是用的CST的抗体，转膜缓冲液用的是CST推荐的无SDS的缓冲液。上样总蛋白量为30ug。

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可以用0.22um的膜，但是0.45um的膜也不会有问题
CST的抗体稀释度你做了那个稀释度？

作者: tangxin_80 时间: 2012-12-1 16:27

我觉得理论上是可以不用加，但是实际操作中外界的干扰因素太多，比如膜被污染。不封闭背景会大。

作者: utt0989 时间: 2012-12-1 16:27

用的是1：1000.

作者: utt0989 时间: 2012-12-1 16:28

最近做289kD的mtor蛋白，用了8%的胶电泳，80V跑30分钟，110V跑了3小时，至300KDmarker进入分离胶后开始转膜（转膜液中忘了加SDS），转了5小时30分钟，结果仅看到膜上有不完整的条带。后来又用了含ＳＤＳ的转膜缓冲液，转了６小时３０分钟，结果条带较完整但是太弱了，比第一次还弱。两次上样量均为４０ｕｇ。
1.跑胶的电压是否太低？
2.大分子蛋白转膜液中SDS和甲醇的比例如何调整？
3。隐约看到的条带呈弧形向上是何原因？
4. 胶浓度是否还应降低？
5. 转膜的电流应为多少？时间？
另外，跑了15KD的4Ｅ－ＢＰ１，同样出现了条带不全的现象。用的是１２％的胶，２０Ｖ恒压半干转，转了２５分钟，内参较好，但目的条带已经只剩下中间一段了（可能是因为我用的是０，４５ｕｍ的膜）。上次你回复说用１５％的胶跑，１．２ｍＡ／ｃｍ２膜面积恒流转膜半小时，但我做出来的膜太小，只有５ｃｍ２，就只能用６ｍＡ么，电泳仪最低只能用１０ｍＡ。如何调控。胶一定要用１５％的么？胶的浓度也会影响转膜么．

作者: 987789 时间: 2012-12-1 16:28

版主，你好。做蛋白质方面我是个新手，最近要开始测蛋白质含量及分子量了，要用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。方法我都摸索了，也看了大家的讨论，确实受益匪浅。做了几回预备试验，我觉得我的蛋白质提取的有问题。
我们做的是丁香叶片。采回来加了PH6.8的TSIS-HCL缓冲液和石英砂，磨完就离心，取上清液作为要测的样品，是不是不对啊。得提取叶片中的蛋白质是么？还有就是我知道要加MARKER,但是要买什么样的我一点都不懂，还有就是我要配多大浓度的分离胶啊。因为我也不知道我要测的东西的分子量大约是多少。非常急。也非常感谢！~~~感激不尽！

作者: qhyu 时间: 2012-12-1 16:29

请问为什么抗体孵育的时候室温要求一小时，而要是过夜就得放4度，能不能也放在室温过夜

作者: avi317 时间: 2012-12-1 16:37

我在做杂交的时候发现一个现象：跑SDS-PAGE时，用巯基乙醇做还原剂的时候，杂交条带和用DTT做还原剂的时候不太一样，请问还原剂会影响实验结果吗？会不会出现非特异性的杂交条带？如何避免？
谢谢啦！

作者: DDD 时间: 2012-12-1 16:37

1.电压有点低，没必要这么低，太浪费时间，8%的胶可以先130V，后160V（或先90V，分离胶150V），注意降温；
2.SDS和甲醇如何调整不清楚，不调整应该也可以；
3.弧形可能是梳子的孔底部不平，或浓缩胶和分离胶分界面不平整，或配胶时混匀不充分，少数由于电压过高导致，但你的应该不会，上样量过高也会形成弧形；
4.胶浓度可以降低（如6%），但本人认为只要WB结果没有接近的非特异性条带就无所谓了，关键是目的蛋白能分开并转到膜上；
5.湿转电流300mA，横流4~5小时就可以了（注意降温），具体还需看预染Marker的转膜效果；
6.最好15%的胶（分离小分子量杂蛋白），12%的也可以（目的蛋白不能跑出去），膜用0.22um的很有必要，条件可以半干转10mA横流，20~30min;顺便问下为什么你
的膜只能做成5cm2呢？可以不剪膜啊，浪费了点而已。

作者: u234 时间: 2012-12-1 16:38

非常感谢你的建议，我回头再试试。至于为什么将膜剪那么小，纯粹是因为个人的习惯：能节约就尽量节约吧。

作者: yjf1026 时间: 2012-12-1 16:41

请问楼主，我弄得分离胶不会漏胶，但是我拿水封闭过夜上面的水就没有了，胶还没漏不知道为什么

作者: wood533 时间: 2012-12-1 16:43

请问楼主，我弄得分离胶不会漏胶，但是我拿水封闭过夜上面的水就没有了，胶还没漏不知道为什么

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不会漏胶不好？
水会蒸发掉啊

作者: fsdd817 时间: 2012-12-1 16:44

您好：我是新手，在做wb过程中有些不懂得问题，还烦劳你帮助解答：
1.我的样本是小鼠组织，一抗能否用小鼠来源的单抗，之后用如人或者山羊抗小鼠的二抗？这样的话，二抗能否与样本之间发生交叉反应？
2.在蛋白提取的时，我用碧云天的wb或IP裂解液进行组织裂解，研磨后，10000g离心10min。发现最上层有胶状物质，并没有获得所谓的上清？不知道问题在那里？
3.抗体哪家的较好？
谢谢您的帮助了，最近刚做这个，一些问题可能幼稚了点，但是一直不是很清楚，谢谢您的解答！

作者: wood533 时间: 2012-12-1 16:46

1、小鼠来源抗体能否适用于小鼠在说明书应该有应用种属说明。二抗用某某抗小鼠
2、组织重量与裂解液的比例是多少？
3、你做什么蛋白？那个公司的抗体都有好坏

作者: 831226 时间: 2012-12-1 16:48

总蛋白的话就用SDS裂解液，如果膜蛋白、核蛋白就要温和的裂解液RIPA应该可以，默克都有试剂盒

作者: ending 时间: 2012-12-1 16:49

请问LZ，我的蛋白分子量为124KD，用的是湿转，300mA恒流，2小时，电压在70伏上下波动，这样转移的效率高吗？新手

作者: 66+77 时间: 2012-12-1 16:50

请教一下组织提蛋白的方法，我是小鼠组织大概湿重80-120mg的样子，我是用RIPA裂解液+PMSF，加了80ul玻璃匀浆器匀浆，蛋白浓度不高，后来把裂解液减少到500ul结果提出的蛋白更少。请问各位怎么提组织蛋白好一点，拜谢了

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:11

请问LZ，我的蛋白分子量为124KD，用的是湿转，300mA恒流，2小时，电压在70伏上下波动，这样转移的效率高吗？ ...

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没问题

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:12

请教一下组织提蛋白的方法，我是小鼠组织大概湿重80-120mg的样子，我是用RIPA裂解液+PMSF，加了80ul玻璃匀浆 ...

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80-120mg加500ul裂解液已经很少了
增加匀浆次数
以这个比例提取的组织蛋白至少在10mg/ml以上

作者: vvmmoy 时间: 2012-12-1 17:16

我想知道，蛋白质电泳中圆盘电泳和垂直板电泳有什么区别啊？哪个分离效果好，操作更简单？总之就是想知道哪个更好用。谢谢！

作者: orangecake 时间: 2012-12-1 17:17

老师您好，最近我做Western blot碰到一个很棘手的问题，虽然能看到目的条带，但不管怎样调整条件电泳条带的背景都很黑。我做的步骤是膜浸甲醇15s，milliQ水泡2min，转移Buffer泡20min，转膜15V 30min，封闭5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉 100mlPBST）先室温摇1h再4度过夜，一抗1：5000，二抗1：5000，一抗二抗都是用PBST洗4次，第一次5min，后三次10min。
老师我还有一个问题，请问是否存在这种情况：用TBST做缓冲液就没什么背景而用PBST做缓冲液就有背景。

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:17

想问一下strip的条件以及之后的步骤

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从封闭开始
进行下一轮WB

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:19

如果想用考蓝测蛋白浓度，提取蛋白的时候用什么裂解液比较好啊？能不能给个配方

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配方是裂解液还是考马斯亮蓝法测蛋白的？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:20

我想知道，蛋白质电泳中圆盘电泳和垂直板电泳有什么区别啊？哪个分离效果好，操作更简单？总之就是想知道哪 ...

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两者的实验目的不一样
圆盘电泳的分辨率应该更高一些
看你要做什么了

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:21

老师您好，最近我做Western blot碰到一个很棘手的问题，虽然能看到目的条带，但不管怎样调整条件电泳条带的 ...

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一般不会有这种情况
调整二抗浓度试试

作者: Ao7 时间: 2012-12-1 17:22

为什么我跑出来总有很多带，以致于我无法鉴定哪条是我的目的条带。
一抗我稀释过了，公司说改进封阻条件，我现在封阻液是5%脱脂奶粉，4度封阻过夜。怎样改进封阻？
非常感谢啊

作者: yychen 时间: 2012-12-1 17:22

老师您好，有一次我做western blot发现没有跑样的电泳条带都有背景，请问这是什么原因啊？我一抗和二抗都是洗4次，第一次5分钟，后三次10分钟。

作者: DNA 时间: 2012-12-1 17:23

楼主您好！请问对大分子量蛋白，最需要注意的步骤是什么？比如，我的目的蛋白分子量220KD左右，请问做transfer时是用semi-dry好，还是wet好？如果我只想在250KD与150KD之间找到我的目的蛋白，可不可以transfer之后把膜150KD之后的部分剪掉？然后进行抗体孵育？还有，run gel时一定要等到marker最小的条带跑到胶的底部吗？如果看到marker有8条bands出来，可不可以说明自己想要的目的蛋白已经跑在相应的位置了呢？这时候可不可以stop running呢？谢谢您的宝贵时间！

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:25

为什么我跑出来总有很多带，以致于我无法鉴定哪条是我的目的条带。
一抗我稀释过了，公司说改进封阻条件， ...

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1、用5%BSA-TBST封闭
2、一抗用几个不同的稀释度

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:26

老师您好，有一次我做western blot发现没有跑样的电泳条带都有背景，请问这是什么原因啊？我一抗和二抗都是 ...

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与抗体及ECL有关

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:26

楼主您好！请问对大分子量蛋白，最需要注意的步骤是什么？比如，我的目的蛋白分子量220KD左右，请问做trans ...

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1、8条bands？？？我怎么知道是那八条呢
2、你能确定150K的marker处就是你的目的蛋白吗？不建议从150K切胶
3、大分子量用湿转

作者: langlang 时间: 2012-12-1 17:30

老师，请问为什么会和抗体有关啊？如果是特异性不强的话除了电泳条带其他地方没有背景啊？

作者: pencil菲 时间: 2012-12-1 17:30

我想用wb检测tsa对重组胚的乙酰化影响，看论文里提到说H3K9是最关键的，可是我看有很多人检测的都不是H3k9,有人检测h3k18,h4k几的，为什么呢？是因为别的比较容易出结果？还是抗体比较便宜？因为现在不知道选择哪个好，所以抗体还没买，等着指教，我好做实验。谢谢~~

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:31

我想用wb检测tsa对重组胚的乙酰化影响，看论文里提到说H3K9是最关键的，可是我看有很多人检测的都不是H3k9, ...

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前面有关你研究的东西我哪里能懂呢
如果做WB我倒是还能给你出出主意

作者: utt0989 时间: 2012-12-1 17:31

我在做酶纯化，先把发酵液硫酸铵分级沉淀，结果每一级都有活性，也有蛋白，比活都差不多，一点都没分开。于是我又把分级的沉淀合并过超滤膜，先过的十万的膜，结果蛋白都在十万以上，十万以下几乎什么都没有。我觉得这个结果有问题，怎么可能两种方法都一点效果都没有。而且发酵液里怎么会没有十万以下的蛋白呢？这到底是为什么呢？
我现在准备过柱子，用什么柱材料比较好呢？有没有推荐的？我手上有G-150和DEAD A50,这两个的分离范围是多少啊？
谢谢啦，我问题有点多，呵呵！

作者: 987789 时间: 2012-12-1 17:32

看到这么多人关于WB出的问题，真的有点胆怯了，到底是为什么有这么多不确定性而得不到结果···希望你们都能顺利完成！！

作者: october7 时间: 2012-12-1 17:32

有没有人做过phospho-p42/44 antibody?
我最近用植物材料在做，但是怎么都做不出来，不知道是什么原因。抗体换过多次，应该不是抗体的问题

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:33

有没有人做过phospho-p42/44 antibody?
我最近用植物材料在做，但是怎么都做不出来，不知道是什么原因。抗 ...

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抗体不识别植物来源的p42/44抗原

作者: orangecake 时间: 2012-12-1 17:33

您好，我是初次做WB，实验中遇到一些麻烦，请教。
1、我的蛋白分子量估计在23.8KD，请问PVDF膜选择0.45um的是否合适？
2、转膜时采用的是半干转膜，15伏特/20分钟合适吗？昨天试验了16分钟，丽春红染色发现膜上没什么条带，但是MARKER却可以看到。
3、一抗的说明书的图显示的WB的结果在38KD，不知道这个怎么理解？我的蛋白分子量（我是做基因克隆）只有23.8。

作者: pengke1983 时间: 2012-12-1 17:34

1、可以选择0.45um孔径的
2、半干建议恒流，我不知道恒压的转膜条件，恒流 1.2mA每平方厘米膜面积，40min
3、做WB之前先把SDS-PAGE胶染色
4、条带位置要看说明书，不同厂家的条带位置是不同的

作者: owanaka 时间: 2012-12-1 17:34

请问下可不可以用WB的方法来检测某些蛋白质的可用性和活性，老板让我“Check the availability of MAG”，我只知道WB是用来分离和对蛋白进行半定量的方法，请问如果我找到了MAG的抗体，而且最后能出条带是不是就证明MAG这个东西有用？谢谢

作者: moonlight45 时间: 2012-12-1 17:35

1、8条bands？？？我怎么知道是那八条呢
2、你能确定150K的marker处就是你的目的蛋白吗？不建议从150K切 ...

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谢谢楼主！关于marker的问题我没有说清楚。因为我跑胶时running gel用的是7.5%，所以100V下run，marker跑得很快，等到marker的bands和sample到了底部时，marker的10条带（我们用的marker标的是有10条带）并不能全部显现。是不是在找大分子量蛋白时不需要看到全部的marker bands？谢谢！

作者: PINK 时间: 2012-12-1 17:35

请问下可不可以用WB的方法来检测某些蛋白质的可用性和活性，老板让我“Check the availability of MAG”，我 ...

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MAG是什么？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:36

谢谢楼主！关于marker的问题我没有说清楚。因为我跑胶时running gel用的是7.5%，所以100V下run， ...

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不需要。小分子量有可能会跑出胶外

作者: one 时间: 2012-12-1 17:37

MAG就是一种蛋白

作者: yonger 时间: 2012-12-1 17:37

你好，我配5%milk 的时候忘记是用TBS还是Milli-Q水配的了。然后用它封闭和抗体孵育后，得到的图像没有问题。不过我还是害怕，要真是用Milli-Q配的会有什么不同，会得到好的结果吗？我的结果正常，是不是表示我没有错配？

作者: pengke1983 时间: 2012-12-1 17:37

急求组织胞浆蛋白、总蛋白抽取的原理和方法

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:38

急求组织胞浆蛋白、总蛋白抽取的原理和方法

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总蛋白：细胞破碎，膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白释放后溶解在抽提试剂中
胞浆、胞核分别抽提：用不同的缓冲体系先破膜，抽提胞浆蛋白，保护核膜，第二步再破核膜，提取核蛋白
需要试剂盒可以联系我

作者: 987789 时间: 2012-12-1 17:38

老师，请问我把动物组织放在-20度冰箱冻着 2个月后取出来能否做WB？

作者: langlang 时间: 2012-12-1 17:39

谢谢我做大鼠肝脏组织用的裂解液是单去污剂裂解液（PMSF）
1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

网上找的配方，这个能用么。还是用RIPA

作者: pencil菲 时间: 2012-12-1 17:40

用细胞纯化重组蛋白是什么意思？
需要用到哪些实验呢
谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:40

用细胞纯化重组蛋白是什么意思？
需要用到哪些实验呢
谢谢

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什么意思？

作者: one 时间: 2012-12-1 17:41

版主你好
我做WB有个问题一直没解决
就是我的目的条带很弱，但是杂带也很多，有点矛盾，使得我不知道向哪个方向去调整
另外条带弱会是封闭过度的问题吗，因为杂带多所以我RT下封闭3h 5%milk/TBST（0.1%tween20）
想降低抗体浓度又怕条带更弱了
我一抗santa的用的1：500
一抗洗40-50min 二抗洗40 会不会洗过了？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:41

调整几个不同的一抗稀释度试试
比如1:1000,1:2000
洗膜3min×5次

作者: am10 时间: 2012-12-1 17:41

感谢无私帮助！
我将一段11个氨基酸（一个蛋白的
47-57位氨基酸）的小肽分别融合在我的目的蛋白的n端或c端，用酵母分泌表达，酵母上清SDS-PAGE可以检测到目的蛋白的表达，切胶带质谱也检测到目的蛋白序列，但是这段小肽的酶切位点太多质谱没有检测到，我买了一个针对该小肽的抗体（抗原决定簇为那个蛋白的
47-58位氨基酸），但是做western两次，一次抗体200倍稀释无条带，第二次100倍稀释抗体，封闭常温1个半小时，结果只有非特异性的一条带（是酵母上清中表达量比较大的一条带，并非目的蛋白），请教一下实验是哪里出了问题，可以怎样改进？还是这样的小肽不好检测，如果western不行的话，我还有什么方法可以证明这段序列，恳请帮助！！谢谢！

作者: loli 时间: 2012-12-1 17:42

感谢，我那天刚好试了下一抗1：500和1：800两个浓度
结果发现1：800并没有减少杂带（该有的还是有），而且目的条带更淡了，我怕再降可能目的条带就淡的看不见了，真是个很费解的现象，我还需要继续降一抗浓度么

作者: 831226 时间: 2012-12-1 17:43

你好版主问一下 wb与ellisa有什么区别？他们所检测的蛋白种类有区别吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:43

原理基本相同，基于抗原-抗体反应
WB可以看到蛋白样品的特异性
ELISA敏感性好，快速，操作相对简单

作者: IAM007 时间: 2012-12-1 17:43

不知道我这种杂带有多目的条带又暗的情况应该怎么调整

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:45

调整一抗等实验条件，如果还是不行只能考虑换抗体了

作者: 101010 时间: 2012-12-1 17:47

您好，我做WB快半年了，目的蛋白石63KD，条带有时候做的好，但有时候出来目的蛋白总跟头发丝一样细，蛋白上样量大概40—50ug的样子，对于结果浮动性我掌控不了，找不到原因。我做的条件是10%的分离胶，4%的积层胶。湿转恒流200mA，110min.一抗是CST公司的，二抗是SIGMA的。发光剂显影液什么的都是好的。是不是我的转膜条件不行啊，电流太小？望指教。

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:47

是相同批次的样品吗？
为什么蛋白上样量是40-50ug？而不是一个确定的数值？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-12-1 17:48

最近做了几次Western,压片显影后发现蛋白条带总是连着的，包括内参，界限也不清楚，我上的是50微克蛋白上样量，目的蛋白是74KD,我用的是10%分离胶，请问出现这现象的原因，是不是胶的问题，还是其他原因？

作者: zhezhe 时间: 2012-12-1 17:48

您好，请问连续两天做一张PVDF膜，荧光显色是整张膜都全阳，而且很明显，几秒钟片子就全黑了，暗室中都可以看见整张膜像夜光手表一样亮是怎么回事？我是严格按照操作步骤来的，单独把发光显示剂的A和B液混合滴在空白纸上液不显色，排除了显色液的问题，那是怎么回事呢？怎么克服？

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:49

最近做了几次Western,压片显影后发现蛋白条带总是连着的，包括内参，界限也不清楚，我上的是50微克蛋白上样 ...

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1、延长分离胶聚合时间
2、降低上样量

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:49

您好，请问连续两天做一张PVDF膜，荧光显色是整张膜都全阳，而且很明显，几秒钟片子就全黑了，暗室中都可以 ...

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1、先稀释二抗试试
2、缩短二抗孵育时间

作者: 8s5g 时间: 2012-12-1 17:49

初做WB望高手指教，在做wb之前试剂的选择中，一抗二抗如何选择？比如我想做vtg的定性检测，在蛋白分子量不知道的情况下该如何开始？怎么测定其分子量大小？谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-1 17:52

上一些抗体的网站搜索你想要做的这个蛋白，会有很多说明
常用Abcam、CST、Santa cruz，Millipore、Abnova，Novus等

作者: yonger 时间: 2012-12-2 12:25

ECL抚育5min，在暗室中看整张膜都会发光，胶片曝光5min显影后整个膜都变黑了，不知什么原因？胶片是才买只在暗室中打开过

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:26

是膜变黑还是胶片变黑？

作者: yonger 时间: 2012-12-2 12:26

不好意识，是胶片变黑了。请版主推荐个湿转的条件（蛋白分质量有20多KD，还有55KD的，12%的胶）前几次用半干转（1h）的效果不好。

作者: shenkunjie 时间: 2012-12-2 12:26

显影的时候胶片全黑了肯定是胶片都曝光了，我去做的时候只是稍微开一暗室的门，整张胶片都费（就是跟你说的，放在显影液里全黑了）了，况且你的都已经放了三年了。

另外一个问题无法解答。。。

作者: PINK 时间: 2012-12-2 12:27

请问加一抗时用的杂交袋是怎么使用的，是要自己剪下来，然后封口吗？用什么封口？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:28

不好意识，是胶片变黑了。请版主推荐个湿转的条件（蛋白分质量有20多KD，还有55KD的，12%的胶）前几次用半干 ...

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湿转，300mA恒流，1h

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:29

请问加一抗时用的杂交袋是怎么使用的，是要自己剪下来，然后封口吗？用什么封口？

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需要自己剪好
有封口机

作者: abc816 时间: 2012-12-2 12:31

最近做western,调内参，但是因为上样量不一致，导致条带宽窄不一。
请问，可否在上样时加1*loading buffer补齐（含有SDS）,还是加其他的补齐，不知道会对结果有影响吗？
谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:31

可以用1×的loading补齐
最好是把蛋白浓度调成一致，上样体积就会一致

作者: jkobn 时间: 2012-12-2 12:32

western blot 显影结果连成一条线是什么原因？有什么方法能使相邻泳道的条带断开？寻求大家的指点，谢谢！！！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:33

降低上样量

作者: jkobn 时间: 2012-12-2 12:34

我把上样量降低了，可是泳道中间还是有一点连着，而且减低上样量后目的蛋白的条带变细很多，怎么样能够改善？

作者: jkobn 时间: 2012-12-2 12:34

变性后没有离心过，有沉淀的话会有影响吗？/color]

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:35

样品变性后，离心，有沉淀吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:36

有沉淀的影响很大

作者: nn255 时间: 2012-12-2 12:39

您好，分离14KD的蛋白，分离胶的浓度应该为多大？最近做的用15%的分离胶，效果不好！

作者: jkobn 时间: 2012-12-2 12:39

降低上样量后，目的蛋白的条带变得又浅又细，增大目的蛋白一抗的浓度，可不可以改善这种情况？我原来用的一抗浓度是1:2000，改为多大的浓度合适？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:40

您好，分离14KD的蛋白，分离胶的浓度应该为多大？最近做的用15%的分离胶，效果不好！

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12%的分离胶，溴酚蓝不要跑的太靠底部

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:40

降低上样量后，目的蛋白的条带变得又浅又细，增大目的蛋白一抗的浓度，可不可以改善这种 ...

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有图片吗
以前的图片及改变上样量后的图片

作者: avi317 时间: 2012-12-2 12:41

请问我在做杂交的时候，加样缓冲液中的还原剂不论是巯基乙醇还是二硫苏糖醇，在69KD的位置都会出现一条和杂交条带不是很一样的条带，这是怎么回事呢？
谢谢您的回答！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:41

非特异性条带？

作者: moonlight45 时间: 2012-12-2 12:42

我一抗用1:500,2抗用1:1000，做出来有好几个条带，是不是抗体不好啊

作者: BOSS2011 时间: 2012-12-2 12:42

斑竹，我这两次做的western都杂不要想要的蛋白。。。材料是293T细胞，要杂STAT3和GAPDH，两个都砸不到。。。用的是PVDF膜，转膜后可以看到marker到膜上去了，所以转膜这步应该没什么问题吧。。。加ECL后看不到亮带，曝光后片子看不到条带。。。。很抑郁。。。急切需要斑竹帮助~谢谢啊！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:43

我一抗用1:500,2抗用1:1000，做出来有好几个条带，是不是抗体不好啊

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不能直接这么下结论
你还需要做几个不同的稀释度
另外要看在目的分子量处是否有阳性条带

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:44

斑竹，我这两次做的western都杂不要想要的蛋白。。。材料是293T细胞，要杂STAT3和GAPDH，两个都砸不到。。。 ...

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STAT3分子量多少？
这个蛋白好做啊
用的那得抗体？
转膜条件是什么？
上样量多少？

作者: BOSS2011 时间: 2012-12-2 12:44

STAT3分子量多少？
这个蛋白好做啊
用的那得抗体？
转膜条件是什么？
上样量多少？

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STAT3分子量为81。抗体质量应该没问题，一抗是师兄配的。转膜是200mA,2h。上样量是每孔25、26ug左右。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:45

QUOTE:

原帖由 BOSS2011 于 2012-12-2 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
STAT3分子量多少？
这个蛋白好做啊
用的那得抗体？
转膜条件是什么？
上样量多少？

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STAT3分子量为81。抗体质量应该没问题， ...

一抗是师兄配的是啥意思？
一抗配好了保存着？
不是现用现配？

作者: BOSS2011 时间: 2012-12-2 12:45

QUOTE:

原帖由 wood533 于 2012-12-2 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一抗是师兄配的是啥意思？
一抗配好了保存着？
不是现用现配？

一抗里放叠氮钠了，可以储存大概一个月，二抗是现用现配的。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:47

放了叠氮钠抗体照样会降解

作者: BOSS2011 时间: 2012-12-2 12:50

QUOTE:

原帖由 wood533 于 2012-12-2 12:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

放了叠氮钠抗体照样会降解

你的意思是是一抗的问题？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 12:52

新配一抗试试吧

作者: summerxx 时间: 2012-12-2 13:00

瞬转的细胞内目的蛋白表达差异，用western能检测得出来吗？
做了western，转染的和没转染的蛋白看不出差异，而realtime PCR有明显的差异，有没有可能是因为样品是瞬转的细胞？
谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:00

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2012-12-2 13:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
瞬转的细胞内目的蛋白表达差异，用western能检测得出来吗？
做了western，转染的和没转染的蛋白看不出差异，而realtime PCR有明显的差异，有没有可能是因为样品是瞬转的细胞？
谢谢 ...

蛋白表达与基因表达时间上是有差异的

作者: 薄荷侠 时间: 2012-12-2 13:01

14~18KD的蛋白，转印用的0.45的NC膜，110V 60min 和110V 30min转印都没有条带，要换膜吗？转印条件如何优化一下？谢谢~

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:01

纯化的蛋白还是？

作者: 薄荷侠 时间: 2012-12-2 13:02 标题: 回复 #497 wood533 的帖子

细胞裂解液里面的蛋白

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:03

0.22um膜
100V转膜 20min

作者: zwsyrt 时间: 2012-12-2 13:03

很有可能是显影液的问题建议重新订购配制显影液

作者: zwsyrt 时间: 2012-12-2 13:05

有可能是转膜时间过短电流过低蛋白没转到膜上；也有可能是时间太长转过了

作者: zwsyrt 时间: 2012-12-2 13:05

蛋白提取后不需要马上变性，-20保存都没有问题

作者: zwsyrt 时间: 2012-12-2 13:05

没有条带是指片子很干净什么都没有（包括杂带）吗？如果是这样的话很有可能是显影液出了问题我以前遇到过这种情况

作者: xueyouzhang 时间: 2012-12-2 13:06

LZ,在WB转膜的电压中遇到一些问题。一般转两块膜用一个槽子的时候，恒定电流为035mA，电压一般为80V左右。但是转4块膜的时候，用了两个槽子，连接在一台仪器上，仍然恒流，电压减为50V以下。如果把电泳槽想象为纯电阻，那么在两个槽并联的时候，可以想的通，并联电阻减半，若达到恒流的时候，电压也低。于是又出现一个问题，那就是每个槽子所分担的电流不一样，即低于0.35mA。但是当提高电流的时候，蛋白又大部分转出膜外了，也就是说电流高了。而不提高电压，转膜正常。所以非常不解。我用的是伯乐的电泳仪。谢谢

作者: tianmei001 时间: 2012-12-2 13:07

我提过蛋白后没有加loading buffer 就直接100度 5min 变性了，蛋白变成乳白状，请问我该如何处理？

作者: wu11998866 时间: 2012-12-2 13:07

我想问问如何制备拟南芥的内参tubulin或者其他内参，跟提其他的蛋白可以一起进行吧，谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:08

LZ,在WB转膜的电压中遇到一些问题。一般转两块膜用一个槽子的时候，恒定电流为035mA，电压一般为80V左右。但 ...

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打电话问biorad的技术支持

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:08

我提过蛋白后没有加loading buffer 就直接100度 5min 变性了，蛋白变成乳白状，请问我该如何处理？

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可能蛋白浓度太高，建议你加入loading后把蛋白浓度调整至2-4mg/ml后再变性

你这种情况不好处理，重新提取蛋白吧

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:10

我想问问如何制备拟南芥的内参tubulin或者其他内参，跟提其他的蛋白可以一起进行吧，谢谢

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一起提取

作者: bamboo16 时间: 2012-12-2 13:18

请教分子量在300KD左右，可以选择的蛋白MARK有哪些啊？

作者: xingyi08 时间: 2012-12-2 13:20

有些蛋白含疏水基团，煮沸后，容易形成高分子量聚合物。不知有秀友是否也有类似经历。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:21

请教分子量在300KD左右，可以选择的蛋白MARK有哪些啊？

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fermentas与biorad有

作者: glass 时间: 2012-12-2 13:21

各位师兄姐弟妹好。请问能在bio rad半干转仪使用的海绵垫大概多少钱啊？

作者: sunnyB 时间: 2012-12-2 13:21

小弟刚做WB，请问总蛋白质提取液-20度能放多久，可否反复冻溶

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:22

磷酸化还是非磷酸化目的蛋白？
放2个月应该没问题，避免反复冻融
尽快检测

作者: yjf1026 时间: 2012-12-2 13:22

PAGE胶老是脱胶怎么回事？玻璃板洗得很干净没有气泡。亲和硅烷也涂了很多的。但是一放进醋酸里就以起泡的方式脱胶。

作者: xyw5 时间: 2012-12-2 13:22

做曝光的时候，加入化学发光液，什么都没有，有点怀疑是发光液的问题
想用另一种发光液做一下实验，是直接加入那张膜就可以了，还是要重新处理一下那张膜呢？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:23

膜用TBST或者PBST漂洗一下即可

作者: 8s5g 时间: 2012-12-2 13:25

想请教一下，实验室条件简陋。用滴定管自制层析柱可行吗？

作者: 8s5g 时间: 2012-12-2 13:25

最近做实验，采用了新买来的抗体，但是结果很不好，请问对于新抗体应该怎样处理才能让它发挥最好的效用！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:26

这个问题真是很难
不好意思
如果你有好的经验一起探讨

作者: bamboo16 时间: 2012-12-2 13:26

转膜后为什么Market的红色条带小时了呢？？？半干转！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:27

呵呵
问问marker厂家的技术支持

作者: finger 时间: 2012-12-2 13:28

你好，请问我的一抗用TBST稀释了再做WB会有什么影响？

作者: 987789 时间: 2012-12-2 13:29

我要把蛋白浓度调到一致，可以直接用上样BUFFER来调不？比如：有一个样本的蛋白浓度明显大于其它样本，本来我用的是2乘的BUFFER应该按1:1的比例，我现在在蛋白浓度大的蛋白里面多加一点BUFFER 当做稀释蛋白，这样对蛋白有影响不？那个“蛋白：BUFFER=1:1"这里的BUFFER指2乘的，有什么意义呢？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:29

你好，请问我的一抗用TBST稀释了再做WB会有什么影响？

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什么意思？
是一抗用TBST稀释后保存着
还是稀释了一抗就用来孵育膜？
如果是后者没问题

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:30

我要把蛋白浓度调到一致，可以直接用上样BUFFER来调不？比如：有一个样本的蛋白浓度明显大于其它样本，本来 ...

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像你这么做有点难度哦
最终的loading buffer怎么样才能都变成是1×的呢？

作者: tudou85 时间: 2012-12-2 13:30

请问一下，PVDF膜有没有正反面，有的话应该怎么区分？还有，转膜前，PVDF膜应该用甲醇处理多久，不能超过的时间是多少？谢谢！！

作者: wsll 时间: 2012-12-2 13:31

lz你好，目前我做的蛋白是beta-actin（43kd）和capspase-3（33kd）及其裂解型（17kd），采用12%的分离胶和5%分离胶，转膜条件为半干转，10v，1h，转膜后染胶，可以看到胶上可以看到50kd以上条带，50kd一下条带也可以依稀看到，之后封闭，一抗二抗，最后显色时却发现膜的左半边没有条带，而右半边条带比较清晰，从染胶情况来看蛋白上样量基本一致，不晓得为什么只有半张膜有条带，另外转膜后胶上有条带是不是因为转膜条件有问题比如时间不够。（ps：转膜液配方为甘氨酸，tris base及20%甲醇）
希望能够得到答案，谢谢大家！

作者: tudou85 时间: 2012-12-2 13:32

我现在还在准备实验的过程中，想问一下如何才能知道目的蛋白的大小呢？我看到网站上面有的说是利用uniprot数据库可以，我需要做的是大鼠组织的T- cadherin，利用该数据库找到是714，我不知道什么意思。麻烦哪位高手讲解一下！谢谢！！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:32

请问一下，PVDF膜有没有正反面，有的话应该怎么区分？还有，转膜前，PVDF膜应该用甲醇处理多久，不能超过的 ...

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没有正反面
Millipore的PVDF膜无水甲醇活化10-15s

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:33

lz你好，目前我做的蛋白是beta-actin（43kd）和capspase-3（33kd）及其裂解型（17kd），采用12%的分离胶和5 ...

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抗体孵育时整张膜都覆盖上缓冲液了吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:33

我现在还在准备实验的过程中，想问一下如何才能知道目的蛋白的大小呢？我看到网 ...

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不同公司的分子量位置有差别
具体原因我也不清楚

作者: one 时间: 2012-12-2 13:34

膜是有正方面的，膜一般是一卷一卷的买，内面就是正面，正面稍微粗糙，方面相对要光滑一点！用甲醇泡可以多跑一会，一分钟左右就行了！

作者: one 时间: 2012-12-2 13:34

你买的是哪个公司的抗体，抗体说明书上会说明蛋白分子量的

作者: one 时间: 2012-12-2 13:36

要看你买的哪个公司的抗体，抗体说明书上有写蛋白的分子量！

作者: 00无名指00 时间: 2012-12-2 13:37

求助：最近在做WB，目的蛋白有65KD,50KD，23KD，26KD，内参选用GAPDH，
1）65KD，10%分离胶，用的湿转，伯乐的，PVDF膜，0.22um,65KD的转膜条件是250mA,1h，条带一直都很清楚，但是GAPDH一直很淡，一抗都用到1：200了，蛋白上样量都达到75ug了
2）23kd,26kd的分离胶12%，转膜做过100mA,150mA,200mA,250mA，1h，最后显影什么都没有，立春红染膜有条带，但是不是很浓，GAPDH仍然没有
3）50KD条件和65KD一样，但就是不出条带，所有抗体都是才买两个月的，
自己分析应该是转膜的问题，但是不知道该怎么摸索了，希望版主能够帮忙分析一下，谢谢

作者: cocacola 时间: 2012-12-2 13:37

请问我的目标条带是4KD，请问用15% 的分离胶可以吗？另外转膜时应该用0.2um的膜转吗？用半干转方法时电流和时间条件是什么？谢谢，很急

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:37

蛋白太小
不太好做
用tris-tricine胶吧

作者: duoduo 时间: 2012-12-2 13:38

是不是loading buffer的甘油加少了。上样量不要太多就不会牵手了

作者: duoduo 时间: 2012-12-2 13:38

15%分离胶效果不好，20%差不多能分辨10kda蛋白，Tris-Tricine凝胶能比较理想地分离分子量<10kda的多肽和小蛋白。

作者: duoduo 时间: 2012-12-2 13:39

这个麻烦，你得读爆出片子的灰度，判定浓度

作者: duoduo 时间: 2012-12-2 13:39

可以这样调整，但不精确

作者: mickeylin 时间: 2012-12-2 13:40

没见过你们说的问题，我做WB就只做抗体检测，不跑胶，膜都是做好直接拿来用的

作者: qhyu 时间: 2012-12-2 13:40

您好！由于是新手没什么经验有些问题想和您请教一下我的目的蛋白是44KD，转膜使用恒流好还是恒压好呢？两者大概各是多少需要多少时间呢？我刚做了一次杂带好多一抗稀释比例按推荐1：1000，您能给我点建议么》不好意思提了这么多问题先谢谢您了

作者: duoduo 时间: 2012-12-2 13:41

谢谢楼主，我查到了tricine胶的配方了。但问题是他有一个AB-3和AB-6需要配制，具体如下，AB-3（49.5%）:24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺加水至50ml，过滤4度保存，但问题是，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺不能完全溶于水，然后我就过滤了，但我担心这样浓度低了，达不到49.5%，请问下楼主有办法溶解这样高浓度的丙烯酰胺吗？

作者: xue258 时间: 2012-12-2 13:45

最近做WB遇到不少问题：
（1）背景很高，目的条带很细很淡。蛋白上样量80ug，10％脱脂奶粉＋1％BSA 过夜（4度），santa一抗1：200室温1h，二抗1：2500室温1h，每次漂洗10分钟×3次。加上ECL后整张膜都发亮。后来将一抗调整到1：400、1：800，二抗分别试过1：5000、1：10000，背景虽然浅些，目的条带更淡，根本不能分析。请问：如何解决？请教4度孵育过夜是指放在冰箱内静置还是摇床？
（2）最近两次压片子后，目的蛋白和内参都没有条带，背景还很深。后来重新跑胶再染色，发现胶上什么也没有。蛋白样品还是用的以前的，只是重新煮的蛋白。似乎蛋白降解的可能性不大，会是什么原因呢？请斑竹赐教！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:46

您好！由于是新手没什么经验有些问题想和您请教一下我的目的蛋白是44KD，转膜使用恒流好还是恒压好呢 ...

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抗体需要做不同的几个稀释度。你可以试试1:2000,1:4000
转膜的条件一般依据实验室的经验
我常用300mA 恒流，转膜40-50min

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:47

谢谢楼主，我查到了tricine胶的配方了。但问题是他有一个AB-3和AB-6需要配制，具体如下，AB-3（49.5%）:24g ...

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可以加热至50-60度溶解丙烯酰胺

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:47

最近做WB遇到不少问题：
（1）背景很高，目的条带很细很淡。蛋白上样量80ug，10％脱脂奶粉＋1％BSA 过夜（ ...

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样品的问题我就不知道了
封闭及稀释抗体可以采用3% BSA-TBST
4度过夜在摇床上摇着当然好
静置也没问题

作者: vera+ 时间: 2012-12-2 13:47

第一次做的时候用三种不同的裂解液做的单一胶转印的膜去检样品，目标条带出来了而且很明显强度深；杂带有，但是不明显。可是后来用同样三种的裂解液跑多孔胶再去检同样的样品，抗体没有出来，反而非目标条带很强。这是什么回事儿？

作者: kswl870 时间: 2012-12-2 13:48

在做WB的过程中，封闭和孵育的效果跟温度有关系吗？如果有的话最适合的温度是多少？谢谢斑竹！

作者: guagua 时间: 2012-12-2 13:48

转膜之后，marker挺清楚的，但抗体孵育之后，再发光，膜的最后一条带总是出来不全，是什么原因？我做了三次，同时转的两张膜，最后发光都出现这个问题。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:49

在做WB的过程中，封闭和孵育的效果跟温度有关系吗？如果有的话最适合的温度是多少？谢谢斑竹！

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有关系
封闭一般室温30min
一抗孵育4度过夜

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:49

转膜之后，marker挺清楚的，但抗体孵育之后，再发光，膜的最后一条带总是出来不全，是什么原因？我做了三次 ...

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最后一条带指分子量最小的还是？

作者: zranqi_1 时间: 2012-12-2 13:50

我的做出来显色后什么都没有，连背景色都没，不知道是什么原因，请您赐教。谢谢。

作者: owanaka 时间: 2012-12-2 13:50

请教，能有什么办法从肠膜酶解水里的蛋白提取出来，量大但不要求纯度。

作者: ququer787 时间: 2012-12-2 13:51

请问老师：我做的是一个分子量8.7KD的蛋白的WB 这种小分子量蛋白的WB 在分离胶浓缩胶的选择 PVDF膜的选择电泳时电流的大小和时间转膜的时间和电流大小等方面有没有经验请老师讲下！谢谢

作者: DONT 时间: 2012-12-2 13:51

我才买的蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制剂，可是蛋白酶抑制剂是粉末装的5mg. 请问这两者要如何配制呢？谢谢～

作者: star#room 时间: 2012-12-2 13:52

您好，我的western blot的显色是用的DAB显色液显色，用数码照相的，这个图片可以用什么软件进行分析呢？我想比较各组蛋白的区别，是用灰度还是光密度，能说明那个软件的具体操作吗？谢谢

作者: is2011 时间: 2012-12-2 13:52

您好版主
我有个目的蛋白总是不出特异性的条带，ECL发光后膜上弥漫性的发光，相同的条件跑出来的内参和别的目的蛋白都很清晰，请问版主是哪儿的原因啊？会不会是一抗有问题，我用的是中杉金桥进口分装的。
谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:52

考虑一抗问题

作者: wanglaoshi 时间: 2012-12-2 13:53

我想问一下，你们浓缩胶会缩的很厉害吗?我经常是把一个泳道都缩没有了，我的配方是这样的，3ml双蒸水，0.7ml丙烯酰胺溶液（29.2g丙烯酰胺、0.8g甲叉双丙烯酰胺，再加100ml双蒸水配置而成。），PH6.8Tris-HCl溶液1.22ml，10%SDS50ul，10%APS50ul，3ulTEMED，混合后（我是轻轻混匀的），立即灌胶的。分离胶没有问题，但是浓缩胶一直存在问题。郁闷哪！还请各位指教啊！

作者: 阿司匹林 时间: 2012-12-2 13:54

要加甲醇的吧。。。我最近转膜都没问题

作者: 阿司匹林 时间: 2012-12-2 13:54

你好，我用DAB染色没有条带，是什么原因呢，丽春红染色是有条带的啊

作者: ladyhuahua 时间: 2012-12-2 13:55

是否可以帮我看看，我的电泳条带是否正常，为什么是一条很宽的带呢？

SDS-PAGE胶12%，目的蛋白是28KD。上样量是45微克。上样时，样品很容易溢出加样孔。

请指点

图片附件: 222354ngg0oo70xhksp9ol.jpg (2012-12-2 13:55, 170.31 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14262

作者: 8s5g 时间: 2012-12-2 13:55

您好，想询问一下几个问题，不胜感激。我做的是HEK293A瞬时转染之后目的蛋白表达情况的检测，目的蛋白约140KDa，细胞膜和细胞质中均有存在。问题如下：
1、由于细胞裂解液要先做荧光素酶的活性检测，用检测试剂盒中自带的universal lysis buffer裂解，请问这种裂解液裂解后得到的样品可以直接加loading buffer跑胶做WB麽？
2、之前做的几次背景噪音很大，一抗是sigma小鼠来源的抗his单克隆抗体，1:1000室温孵育2小时，二抗Jackson羊抗小鼠HRP偶联抗体，1:5000室温孵育1小时。用纯化的50KDa蛋白做阳性对照，很干净。但是我的细胞裂解液就很杂，显影胶片曝的黑黑的一片。想知道是抗 his的抗体本身特异性就差，还是细胞裂解液本身蛋白太多造成的特异性差呢？因为很多文献上也是做细胞裂解液，但是条带都很干净漂亮。（但是他们都不是his标签）
3、其实就想用WB来说明瞬时转染的表达量，想询问楼主瞬时转染的表达量是不是只能用WB看呢？因为SDS-PAGE根本看不到条带。用Nano drop测A280也测不出值，不知道这样做是否是合理的。
先想到这些问题，谢谢楼主，急切盼望回复。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:56

1、这种裂解液提取的蛋白应该直接可以加loading处理后进行WB（拿一个样品试试）
2、背景噪音大的话调整一抗与二抗的浓度
3、WB是一种主要的方法，用A280来测肯定不行
还可以试试流式

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:56

luoxiaomin0 发表于 2010-11-21 22:32
是否可以帮我看看，我的电泳条带是否正常，为什么是一条很宽的带呢？

SDS-PAGE胶12%，目的蛋白是28KD。上 ...

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上样量太大
降低上样量
另外你用的loading溴酚蓝浓度有点高
溴酚蓝只是一种指示剂，只要能看到蓝色就可以了，不起别的作用

作者: KGZ564 时间: 2012-12-2 13:57

最近开始涉及western了太好了不知楼主的问答会开多久一定要一直顶起啊！！！

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-12-2 13:57

我的蛋白分子量只有11KD转膜时间应，电压控制多少啊？

作者: flower-201 时间: 2012-12-2 13:57

第一次做的时候目的的位置是对的，再后来做的几次都比原来的位置高了偏大十几个KD，就是目的条带正好从下面跑到了上面，请问是什么原因，其余的非特异性条带很淡，可以忽略，还有内参也比marker偏高2-3个KD，请问什么原因，感激不尽。（麻烦把可能的原因都说下。）

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:59

我的蛋白分子量只有11KD转膜时间应，电压控制多少啊？

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0.22um孔径膜
电压我没经验
用恒流，半干转，1.2mA/平方厘米膜面积，20min

作者: wood533 时间: 2012-12-2 13:59

第一次做的时候目的的位置是对的，再后来做的几次都比原来的位置高了偏大十几个KD，就是目的条带正好从下面 ...

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分离胶的高度高低不同
会对泳动距离有影响
进而影响分子量位置

作者: zsxan1990 时间: 2012-12-2 14:00

转膜的时候有没有可能蛋白穿过膜转出去了，谢谢楼主

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:00

小分子可能会

作者: yueban-1147 时间: 2012-12-2 14:01

还有一个问题，就是同一个蛋白和同一个marker，用不同浓度的胶跑，目的蛋白和maker的相对位置会不会不同？比如说用10%的胶目的蛋白在74，用12%的胶目的蛋白就可能在90的位置。真的很焦虑啊，为什么位置总是不对。。多谢了

作者: zsxan1990 时间: 2012-12-2 14:01

谢谢楼主，患有一个问题就是跑电泳时溴酚蓝带相当于多大的marker啊？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:02

QUOTE:

原帖由 zsxan1990 于 2012-12-2 14:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主，患有一个问题就是跑电泳时溴酚蓝带相当于多大的marker啊？

这种现象很正常

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:02

QUOTE:

10K以下，好像是6K左右

作者: kuaizige 时间: 2012-12-2 14:03

我想在转膜前暂时把跑好的胶保存起来，过一段时间后再转膜。请各位指点一下怎么样保存才能使条带不扩散

作者: lgm 时间: 2012-12-2 14:04

你好，我只知道真菌蛋白的一个亚基的序列，此蛋白总共有3个亚基。我怎样对这个蛋白进行研究呢。能给我一个大致的实验方案吗？非常感谢!

作者: yueban-1147 时间: 2012-12-2 14:05

真的很不好意思我还是没明白，就是说我的目的蛋白大小是70，结果在70看不到带，而在85有一条明显的带，这是我的目的吗，如果是，是什么原因，如果不是，那又说明什么，我该怎么办? 愿不吝赐教，感激涕零.....

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:06

QUOTE:

原帖由 yueban-1147 于 2012-12-2 14:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
真的很不好意思我还是没明白，就是说我的目的蛋白大小是70，结果在70看不到带，而在85有一条明显的带，这是我的目的吗，如果是，是什么原因，如果不是，那又说明什么，我该怎么办? 愿不吝赐教，感激涕零.....
...

条带特异吗？

作者: yueban-1147 时间: 2012-12-2 14:06

是和我说的吗，条带还是很明显的，10微克就可以有带，30微克的上样量就颜色很黑了，下面有几条很浅很细的非特异性条带，但是就是位置不太对，大于说明书给出的蛋白量约15个KD，不知该怎么办，（第一次做的位置对，再后来做了十来次都在第一次的位置上面，蛋白还是原来的蛋白，条件都没变）太谢谢你了

作者: www.1 时间: 2012-12-2 14:06

楼主你好，很感谢你能帮助我们~
我的蛋白是4kd，我之前用两层胶跑，条带是弥散的，现在换三层胶跑，请问我要是做western blot的话，转膜要用多大电流多长时间啊~跑小蛋白还需要注意啥不？

作者: www.1 时间: 2012-12-2 14:07

忘了说，我做的是半干转膜~

作者: www.1 时间: 2012-12-2 14:07

nihao我也跑小分子的蛋白，我的是4kd的，我目前用的是20%的tricine-sds-page，三层胶，不知道你跑的效果好不，请问你用湿转还是半干转膜啊，我这做的是半干的~
希望我们能相互帮助，谢谢

作者: kuaizige 时间: 2012-12-2 14:07

谢谢，我再摸索一下。
另外，我想问一下：电泳时，两块胶一起跑的恒流值和跑一块胶的值怎么设定，有没有什么比例关系？

谢谢了~~

作者: DONT 时间: 2012-12-2 14:08

你好，我正在做一个分子量为12KD左右的蛋白，但是western怎么也杂不出带来，阳性对照有带，不知道楼主可以对实验条件给点建议吧，我用的是半干转移法

作者: jrwyyplt 时间: 2012-12-2 14:09

版主你好，我想请问。
我是做的是血红蛋白质自由基（变性后分子量大概是17KD），
1）用实验室合成的生物素化的捕捉剂捕捉蛋白质自由基，也就是形成PROTEIN-捕捉剂-biotin。所用的自由基捕捉剂是个分子量只有三四百的小分子，但是捕捉剂用量确实蛋白质用量的几百倍，捕捉剂本身不带电荷（不知道电泳后会不会扩散在整个膜上都是），
2）捕捉后，将protein-捕捉剂-biotin在loading buffer（含有巯基乙醇）中处理，然后将样品进行电泳分离。
3）电泳分离后，按照90mA 1h，进行电转移（17kd的蛋白分子，这个条件还可以转移完全吧？），丽春红显色后，有目的蛋白条带，
4）电转以后进行5%bsa封闭，室温2-3h。
5）在2%or5% bsa 中孵育anti-biotin-hrp 室温2h or 4℃过夜。
6）用0.1%tbst 洗涤抗体 3*10mins 。
7）ecl发光液显影。
显影的结果一般是整个膜都很亮，有时候淬灭很快，而且貌似是从中间的目的条带那里开始扩散着往整个膜淬灭，直至一片黑暗。
所以想请教你的问题是
1）捕捉剂用量确实蛋白质用量的几百倍，捕捉剂本身不带电荷（不知道电泳后会不会扩散在整个膜上都是），所以孵育抗体时，整个膜都结合，从而结果是整个膜都很亮，
2）显影整个膜都亮，是不是抗体浓度太大了，还是有可能抗体的选择性不好，和牛奶或bsa都结合（国产的，军科院产的）

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-2 14:09

做WB之前提取的总蛋白，每次从细胞提取很麻烦，可以一次提取大量之后放-70°C冰箱保存吗？需要加蛋白抑制剂吗？用量多少？蛋白还需要别的处理吗？谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:09

做WB之前提取的总蛋白，每次从细胞提取很麻烦，可以一次提取大量之后放-70°C冰箱保存吗？需要加蛋白抑制剂 ...

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提取蛋白需要加抑制剂！
提取后在-70度保存是可以的

作者: 张先生 时间: 2012-12-2 14:10

问一下各位，为什么我在跑完SDS-PAGE转膜的时候，预染的Marker都可以转过去，而目的蛋白不能转过去，我用丽春红检验没有转过去。我的目的蛋白73KD，还有一个是55KD，200mA电转4小时，湿转。

作者: applebook=213 时间: 2012-12-2 14:10

BIO-RAD凝胶成像系统进行ECL显色具体步骤和注意事项是？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:11

问一下各位秀友，为什么我在跑完SDS-PAGE转膜的时候，预染的Marker都可以转过去，而目的蛋白不能转过去，我 ...

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新蛋白样品提完蛋白后，SDS-PAGE后先染胶

作者: wood533 时间: 2012-12-2 14:11

BIO-RAD凝胶成像系统进行ECL显色具体步骤和注意事项是？

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凝胶成像系统能拍到荧光结果吗？
好像不行

作者: ero11 时间: 2012-12-2 14:12

我用预染marker做western转膜，PVDF 200mA 20min, 做的内参43kD，结果PVDF膜上基本上没有marker,看见都转过了，滤纸上明显的marker印迹，请问是什么问题？谢谢。

作者: orangecake 时间: 2012-12-2 14:58

我用预染marker做western转膜，PVDF 200mA 20min, 做的内参43kD，结果PVDF膜上基本上没有marker,看见都转过 ...

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你是用的半干转吧？我一直用的是湿转。你的应该是转膜转过了，降低电流或者缩短时间试试。

作者: orangecake 时间: 2012-12-2 14:59

湿转 BIORAD

那就是转膜的时候电极搞反了。我湿转用的是350mA 60-90min。

作者: yapuyapu 时间: 2012-12-2 15:00

你的电转液是怎么配的？？？我们实验室的配方甘氨酸 2.9g Tris 5.8g SDS 0.37g 蒸馏水 800ml 转膜前加入甲醇 200ml，并提前预冷。转膜条件(bio-rad 湿转 200mA 20mini PVDF)，滤纸上常常有maker,请问我们应该怎样改进实验方案？？？

作者: yapuyapu 时间: 2012-12-2 15:01

那就是转膜的时候电极搞反了。我湿转用的是350mA 60-90min。

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电极肯定是正确的，膜上都能看到一些marker。内参b-actin 43kD，10%分离胶0.75mm的一块胶，PVDF膜湿转条件200mA 20min。 PVDF膜甲醇中泡了20s。不知道为什么跑过了？

作者: 66+77 时间: 2012-12-2 15:01

请问斑竹，

我打算直接买天根的显色试剂盒，二抗孵育完，配好显色液后滴加在膜上，显色后直接在白板上于凝胶系统中拍照。
这种显色方式和ECL的荧光显色有什么不同，为何都见到的是采用后者？就因为反应敏感度不同吗？谢谢。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:02

我用预染marker做western转膜，PVDF 200mA 20min, 做的内参43kD，结果PVDF膜上基本上没有marker,看见都转过 ...

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在膜侧滤纸上有marker还是胶侧滤纸有？
可能电极放反了

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:02

请问斑竹，

我打算直接买天根的显色试剂盒，二抗孵育完，配好显色液后滴加在膜上，显色后直接在白板上于 ...

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两者敏感性差别较大

作者: langlang 时间: 2012-12-2 15:03

两者敏感性差别较大

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嗯...那两者的用途主要是针对做什么呢？

如果只是做一般纯化蛋白鉴定，用前者（试剂盒直接显色）？
做蛋白定量的话用后者（ECL法，压片后显色）？

还是根据做的量不同（很多样品），还是仅仅就是为了效果好一些？

谢谢!

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:04

嗯...那两者的用途主要是针对做什么呢？

如果只是做一般纯化蛋白鉴定，用前者（试剂盒直接显色）？
...

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可以用AP法直接显色

作者: H2O 时间: 2012-12-2 15:04

想请教大家一下，提取蛋白时，PMSF加多少，浓度是多少的？
我买的武汉博士德的蛋白提取试剂盒，要求把PMSF（1mmol/L）稀释成10umol/L。但我的PMSF是在碧云天买的，100mM,共10ml，是不是还得稀释成1mmol/L，之后再稀释成10umol/L，感觉有点不对劲，大家帮忙解决一下，谢谢？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:05

PMSF工作浓度1mM

作者: dog002 时间: 2012-12-2 15:05

我买的博士德的抗体，国外的二抗，显出来带这个样子，算是怎么样呢？新手上路，多多指教！谢

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作者: gmjghh 时间: 2012-12-2 15:06

用iNtRON BIOTECHNOLOGY的PRO-PREPTM Protein Extraction Solution裂解细胞得到的蛋白做western每次上样前用不用蜗旋混匀?老师让每次都蜗旋,但我怕会造成蛋白链断裂.

作者: gmjghh 时间: 2012-12-2 15:07

我听说配制SDS-PAGE胶的时候可以用保鲜膜包裹4度过夜第二天用最好.请问是分离胶还是浓缩胶聚合的时候这样,还是插入梳子聚合好了再4度过夜,第二天拔了梳子就可以用了?

作者: ritou1985 时间: 2012-12-2 15:10

楼主你好，我有几个问题想向你请教：
1.0.45um和0.22um的NC膜，他们对转膜的分子量有什么区别吗？
2.我的抗体分子量在40-60kd范围内，有半干转的话怎么确定电流和时间呢？我们都是用90mA左右的电流转40多分钟，但是有时Marker都转过去了，但有时又转不过去，这样的情况应该怎么办呢？
期待你的解答，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:23

1、两种孔径的膜对分子量的截留能力不一样
2、你的抗体分子量是40-60K？

作者: ritou1985 时间: 2012-12-2 15:24

因为是做抗体检测的，测试了不同的抗体，分子量都是在40-60kd附近的

作者: ritou1985 时间: 2012-12-2 15:24

还有就是，我今天跑了一块胶，转膜后胶考染，膜用丽春红染色了，但是发现胶只有上面一小部分还有一些带，膜上面染色却没发现带（膜是我在脱脂奶粉里面封闭了几分钟之后才拿出来染色的），这是什么回事呢？膜上没有带是因为把膜放在奶粉封闭了一下吗？我的转膜条件是：半干转，恒流88mA，时间50min。

作者: ritou1985 时间: 2012-12-2 15:25

还有就是，我今天跑了一块胶，转膜后胶考染，膜用丽春红染色了，但是发现胶只有上面一小部分还有一些带，膜上面染色却没发现带（膜是我在脱脂奶粉里面封闭了几分钟之后才拿出来染色的），这是什么回事呢？膜上没有带是因为把膜放在奶粉封闭了一下吗？我的转膜条件是：半干转，恒流88mA，时间50min。

作者: nn255 时间: 2012-12-2 15:25

你好老师：
我从genway公司看到一个ADH1抗体，说明只写适用于酵母菌，我想做白念珠菌的ADH1验证，想问：此抗体适用于白念珠菌吗，因为酵母包括很多种菌，每种菌的ADH1并不完全一样！谢谢

作者: vvmmoy 时间: 2012-12-2 15:26

第一次，试了很多次，包括重生PVDF膜，显影都没有任何条带。
第二次重做，只有actin，暗室只有actin看到亮，第一次显示但是还有其他杂带，之后无论压多长时间都看不到蛋白条带，只有actin。tbst重新洗过还是不行。

作者: JK.jon 时间: 2012-12-2 15:26

你好! 最近做的western比较多，也碰到了一些问题，想请问下。
1.砸过一次的膜，由于发光效果不好，怀疑可能有淬灭，这个时候能洗一下再直接加入这个一抗，重新封闭一次，再加二抗，再发光一次么？还是说需要去stipping一下，把上面的一抗二抗都洗掉之后再重新加同样的一抗？
2.第一次砸的一个小鼠来源的一抗，发光过后，可以一下直接在用其他种属的一抗继续封这个膜，第二天砸其他蛋白么，还是说也需要先stipping一下，再加别的一抗？
3.stripping对膜上的蛋白本身也会有损失么？一个膜一般可以stipping多少次？
4.膜想长期保存的话，应该怎么保存，可以吹干了之后放-20或者常温么？
问题有点多，麻烦你了，非常感谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:27

1、怀疑淬灭的话，用TBST洗洗后可以重新曝光
2、如果要重新加一抗、二抗，建议stripping后从封闭开始
3、杂交不同来源的一抗是可以的，选择标准是分子量要有一定差别，而不是一抗来源种属差别
4、stripping对膜上的蛋白有损失，一般3-4次，依据蛋白丰度，表达量小的在先，表达量大的在后
5、长期保存的话，封闭后，-20 度冻存

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:27

可以买抗体回来自己做验证，有一定风险

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:28

还有就是，我今天跑了一块胶，转膜后胶考染，膜用丽春红染色了，但是发现胶只有上面一小部分还有一些带，膜 ...

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正负极有没有弄错呢？
预染marker转到膜上了吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:28

因为是做抗体检测的，测试了不同的抗体，分子量都是在40-60kd附近的

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你的抗体分子量在40-60K附近我不太了解
在做WB过程中
如果用非还原loading处理，抗体分子量在150K左右
如果用还原loading处理，应该在55K，重链，25K轻链

40-60K。。。。不好意思，真没理解
请说的再详细些

作者: ritou1985 时间: 2012-12-2 15:29

因为我们是自己生产抗体的，将抗体提纯了之后用免疫印记和ELISA的方法检测抗体，我们最近检测了一批不同的抗体，分子量基本都是在40-60kd这个范围的，用ELISA测效价都挺高的，但是用免疫印记的方法就是没有条带，或者是有很多杂带。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:30

因为我们是自己生产抗体的，将抗体提纯了之后用免疫印记和ELISA的方法检测抗体，我们最近检测了一批不同的抗 ...

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检测免疫原还是天然蛋白？

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-12-2 15:30

楼主你好，我想问一下，核蛋白提取有什么叫好的办法吗？我提取了很多次，但是提取效果一直不好。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:31

用什么方法提取的核蛋白？自己配制的还是买的盒子？

作者: am10 时间: 2012-12-2 15:31

请问做his-tag的WB用什么试剂盒，就是不用转膜的那种，多谢！！！

作者: S6044 时间: 2012-12-2 15:32

请问做WB时用的内参除了常见的beta Actin、GAPDH和tubulin之外，还有其他好用的内参吗？是否有相关文献支持呢？感谢！

作者: mysmdbl 时间: 2012-12-2 15:33

版主你好，请问蛋白分子量24KD左右，湿转，400mA，3h 是否有问题？有没有更适合的转膜条件？
判断一个合适的转膜条件有什么依据吗？比如单位膜面积通过电流量之类的，看到你在前面有过提起。
谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:33

请问做his-tag的WB用什么试剂盒，就是不用转膜的那种，多谢！！！

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康为好像有什么金标试剂条之类的，你看看

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:33

请问做WB时用的内参除了常见的beta Actin、GAPDH和tubulin之外，还有其他好用的内参吗？是否有相关文献支持 ...

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有其它内参
如COX。。。TBP。。。等等

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:34

我初次接触蛋白，有两个问题，请指教：

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100多K的蛋白？
1、要看抗体浓度
2、做不同的一抗稀释度

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:34

版主你好，请问蛋白分子量24KD左右，湿转，400mA，3h 是否有问题？有没有更适合的转膜条件？
判断一个合适 ...

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300mA 30min！

作者: bohe221 时间: 2012-12-2 15:34

不知版主是如何判断的呢？
我的缓冲液是20%甲醇+80%缓冲液（tris体系），是否时间30min 有些短呢？
因为以往都是用400mA,3h 也能做出来现在就是感觉时间有些长，所以想向大大请教请教

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:35

不知版主是如何判断的呢？

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湿转
25mM glycine
192mM tris
0.01% sds
20% methanol
pre-chill to 4 degree
300mA 30min

作者: any333 时间: 2012-12-2 15:35

楼主好！我用RIPA裂解液处理研磨好的鼠的肋骨，结果跑SDS-PAGE胶后银染无条带；请问有没有其他更合适的裂解液？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:36

楼主好！我用RIPA裂解液处理研磨好的鼠的肋骨，结果跑SDS-PAGE胶后银染无条带；请问有没有其他更合适的裂解 ...

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我看过文献，记不太清楚了。提取骨的蛋白好像要先处理骨，脱钙。。。什么的吧

作者: 969 时间: 2012-12-2 15:36

我想问下，我做WB时，总没有斑点出现。我电泳的凝胶上有带，电转完后凝胶上没带。完了在做后面封闭、一抗、二抗显色的同时做了个Dot blot，它有斑点出现，但膜上什么都没有，包括我的标准。这应该是电转那有问题，但是不知道哪的问题。

作者: pencil菲 时间: 2012-12-2 15:37

PARP及裂解条带该如和选择WB条件呀，谢谢高手指教

作者: pencil菲 时间: 2012-12-2 15:37

PARP为何总是只有一个条带呀，细胞凋亡以确定

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-12-2 15:37

转膜之后用丽春红染色比较红的条带，GAPDH一抗，之后发光，反而没那么黑，是为什么啊？样品什么地方出问题了？样品跑第一次的时候都没发现这种情况，放-70冰箱几天之后，溶解再跑电泳就出现上述情况了。

作者: zhezhe 时间: 2012-12-2 15:38

DAB粉末怎么配置的啊？求助

作者: yes4 时间: 2012-12-2 15:38

我ECL显色肉眼可观察到条带。我用柯达的胶片压片2分钟，显影1分钟，却没有条带。而且整张片子都是黑的。胶片 ...

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片子已经过期或者曝光了。另外，肉眼可见，证明信号很强，压片几秒就可以。

作者: 社会主义好 时间: 2012-12-2 15:39

会不会是转膜液有问题？

作者: TAT 时间: 2012-12-2 15:40

请问如何做分泌到培养基中蛋白的western？可不可以先做免疫沉淀，然后做wb

作者: TAT 时间: 2012-12-2 15:41

请问如何做分泌到培养基中蛋白的western？可不可以先做免疫沉淀，然后做wb

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可以先做IP再做WB
先说说你的目的蛋白是什么

作者: TAT 时间: 2012-12-2 15:42

目的蛋白是Amyloid Precursor Protein（APP）蛋白的一个N端水解蛋白（N-APP），N-APP含有286个氨基酸，大小为35KD，因其位于胞外部分，所以水解后脱落在培养液中。

作者: TAT 时间: 2012-12-2 15:42

可以先做IP再做WB
先说说你的目的蛋白是什么

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[size=2]首先感谢您的回复！目的蛋白是Amyloid Precursor Protein（APP）蛋白的一个N端水解蛋白（N-APP），N-APP含有286个氨基酸，大小为35KD，因其位于胞外部分，所以水解后脱落在培养液中。这种能不能先做IP再做WB呢？我看有的资料是说先做TCA沉淀，然后做WB。这两种方法哪个更合适呢？期待您的回复！谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:43

首先感谢您的回复！目的蛋白是Amyloid Precursor Protein（APP）蛋白的一个N端水解蛋白（N-APP），N-APP含 ...

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具体怎么检测细胞培养基中的蛋白没有实际操作过
如果你想通过IP的话
对于IP我比较熟悉
只能从这个技术上和你详细说说

作者: one 时间: 2012-12-2 15:43

我的用TMB显色后，一坨一坨的，根本看不清条带，不知道什么原因。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-12-2 15:44

你好，版主。
问您一下。
我的MARKER是不带预染功能的。
请问用丽春红能染出来吗？
十分感谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:45

QUOTE:

原帖由 ladyhuahua 于 2012-12-2 15:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，版主。
问您一下。
我的MARKER是不带预染功能的。
请问用丽春红能染出来吗？
十分感谢！

可以染出来

作者: wmp1234 时间: 2012-12-2 15:45

你好！今天做了一个WB，有一个问题想请教一下。
平时我跑胶时70V浓缩胶，100V分离胶8%，一般2小时绝对能把溴酚蓝跑到底，可今天却跑了三个小时还没到底，而且溴酚蓝前面有一条亮线也在跑。仔细观察后，发现MARKER都快要跑出去了，溴酚蓝还在前面。用考马斯亮蓝染了一下胶后，发现溴酚蓝前面有一小段空白胶，并有点僵硬，其他地方都变成蓝色。这是怎么回事呢？请教各位了，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:45

你好！今天做了一个WB，有一个问题想请教一下。
平时我跑胶时70V浓缩胶，100V分离胶8%，一般2小时绝对能把 ...

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看你的描述
是胶有点问题吧

作者: XYZQ 时间: 2012-12-2 15:46

胶没问题我昨天又跑了一次换了running buffer 就好了真是很莫名啊

作者: qianqin1977 时间: 2012-12-2 15:48

没做过软骨的WB

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研磨后匀浆就行！

作者: ha111 时间: 2012-12-2 15:48

电泳是条带呈海鸥状，目的蛋白和marker 都是这样，什么原因呢？谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:49

电泳是条带呈海鸥状，目的蛋白和marker 都是这样，什么原因呢？谢谢

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电压太高。。。
胶没有聚合好

作者: mamamiya 时间: 2012-12-2 15:50

我在做WB 时，第一次压片整张片子没有带我怀疑是二抗没结合好于是又加二抗放在摇床上一个小时反复清洗很多次结果在第二次显影压片是整张片子都有亮黑乎乎一片都有什么原因呢我实在是想不明白哈两次结果也太极端了

作者: gogo 时间: 2012-12-2 15:51

western blot半干转印咋弄？？
beta-actin做不出来，目的基因同时做时候倒能做出来。。？？
谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:52

western blot半干转印咋弄？？beta-actin做不出来，目的基因同时做时候倒能做出来 ...

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beta-actin抗体问题考虑过吗？

作者: mamamiya 时间: 2012-12-2 15:52

新手准备做WB，我要做细胞的，一个14kd的蛋白，大家都说细胞的本身条件就细，分子量小的更不好出，请问大家我如果用六孔板处理完细胞，等长至基本融合提蛋白时，多少个孔的提出的蛋白作为一个上样孔的样比较合适？大家都是用BCA试剂盒测蛋白浓度吗？上的蛋白量多少合适呢，100微克或80微克吗？上样体积是不是也对条带有影响，通常多少体积范围比较合适呢？请大家帮忙解答一下，万分感谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:53

新手准备做WB，我要做细胞的，一个14kd的蛋白，大家都说细胞的本身条件就细，分子量小的更不好出，请问大家 ...

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蛋白上样量一般是20-40ug

作者: PCR 时间: 2012-12-2 15:54

我想问下我配的15%de 分离胶，胶凝结后不是很透明带有乳白色这是什么原因？这样的胶影响分离效果吗？

作者: nut6694 时间: 2012-12-2 15:54

蛋白上样量一般是20-40ug

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那请问体积大约多少呢？大家通常用几个孔的梳子呀，我们的是13的，最多只能上二十多微升，感觉条带比我在别处看的细呢？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:55

上样体积10-20ul

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:55

我想问下我配的15%de 分离胶，胶凝结后不是很透明带有乳白色这是什么原因？这样的胶影响分离效果吗？

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重新配胶吧

作者: 黄花菜 时间: 2012-12-2 15:56

那是胶片曝光了

作者: 49888 时间: 2012-12-2 15:56

我做的是CFTR
用的是santa cruz的抗体，160kDa
样本变性后，一抗浓度做到1:200，仍出不来；
上网查到说，CFTR不能变性，建议37度20min；后来采用此法后，有很模糊的阴影，效果还是不好
请问有什么方法吗？

作者: october7 时间: 2012-12-2 15:57

我也是做大鼠脑组织的，我上样量60微克，目的蛋白有条带，但是就是杂带太多。你一抗4度过夜试一试，我之前就是室温两个小时的一抗，但是也没做出结果，4度过夜就出来了。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 15:57

我做的是CFTR
用的是santa cruz的抗体，160kDa
样本变性后，一抗浓度做到1:200，仍出不来；

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没查到说不能变性啊

作者: lxh031 时间: 2012-12-2 15:58

我们实验室就用曝蛋白的仪器，两年前我们也用过胶片曝蛋白，现在离开了小黑屋。不过各有各的好处吧，使用片子曝蛋白可以保存，而用仪器保存的都是电子版的。如有兴趣还可以继续讨论。

作者: cj_mondy 时间: 2012-12-2 15:59

你好啊。。
我觉得BCA 定量都蛮准的，R的平方=0.997
但是跑出来竟然这个样子

ps：只有第一个孔上样的时候稍微有点点溢出来，这是beta-actin

为什么呢？

作者: cj_mondy 时间: 2012-12-2 16:00

还有哦。

这些为啥会连着呢？？
制胶的质量不好，还是信号太强了？

作者: H2O 时间: 2012-12-2 16:00

请问楼主，我目的蛋白35KD，请问使用PVDF膜哪种孔径较好，0.22um 还是0.45um？谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:01

请问楼主，我目的蛋白35KD，请问使用PVDF膜哪种孔径较好，0.22um 还是0.45um？谢谢

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0.45um孔径

作者: am10 时间: 2012-12-2 16:01

我是在平皿里进行封闭、一抗、二抗孵育的，然后在摇床里面摇的，封闭是用的5%的脱脂奶粉、一抗稀释500倍，二抗稀释4000倍，每次洗涤都是10min，洗三次，但是显影的时候背景太高了，还请楼主帮忙分析分析，谢谢……

作者: 131415 时间: 2012-12-2 16:02

请问抗体稀释液用买的好呢，还是用封闭液啊，或者说自己配的呢

作者: douding66 时间: 2012-12-2 16:02

有没有一种tris麦黄酮能分离1KD的化合物？和具体方法。还有tirs麦黄酮和tirs甘氨酸有什么区别？谢谢

作者: wmp1234 时间: 2012-12-2 16:03

楼主，我做的GAPDH内参，可是它的大小应该是36KDa左右，可是我PVDF膜出来的确--满膜的条带---如图--怎么回事？帮我分析分析怎么回事？thank you！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:04

先调整下二抗浓度试试

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:04

请问抗体稀释液用买的好呢，还是用封闭液啊，或者说自己配的呢

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我都是自己配的
3% BSA-TBST能适用于大部分蛋白

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:06

楼主，我做的GAPDH内参，可是它的大小应该是36KDa左右，可是我PVDF膜出来的确--满膜的条带---如图--怎么回事 ...

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一抗做一下稀释度

作者: standbyme 时间: 2012-12-2 16:07

稀释度为1:1000

作者: avi317 时间: 2012-12-2 16:07

我想问问，不封闭所转的膜，应该怎样做呢？其中的原理又是什么呢

作者: dongdongqiang 时间: 2012-12-2 16:09

谢哦嘿嘿，我们一般用的是5%的BSA

作者: fsdd817 时间: 2012-12-2 16:10

这是我做的片子，很多杂质，转膜70分钟，洗膜，加5%的脱脂奶粉-TBST配，封闭1.5个小时，再洗膜3遍*10min,一抗是SIGMA的以1：1000的5%的脱脂奶粉-TBST稀释，4度过夜，再洗膜5次*10min,二抗以1：4000用5%的脱脂奶粉-TBST用1.5个小时，洗5次，就压片，不知哪里出现了错误,请大侠多多指教

作者: eric930 时间: 2012-12-2 16:10

您好，菜鸟提问，为何我的pvdf膜有的部分有明显的条带，而有的地方没有呢？请高人指点。

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:10

这是我做的片子，很多杂质，转膜70分钟，洗膜，加5%的脱脂奶粉-TBST配，封闭1.5个小时，再洗膜3遍*10min,一 ...

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先把内参做好，稳定WB体系

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:11

您好，菜鸟提问，为何我的pvdf膜有的部分有明显的条带，而有的地方没有呢？请高人指点。

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什么意思？

作者: hold住 时间: 2012-12-2 16:13

最近我转膜总是出现异常，我们用的是新仪器，最先我冷室100V，转膜2小时，一直都能转上，而且显色也很好。但是现在转2小时后，看不见marker；逐渐的1个小时marker 很淡；不断地调整时间后20分钟也能转上marker ，但是显色时一般都没有条带。请各位指点下！

作者: gogo 时间: 2012-12-2 16:14

我在做转膜之后，胶上没有条带了，而膜上也没有，会出去这种情况吗?基因呢？跑哪去了呢？会跑没吗？

作者: jrwyyplt 时间: 2012-12-2 16:14

楼主，您好！我想请教一下200kD的蛋白在做western的时候，分离胶用多大浓度的合适，还有半干转膜，用什么条件合适？之前我做的时候，用的是8%的分离胶，转膜的时候电流是膜面积乘以2，2个小时，加上一抗二抗后没有曝出条带。希望楼主给予指点！多谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:14

可以用8%的分离胶
转膜用湿转：300mA 恒流 2h30min

作者: 分子式 时间: 2012-12-2 16:15

一是压片时间可能短，要曝光足够长时间；二是胶片有没有问题，换胶片试一试

作者: zhenxin 时间: 2012-12-2 16:15

上样buffer 可不可以煮久一点，蒸发掉部分水分以浓缩蛋白？因为我第一次做没有条带，可能是蛋白量低，但又不知道该如何浓缩蛋白

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:16

zhaohan2000 发表于 2011-6-22 12:30
上样buffer 可不可以煮久一点，蒸发掉部分水分以浓缩蛋白？因为我第一次做没有条带，可能是蛋白量低，但又不 ...

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5-10min就够了

作者: junhun 时间: 2012-12-2 16:16

1，1抗 2抗在SATAN CRUZ买的，已经有10个月了，按照说明书上说放4度，不能冰冻。现在还能用么？
2，我配制的RIPA裂解液怎么是白色的？配方是50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS
3，97KD的蛋白转膜用多少V多少时间？
4，奶粉用我们喝的脱脂奶粉行么？
非常感谢老师的回答！

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:17

1，1抗 2抗在SATAN CRUZ买的，已经有10个月了，按照说明书上说放4度，不能冰冻。现在还能用么？
2，我配制 ...

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1、抗体可以用，做预实验
2、裂解液出现白色？是不是某个试剂不对
3、用伊利的脱脂奶粉就行

作者: 66小飞侠 时间: 2012-12-2 16:17

配方是50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS
配置的方法是加完Tris-HCl ，NaCl然后加水调PH，定容后依次加入EDTA,Triton x-100,SDS。放在4度没有沉淀，过了几天再加脱氧胆酸钠的（试剂未到才拖了好几天），加完后55度水浴助溶后放4度保存，结果析出白色沉淀了。这是怎么回事？

作者: mysmdbl 时间: 2012-12-2 16:20

楼主您好，请问我的目的蛋白条带很弱，曝光3min整张膜都是一片亮，约10min后条带才隐隐出现，请问我是否该增大一抗的浓度？曝光时间是否设置不对？另外，多数内参条带很亮，只有个泳道的内参不亮，相应的目的蛋白条带却有，这是什么原因？重复了几次都是这种情况。按说内参不亮，就是蛋白没提好吧，目的蛋白也不应该亮的吧？请楼主指教~

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:21

配方是50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% ...

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单组份试剂都是哪的？

作者: wood533 时间: 2012-12-2 16:30

楼主您好，请问我的目的蛋白条带很弱，曝光3min整张膜都是一片亮，约10min后条带才隐隐出现，请问我是否该增 ...

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调整一抗、二抗浓度
增加洗膜强度

作者: dongdongqiang 时间: 2012-12-4 09:08

我要用WB做痰液中粘蛋白测定，请问有没有比较好的痰液处理办法？样本中蛋白浓度的测定用BCA法可以吗？谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:09

QUOTE:

原帖由 dongdongqiang 于 2012-12-4 09:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我要用WB做痰液中粘蛋白测定，请问有没有比较好的痰液处理办法？样本中蛋白浓度的测定用BCA法可以吗？谢谢！

没做过
按照你说的方法试试吧
这个蛋白在痰液中丰度如何？

作者: u234 时间: 2012-12-4 09:09

为什么分子量在十七以下的蛋白跑不出条带？

作者: tuuu2 时间: 2012-12-4 09:10

我想知道，哪个公司的MARKER最好用，我们用的经常跑的位置不对，是什么问题，很郁闷的，请指导。

作者: owanaka 时间: 2012-12-4 09:10

我用的是湿转，转膜的顺序为黑色版（负极）—海绵—滤纸1—凝胶—膜—滤纸2—海绵—白色板（阳极），第一次膜用的事尼龙膜，发现预染marker转移到膜上了，但是最后杂交背景较深。第二次改用PVDF膜，但是发现，同样的顺序，预染marker 转移到滤纸1上了，膜在用前已经经过甲醇和转移buffer浸泡，不知为什么会出现这种情况。请赐教。

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:13

可能电极反了

作者: 张先生 时间: 2012-12-4 09:14

请问用酵母表达异种目的蛋白，用western比较表达量时用酵母的什么蛋白做内参，谢谢

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:14

QUOTE:

原帖由 张先生 于 2012-12-4 09:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问用酵母表达异种目的蛋白，用western比较表达量时用酵母的什么蛋白做内参，谢谢

酵母表达蛋白内参我不清楚，没做过
如果用酵母表达的话，需要做半定量吗？做定性不就行了？

作者: caihong 时间: 2012-12-4 09:14

推荐个便宜的小型湿转仪

作者: lixi559 时间: 2012-12-4 09:15

请问一下怎么设计检测买来的单抗对目标蛋白的IP效率的实验！目标包含在蛋白是在细胞总蛋白中。谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:15

QUOTE:

原帖由 lixi559 于 2012-12-4 09:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问一下怎么设计检测买来的单抗对目标蛋白的IP效率的实验！目标包含在蛋白是在细胞总蛋白中。谢谢！

这个效率。。。
没做过实验

作者: 张先生 时间: 2012-12-4 09:16

我需要做定量比较，之前我试过ACTIN蛋白，但是ACTIN在沉淀中较多，无法用来做上清的比较

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:17

不好意思，这个真没做过
文献中用什么做内参呢？

作者: is2011 时间: 2012-12-4 09:17

你好，昨天做湿转，条件：恒定电流0.32A，3h。分子量大概在120KD左右，转之前胶上有Marker。转出来膜上没有Marker印记。请问诱导这种情况发生的因素有哪些？谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2012-12-4 09:17

我现在做自噬的检测，用CST公司的抗LC3B抗体，文献提示应该有两条带（14KD和16KD，分别为LC3-1和LC3-2），可我每次只能做出一条带，12%，15%的胶都做过，PVDF膜，转膜30分钟。请指点，谢谢！

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:19

你好，昨天做湿转，条件：恒定电流0.32A，3h。分子量大概在120KD左右，转之前胶上有Marker。转出来膜上没有 ...

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1、膜没有活化
2、电极反了

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:19

我现在做自噬的检测，用CST公司的抗LC3B抗体，文献提示应该有两条带（14KD和16KD，分别为LC3-1和LC3-2），可 ...

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1、没有这个蛋白亚型的表达
2、抗体不能识别出另一个亚型

作者: INK 时间: 2012-12-4 09:19

你15%的胶配方是什么，可以共享一下吗

作者: kuohao17 时间: 2012-12-4 09:20

我想做皮样的WB，想请教一下用什么方法提蛋白比较好？还没做过WB，还请多多指教！

作者: 987789 时间: 2012-12-4 09:21

我想做皮样的WB，想请教一下用什么方法提蛋白比较好？还没做过WB，还请多多指教！

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我做过皮组织样品，不太好弄。先用剪刀尽量剪碎，然后用匀浆器匀浆

作者: xingyi08 时间: 2012-12-4 09:21

用什么Buffer提比较好呢？

作者: 8princess8 时间: 2012-12-4 09:22

western 跑出条带为纺锤状，求原因。上样量3~5微升，也有10微升的也是跑出纺锤状。胶是10%分离胶，转膜30伏恒压 16h

作者: 04906 时间: 2012-12-4 09:22

western 跑出条带为纺锤状，求原因。上样量3~5微升，也有10微升的也是跑出纺锤状。胶是10%分离胶，转膜30 ...

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电泳是什么条件？

作者: 8princess8 时间: 2012-12-4 09:23

fangweibin 发表于 2011-8-13 09:24
电泳是什么条件？

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电泳150v 衡流40mA两块胶。

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:23

QUOTE:

原帖由 8princess8 于 2012-12-4 09:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
fangweibin 发表于 2011-8-13 09:24
电泳是什么条件？

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电泳150v 衡流40mA两块胶。

跑浓缩胶的时候也是150V吗？

作者: lxh031 时间: 2012-12-4 09:24

请问你说的把“内参做好后，稳定WB体系”具体是指什么？检测不同的抗体用到的抗体稀释度肯定不一样啊，还是得摸索条件呢。我把内参做出来了，结果也很漂亮，可是做要检测的分子都快做了3个月了结果还是不好，背景很深目的条带不明显（已经按抗体说明书调节了抗体稀释度还是如此），都快做疯了！恳求解答，谢谢！

作者: 白白的 时间: 2012-12-4 09:25

版主好，我最近测caspase-3，35KD，两个片段是 17KD和12KD，内参是GAPDH。连着做了几次WB，每次都是白板。
现在已经确定了二抗、ECL都是没问题的。片子是Thermo scientific的，老板说没有提前曝光也没有过期，而且显完看起来也是蓝色的。
胶是4%-12%的预制胶，恒压140V，等溴酚蓝跑到胶最前端停电泳。
湿转是0.2的NC膜，100V，1h，可以看到marker转到膜上。
封闭液，一抗，二抗孵育都是5% milk，2.5g 脱脂奶粉+50mL 0.1%PBST
封闭1h，一抗是4度过夜，0.1% PBST 洗5min，4次。二抗是室温1h，同样条件洗。
然后ECL是1ml双蒸水，0.5ml peroxide，0.5ml luminol混合。加到膜上两分钟包透明膜。我们系没有暗房，我有时是加好ECL然后步行大约10分钟到医学院的暗房，然后放X-ray film，有时是把ECL带过去加，然后等两分钟放X-ray film。都是压三分钟，自动显影。
已经连着4次都是白板，感觉很奇怪，今天测了各种buffer的pH，也都在范围里。
MOPS-SDS running buffer pH 7.5
Tris-Gly buffer pH 8
0.1% PBST pH 7.6

以前在国内做WB都没有出过白板，国外的实验室居然会出这种结果。而且是我和老板做的平行实验都没有结果。他现在也郁闷了，找不出原因来。请版主帮忙看看吧，多谢了。

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:25

请问你说的把“内参做好后，稳定WB体系”具体是指什么？检测不同的抗体用到的抗体稀释度肯定不一样啊，还是 ...

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内参做的很漂亮，至少说明WB体系是稳定的。
那么你做的目的蛋白是什么呢？

作者: wood533 时间: 2012-12-4 09:25

版主好，我最近测caspase-3，35KD，两个片段是 17KD和12KD，内参是GAPDH。连着做了几次WB，每次都是白板。
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ECL是自己配的？
在ECL中直接加入二抗有荧光吗？

作者: lxh031 时间: 2012-12-4 09:26

内参做的很漂亮，至少说明WB体系是稳定的。
那么你做的目的蛋白是什么呢？

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首先谢谢您的回答。
我要检测一种白细胞介素IL-28的量的表达变化（表达量应该不是很高），做的是肺组织的。其实根据已经做出的结果来看，能极稍微看到不同组别间的变化（因为已经定量），就是一直不管怎么调节就是背景一直有些高，从而导致条带不是十分明显。一抗浓度（推荐范围1:100-1:1000）已经调节到1:2000 、4度过夜，结果背景跟前面的用过浓度（1:400、1:500、1:800、1:1000）高时没什么太大区别，二抗浓度（推荐范围1:3000-1:10000）尝试过1:4000、1:5000，已经调节到1:8000和1:10000 RT 1h还是这样子。另外封闭从最开始的RT 1 h 、RT 4 h、4度过夜也都试过（5%TBST—脱脂牛奶封闭完后再直接加用封闭液稀释的一抗），但都是不好。暗室里曝光时明显能看到整张膜亮的，也能看到目的条带是亮的，曝光后底片上不能把目的条带跟背景明显区分开。以为是洗涤的不充分，所以有时狠下心来都洗涤了8 h甚至更长时间还是不能很好的去除背景。所以现在都不知道该如何调节，能把背景去掉就好了，急求解决办法！谢谢。
补充：
对于是不是抗体的问题，我也想过，因为一抗买的是SANTA CRUZ的抗体，二抗买的是博士德的，稀释时用的封闭液稀释，应该问题不是很大吧！另外ECL用的是碧云天的超敏发光剂。对于转膜，转膜时用了预染Maker，转的不成问题，而且把转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染液染色证实蛋白应该成功转过去了。

作者: qhyu 时间: 2012-12-4 10:17

求教版主达人，我现在在做一个15KD的人组织蛋白，开始还能出结果，后来越做越差，找不到原因。
转膜条件是：bio-rad半干转仪，上下10层滤纸，12V，20+mA，30min，封闭40min,一抗4°C过夜，二抗37°C1小时，结果总是白板。巨郁闷...
请问我的转膜条件合适么？我染过转膜后的胶，可见少量残留，但是预染Maker转的很好，用的NC膜。胶上应该没有一点残留才好么？或者换PVDF膜能好点？实在不知道问题出在哪了...
哦对，做过bataactin内参，没什么问题，条带清除。

作者: summerxx 时间: 2012-12-4 10:17

我现在做蛋白纯化，跑PAGE电泳时，8%，10%以及12%的分离胶都只能得到一条带，而正常情况下应该都有两条，请 ...

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可以适当延长电泳时间 ;或者是一个
蛋白分解掉了

作者: summerxx 时间: 2012-12-4 10:18

您好，菜鸟提问，为何我的pvdf膜有的部分有明显的条带，而有的地方没有呢？请高人指点。

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说明有蛋白，但是贴膜没搞好，有得地方贴膜好就转上，不好的就没转上或者显示不清晰

作者: wood533 时间: 2012-12-4 10:18

Il做WB
好像不行哦

作者: ROSE李 时间: 2012-12-4 10:19

我要检测一种白细胞介素IL-28的量的表达变化（表达量应该不是很高），做的是肺组织的。其实根据已经做出的结果来看，能极稍微看到不同组别间的变化（因为已经定量），就是一直不管怎么调节就是背景一直有些高，从而导致条带不是十分明显。一抗浓度（推荐范围1:100-1:1000）已经调节到1:2000 、4度过夜，结果背景跟前面的用过浓度（1:400、1:500、1:800、1:1000）高时没什么太大区别，而且好像一抗逐渐降低后目的条带却逐渐减弱至快看不见了。二抗浓度（推荐范围1:3000-1:10000）尝试过1:4000、1:5000、1:8000，已经调节到1:10000和1:20000 RT 1h还是这样子。另外封闭从最开始的RT 1 h 、RT 4 h、4度过夜也都试过（5%TBST—脱脂牛奶封闭完后再直接加用封闭液稀释的一抗），但都是不好。暗室里曝光时明显能看到整张膜亮的，也能看到目的条带是亮的，曝光后底片上不能把目的条带跟背景明显区分开。以为是洗涤的不充分，所以有时狠下心来都洗涤了8 h甚至更长时间还是不能很好的去除背景。所以现在都不知道该如何调节，能把背景去掉就好了，急求解决办法！谢谢。
补充：
对于是不是抗体的问题，我也想过，因为一抗买的是SANTA CRUZ的抗体，二抗买的是博士德的，稀释时用的封闭液稀释，应该问题不是很大吧！另外ECL用的是碧云天的超敏发光剂。对于转膜（用的是0.22PVDF)，转膜时用了预染Maker，转的不成问题，而且把转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染液染色证实蛋白应该成功转过去了。
急求版主及各位高手解答，谢谢！（万分火急了）

作者: kswl870 时间: 2012-12-6 10:46

你好，在做组织中蛋白的wb的时候，提取蛋白出现了问题。网上提供了很多种方法，希望做过的组织中蛋白提取的给点建议。谢谢

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