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标题: 【讨论分享帖】分享你做蛋白质组学实验的protocol [打印本页]

作者: 米囡 时间: 2012-12-3 14:27 标题: 【讨论分享帖】分享你做蛋白质组学实验的protocol

每个人在做自己蛋白质组学实验时都有一套对自己可行的实验方法，请大家把自己的实验验方法贴出来。希望这个是自己正在用的，并且能够得到不错结果的方法，而不是从网页上简单copy下来的。每个完整的protocol可以得到99个金钱的奖励。活动结束以后，将把所有的protocol集结成册，免费提供给大家。内容包括：蛋白质的提取双向电泳染色方法蛋白酶解质普鉴定更欢迎非2D的protocol。大家发贴时请注明您的实验材料和protocol的内容。比如说：植物蛋白质的提取方法 ...

作者: 米囡 时间: 2012-12-3 14:28

抛砖引玉，这是我以前发的老贴：植物蛋白质提取的三种protocols 1. TCA/丙酮法：（1）取4g果肉，用液氮在研钵中将其研磨成粉。（2）加入12.5%冰冷的TCA/丙酮（含0.07%β-巯基乙醇），匀浆液在-20 ºC下放置3h，纱布过滤。（3）滤液在20000g离心30min，收集沉淀。（4）用冷丙酮洗3次，沉淀在4ºC下干燥，备用。 2. 匀浆法：（1）称取4g果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。（2）加入4ml的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，继续研磨。（3）匀浆液20000g离心30min。（4）将上清转移到新的离心管中，加入终浓度为10%TCA溶液，4ºC下放置2 h。（5）20000g离心40min，收集沉淀。（6）用冷丙酮洗3次，沉淀在4ºC下干燥，备用。 3. 酚提取法：（1）称取4g果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。（2）加入4ml的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，继续研磨。（3）匀浆液20000g离心30min。（4）在上清液中加入等体积的pH7.8 Tris-饱和酚，充分摇荡，混匀，10000g，4ºC下离心30min，上层为水相，中间白色物质为杂质，下层为酚相。（注：当提高匀浆缓冲液中sucrose的浓度到1M时，酚相会出现在上层。）（5）回收酚相，加入5倍体积含0.1M 乙酸铵的预冷甲醇，充分混匀，-20ºC下过夜，沉淀蛋白。（6）沉淀用含0.1M 乙酸铵的预冷甲醇洗2次。预冷丙酮洗2次。（7）沉淀在4ºC下干燥，备用。参考文献： Saravanan R S, Rose J K C. 2004. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics, 4: 2522-2532. Shen S H, Jing Y X, Kuang T Y. 2003a. Proteomics approach to identify wound-response related proteins from rice leaf sheath. Proteomics, 3: 527-535. Shen S H, Sharma A, Komatsu S. 2003b. Characterization of proteins responsive to Gibberellin in the leaf-sheath of rice Oryza sativa L seedling using proteome analysis. Biol Pharm Bull, 26: 129-136. Chan, Z.L., Qin, G.Z., Xu, X.B., Li, B.Q., and Tian, S.P. 2007. Proteome approach to characterize proteins induced by antagonist yeast and salicylic acid in peach fruit. J. Proteome Res. 6: 1677-1688

作者: xingyi08 时间: 2012-12-3 14:28

比较完整

双向电泳实验过程及相关溶液配置双向电泳实验过程及相关溶液配置 A．实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、实验步骤： 1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。 2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：编号蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值 1 0 80 4 0 2 5 75 4 0.024 3 10 70 4 0.061 4 15 65 4 0.091 5 20 60 4 0.116 Bt4 2 78 4 0.079 Bt4 4 76 4 转Bt4 2 78 4 0.075 转Bt4 4 76 4 标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得 OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。 3. 双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水） 3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。 3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。 3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20oC） S1 (30v, 12hr, 360vhs, step) S2 (500v, 1hr, 500vhs, step) S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad) S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共计44110vhs, 19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦 3.4 平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。 4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE 4.1 配胶(两根胶条所用剂量) 分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED 30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml 分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul 双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8% 10ml） 30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml 浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul 双蒸水 5.9ml 4.2 灌胶将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。 4.3 转移剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。 4.4 跑胶浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时 5. 银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水） 5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml 5.2 敏化 30min 无水乙醇 150ml Na2S2O3•5H2O 1.5688g 无水乙酸钠 34g 先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml 5.3 洗涤 5min × 3次 5.4 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml 5.5 洗涤 1min × 2次 5.6 显影无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml 甲醛(37%)0.1ml, 临时加 5.7 终止 10min EDTA—Na2•2H2O 7.3g 用超纯水定容至500ml 5.8 洗涤 5min × 3次注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。 B．实验相关试剂配制 1． Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2．裂解液尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate） 3. 水化液储液尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% Tris—base 40 mM 4. 分离胶buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g Tris—HCl 1.5M 45.4275g 5. 浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml SDS 0.4% 0.4g Tris—HCl 0.5M 6.07g 6.

作者: xingyi08 时间: 2012-12-3 14:29

凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml Acr 29.2% 73g Bis 0.8% 2g 7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g 超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml 8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液 6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9．平衡液储液脲（即尿素） 36g 甘油 30% 30ml SDS 1% 1g 0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml 10. 平衡液A（一根胶条） DTT 20mg 平衡液储液 10ml 11．平衡液B（一根胶条）碘乙酰氨 300mg 平衡液储液 10ml 0.05%溴酚兰 15ul (平衡液A、B均需临时配制) 12．0.5%琼脂糖10ml 琼脂糖 0.05g 电极缓冲液 10ml 溴酚兰 25ul 补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。 C．药品 CHAPS 兼性离子去垢剂去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用， SDS 离子型去垢剂提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出尿素离液剂可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质硫脲离液剂变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性 DTT 还原剂断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀 BSA Bradford中制作标准曲线用无水乙醇和磷酸一起，提供Bradford中的环境磷酸提供Bradford中的酸性环境 Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化 IPG buffer 覆盖液即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。丙烯酰胺（Acr）以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，甲叉二丙烯酰胺（Bis）在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构琼脂糖溴酚兰指示剂作用碘乙酰氨（IAA）平衡液B中使用，中和A液中的DTT 正丁醇比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶甘油无机盐的良好溶剂，热稳定性好 Marker 考马斯亮兰G250（Bradford法用）考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量甘氨酸与Tris构成缓冲系统 AgNO3 EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程

作者: xingyi08 时间: 2012-12-3 14:32

贴东西，顺便让czlong2008修改

2.2 Preparation of total protein extract For protein extraction about 1 g(1 part) of this fine powder was mixed with 5 ml(5 parts) of precipitation solution containing 10% w/v TCA and 0.07% w/v β-mercaptoethanol in cold acetone which was stored at –20°C overnight according to Isaacson et al(2006). Aliquots of suspension were incubated at –20°C for 60 min. After 5, 15, and 30 min the suspension was mixed, and most proteins will precipitate with in 30 min. Precipitated material was collected by centrifugation(18 000 g, 4°C, 15 min), proteins should precipitate as white flakes. After washing twice with acetone containing 0.07% w/v β-mercaptoethanol the precipitates were dried in a cold vacuum centrifuge. The pellets were resuspended using 25 μL lysis buffer(5 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% SB3-10, 40 mM Tris, 65 mM DTT and 0.35% carrier amholytes) per milligramme(Wang et al. 2007), extensively vortexed at room temperature, and then centrifuged at 21 000 g for 10 min at 28°C. Protein concentration was determined by the Bradford assay(Ramagli 1999).

作者: moonlight45 时间: 2012-12-3 14:32

本人一直在使用的蛋白提取方法（适合于植物组织的材料提取），感觉效果很好！呵呵！与大家共享！ 1，取约3g 新鲜植物材料，液氮磨碎，加入30ml左右TCA-丙酮提取液，混合后，放在－20℃一小时。 2，4℃条件下40000g离心力，离心15分钟，取沉淀。 3，从新将沉淀溶解在等体积丙酮-巯基乙醇溶液中，低温-20度放置1小时。 4，从新4℃条件下40000g离心力，离心15分钟，取沉淀。 5，重复步骤（3）-（4）一遍 6，将沉淀真空干燥使得沉淀成粉末状。 7，取干燥后的样品粉末按1mg/30ul溶解液的比例加入蛋白溶解液混合均匀，36度温浴1小时。 8，25度条件下（室温）12000g离心15分钟，吸取上清转移到新离心管中再次离心15分钟取上清。 9，按Bradford法测定蛋白浓度

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-3 14:33

前面的朋友提到了bradford法，那我就把我的方法共享一下：简化版bradford蛋白质定量 1，染色液配制：将 G250：0.01%（w/v）、乙醇：4.75%和磷酸：8.5%，用纯净水溶解混合后用滤纸过滤即可，此溶液可以长期保存在室温下。 2，标准蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋（采用0.1mol/L的NaCl溶解牛血清蛋白），-20度下分装在1ml离心管中（最好一次配10ml，然后分装保存，每一次取出一管）。操作流程 1，取7支10ml试管按表1加入相应的溶液。编号 1 2 3 4 5 6 7（样品）牛血清体积（ul） 0 10 20 40 80 100 10 G250 试剂（ml） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 蛋白浓度:ug/ml 0 100 200 400 800 1000 吸光值 2、将以上溶液混合后在595nm下的吸光值，根据吸收值和浓度的关系计算标准曲线。 3、测定待测样品的吸光值，并根据标准曲线计算样品浓度

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-3 14:33

2D Gel Electrophoresis Protocol

Lysis Buffer 7M Urea 2M Thiourea 4% CHAPS Add fresh: 20mM Spermine 20mM DTT 1mM PMSF Rehydration Buffer 8M Urea 2% CHAPS Add fresh: 20mM DTT 0.5% IPG Buffer trace amount of bromophenol blue Equilibration Buffer 6M Urea 30% Glycerol 2% SDS 50mM Tris-HCl pH 8.8 EQ Buffer 1 – add fresh 1% DTT EQ Buffer 2 – add fresh 2.5% Iodoacetamide Sample Preparation 1) Remove media from flasks. 2) Add 4mL of trypsin to each flask and place back in incubator for 2-3 minutes. 3) Remove flasks from incubator and add 4mL of media to each flask to inactivate trypsin. 4) Collect cells into 15mL conical tubes and spin @ 3K RPM for 5-10 minutes at RT. 5) Remove supernatant from conical tubes and add 5mL of 1X PBS to each tube. 6) Resuspend cells in 1X PBS in order to remove excess trypsin and media. 7) Spin @ 3K RPM for 5-10 minutes at RT. 8) Remove supernatant from conical tubes and add 1mL of fresh lysis buffer to each tube. 9) Resuspend cells in fresh lysis buffer then place tubes in refrigerator at 4°C for 2-4 hours. 10) Transfer cell lysates into 1.5mL microcentrifuge tubes (Beckman tubes) and spin at 40K RPM for 1 hour at 4°C. 11) Carefully remove supernatant and transfer to clean microcentrifuge tube. 12) Determine protein concentration and store remaining lysate in -80°C freezer. Isoelectric Focusing/The First Dimension 1) Prepare 2.5mL of fresh rehydration buffer for each type of DryStrip. 2) Place samples on ice to thaw and collect 1.5mL microcentrifuge tubes for sample dilution. 3) Remove the necessary number of DryStrips from -20°C freezer. 4) Determine the amount of rehydration buffer necessary for strip length. 5) Add 200-300ug of cell lysate to clean microcentrifuge tubes and add the difference between the total volume and the volume of sample using fresh rehydration buffer. 6) Remove plastic cover from strip holder and set aside. 7) Add rehydration buffer containing sample to the strip holder at the anode (pointed end of the holder). 8) Remove protective cover from DryStrip before placing gel side down into strip holder starting at the anode (pointed end) and laying strip down to the cathode (blunt end). 9) Move strip back and forth in order to spread out rehydration buffer. 10) Make sure that all bubbles are removed from underneath the DryStrip before adding DryStrip Cover Fluid (Mineral Oil). 11) Add cover fluid from one end until it reaches the middle of the strip holder then add from the opposite side so that fluid meets in the middle. 12) Complete the same process for all strips then place the strip holders on IPGphor system. 13) Set up protocol for the length strip that is being used. 14) For 13cm strip: Rehydration at 20°C for 12 hours 50uA per strip 500V for 1 hour 1000V for 1 hour 8000V for 3-5 hours 15) Move onto equilibration step or rinse strip with MilliQ water and place into screw cap tubes for storing in -70°C freezer. Equilibration 1) Prepare 15 mL of fresh equilibration buffers 1 & 2 for each strip. 2) Wash strips with MilliQ water before placing into equilibration buffer 1. If you are removing strip from -70°C, let tube sit on lab bench to thaw strip. When strip is thawed (strip will be clear) place into equilibration buffer 1. 3) Incubate in equilibration buffer 1 for 15 minutes. 4) Remove strip and rinse with MilliQ water before placing into equilibration buffer 2. 5) Incubate in equilibration buffer 2 for 15 minutes. 6) Remove strip and rinse with MilliQ water and place strip on its side on filter paper to allow excess water to drain from strip. Running the Second Dimension 1) Prepare gel by removing water saturated butanol from top of gel and washing with 1X running

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-3 14:34

buffer. 2) Cover top of gel with 1X running buffer and lay strip across the top of the gel making sure that the gel is lying flush with the gel and remove any bubbles between the strip and the top of the gel. 3) Remove the running buffer and add warm 1% agarose made with 1X running buffer. 4) Allow the agarose to cool and solidify, which should only take a few minutes, before moving to the electrophoresis apparatus. 5) Add 1X running buffer to the upper and lower buffer chambers and place gel inside apparatus. 6) Run gel for 15 minutes at 10mA per gel then run gel at 25mA per gel for 4-6 hours (until BPB band reaches bottom of gel). 7) Remove gel from plates and stain. 1-D Polyacrylamide Gel Electrophoresis Gel type Sample volume(μl/well) Total well volume(μl/well) Mini Gels 0.75 mm, 10 well 2 to 5 25 Large Gels 0.75 mm, 10 wells 10-140 150 Sample buffer 0.062 M tris-HCl, pH6.8 2% SDS 0.01% Bromophenol Blue 10% Glycerol 5% 2-mercaptoethanol Upper buffer 10% SDS 10 mL 250mM EDTA 4 mL Reservoir buffer 100 mL Nanopure water add enough to 1 L mark Lower buffer Reservoir buffer 100 ml Nanopure water add enough to 1 L mark Store buffers in refrigerator. Sample Preparation 1. Prepare the sample with the sample buffer to a concentration of 1 μg/μl. 2. Heat at 100 °C for 2-3 min in a boiling water bath. Sample loading 1. Remove the comb from the cassette by sliding it slowly with a steady motion straight up. Do not distort or tear any wells. 2. Flush the wells with water to remove residual acrylamide 3. For glass cassettes leave the tape on the side of the gels. 4. Use permanent marker to draw the bottoms of the wells. That will make it easier to load. 5. Insert these plates on the electrophoresis unit. 6. Pour the upper and the lower buffers 7. Load the appropriate amounts of samples. Load sample buffer in any wells that do not contain samples. Gel Visualization Copper Staining 1. Prepare the Copper stain by dissolving 4 g of CuCl2 in 100 mL of water. 2. Wash the gels with nanopure water. 3. Pour the Cu stain on the gel. Make sure that the gel is completely submerged. 4. Rock for 5 minutes. 5. Pour the stain into the waste and wash the gel with water to remove excess copper. 6. Store the gel in water in the refrigerator. Zn Staining 1. Dilute Imidazole (Solution A) 1:10 with water, mix thoroughly. Dilute Zinc Sulfate (Solution B) 1:10 with deionized water, mix thoroughly. Gels will require 100-150 mL so that they are compeletely immersed. 2. Place the gel in a staining container and add Imidazole, solution A. Rock at room temperature for 10 min. 3. Decant Solution A, and add the dilute Zinc sulfate, solution B. Make sure the gel is completely covered to ensure even staining. Rock at room temperature for 30 sec approx while the gel develops. 4. Decant solution B, and add 100 mL of water. Rinse for 3-5 min rocking at room temperature 5. Decant water and replace with fresh water. The gel can be stored like this for days. Silver Staining for Mass Spectrometric Analysis Step Solution per gel Time(min) Fix 25 ml acetic acid, 100ml methanol, 125 ml water 15 Fix 25 ml acetic acid, 100 ml methanol, 125 ml water 15 Sensitization 75 ml methanol, 10 ml sodium thiosulfate(5%), 17 g sodium acetate, 165 water 30 Wash 250 ml water 5 Wash 250 ml water 5 Wash 250 ml water 5 Silver 25 ml silver nitrate(2.5%), 225 water 20 Wash 250 ml water 1 Wash 250 ml water 1 Develop 6.25 g sodium carbonate, 100 ul formaldehyde 250 ml water Stop 3.65 g EDTA 250 water 10 Wash 250 ml Water 5 Wash 250 ml Water 5 Wash 250 ml Water 5 Destaining Silver from the gels WORKING SOLUTION 30 mM Potassium Ferricyanide 99 mg of Potassium Ferricyanide in 10 ml water 100 mM Sodium Thiosulfate 248 mg Sodium Thiosulfate in 10 ml water Mix them together. Make fresh for use. Add 30-50uL working solution to cover the gel bands and vortex

作者: huifeng0516 时间: 2012-12-3 14:35

occasionally. Repeat till there is no more brown color left. Rinse with water , twice. Cover the gel with 200mM ammonium bicarbonate for 20 min. Discard the liquid to waste. Wash with ACN till the gel pieces are opaque. Dry the pieces under vacuum for 30 min Alternative Version: Silver Staining for Mass Spectrometric Analysis (Use 5 gel volumes of each reagent for staining) Step Solution per gel Time(min) Fix 5% acetic acid; 45% methanol; 50% water 90 Wash water 10 Wash water 10 Sensitization 0.02% sodium thiosulfate 3 Wash water 0.5 Wash water 0.5 Silver 0.1% silver nitrate 30 Wash water 0.5 Develop 0.02% formaldehyde/2.5% sodium carbonate 2 (bands suitable for MS analysis will appear within 30-60 seconds) Stop 1% acetic acid 10 Wash water 20 Wash water 20 Alternate Version: Destaining Silver from the gels WORKING SOLUTION 30 mM Potassium Ferricyanide 99 mg of Potassium Ferricyanide in 10 ml water 100 mM Sodium Thiosulfate 248 mg Sodium Thiosulfate in 10 ml water Mix at 1:1 ratio. Make fresh for use. Cover the band in working solution and vortex until brown color removed (5 minutes) Remove the solution and wash three times with 200 μL water. In-gel Digestion 100 mM Ammonium Bicarbonate 0.79 g Ammonium Bicarbonate Make up to 100 mL with water 10 mM DTT 15.4 mg Dithiothreitol Make up to 10 mL with 100 mM ammonium bicarbonate 55 mM Iodoacetamide 102 mg Iodoacetamide Make up to 10 ml with 100 mM ammonium bicarbonate 0.1 μg/μl Trypsin 200 μl of 25 mM Ammonium Bicarbonate 20 μg trypsin Excise gel bands prior to in-gel digestion

作者: lxh031 时间: 2012-12-3 14:35

植物组织的材料提取(运用教科书方法)

1，取约0.5g新鲜植物材料，液氮磨碎，加入30ml左右TCA-丙酮提取液，混合后，放在－20℃一小时。 2，4℃条件下4000prm离心力，离心15分钟，取沉淀。 3，从新将沉淀溶解在等体积丙酮-巯基乙醇溶液中，低温-20度放置1小时。 4，从新4℃条件下4000prm离心力，离心15分钟，取沉淀。 5，重复步骤（3）-（4）一遍 6，将沉淀真空干燥使得沉淀成粉末状。

作者: xue258 时间: 2012-12-3 14:36

我的方法，有点过于繁琐了

Total protein was isolated from fully expanded mature leaves based upon a two-step procedure combining TCA/acetone precipitation and phenol extraction according to Wang et al. (2003), with some modification: (ⅰ) preparation of dry plant tissue power. Frozen leaf material (about 1 g) was pulverized to a fine powder in liquid nitrogen using a mortar and pestle, and then the powder was resuspended in a solution of 10% trichloroacetic acid (TCA) in acetone containing 0.07% 2-mercaptoethanol (2-ME). Proteins were allowed to precipitate for 1 h at −20°C, followed by centrifugation at 15000 g for 15 min at 4°C. The resultant pellet was sequentially rinsed with 10% TCA in acetone containing 0.07% 2-ME several times until the pellet was colorless, and then washed twice with cold acetone twice, and finally twice with cold 80% acetone. Each time the pellet was resuspended completely by vortexing and then centrifuged as above. The final pellet was dried under vacuum and used for phenol extraction of proteins or stored at -80°C for further use. (ⅱ)protein extraction. Phenol extraction of proteins is based on the protocol described by Hurkman and Tanaka (1986). The dried tissue powder was completely resuspended in 5 mL of extraction buffer (0.7 M sucrose, 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA, 0.1 M KCl, 1% w/v polyvinylpyrrolidone (PVP), 2% v/v 2-mercaptoethanol, and 2 mM PMSF), by vortexing thoroughly for 30 min at 4°C. An equal volume of Tris-HCl saturated phenol pH 7.8 was added to the protein suspension. After an additional 30 min of shaking at 4°C, the phases were separated by centrifugation (16000 g for 30 min at 4°C). The phenol phase was collected and re-extracted with an equal volume of extraction buffer. Proteins were precipitated from the phenol phase by adding 5 volumes of 0.1 M ammonium acetate in methanol and incubated at least 2 h or overnight at -20°C. After centrifuging at 16 000g for 15 min (4°C), the collected protein pellets were washed three times with cold 0.1 M ammonium acetate in methanol, and then washed twice with cold 80% acetone. The final protein pellet was dried under vacuum at 4°C and resuspended in 500 μL of solubilization buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 0.4% v/v Triton X-100, 4% w/v CHAPS, 1% dithiothreitol (DTT), 1% v/v IPG buffer pH 4–7) by incubating at room temperature for 1 h. Insoluble matter was removed by centrifugation for 20 min at 16,000g. Protein concentration was determined using Bradford assay (1976).

作者: xue258 时间: 2012-12-3 14:38

楼主发的文章挺不错的，有5-6分的影响因子

作者: tuomu45 时间: 2012-12-3 14:38

有关于牛奶提取酪蛋白的吗？？

作者: 831226 时间: 2012-12-3 15:14

Western-blot 试剂: 电转缓冲液：5.8g Tris，2.9g 甘氨酸，0.37g SDS，200ml 甲醇，配至1000ml，pH 8.3。丽春红溶液：2g 丽春红，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，配至1000ml。 TBS 缓冲液：50mmol/l Tris/HCl，150 mmol/l NaCl,pH7.4。 TTBS 缓冲液：50mmol/l Tris/HCl，150 mmol/l NaCl,pH7.4，0.05/0.1%，Tween－20。封闭液：5％脱脂奶粉，TTBS 配制。抗体稀释液：5%脱脂奶粉，TTBS 配制（一抗含0.1% Tween－20,二抗含0.05% Tween-20）。 DAB 储液：20mg/ml。 NiCl：40mg/ml。 DAB 显色液：250祃 DAB 储液，40祃 NiCl，7祃 30%H2O2，用50mmol/l Tris/HCl(pH7.4)配至10ml。步骤：样品进行SDS-PAGE 后，电转移至NC 膜（肝脏样品）或PVDF 膜（血清样品），分别与抗血清杂交反应，接着在抗鼠二抗中孵育，最后用DAB 显色。

作者: yjf1026 时间: 2012-12-3 15:15

斑竹真的做了一件大好事! 还有,很感谢各位大虾无私的奉献. 有个问题请教各位,关于样品的制备方面,我的样品是动物的肌肉,处理的时候有什么需要注意的吗

作者: qqq111 时间: 2012-12-3 15:16

胶条平衡

胶条平衡好后,我发现我的胶有问题,于是需要重新配制,我就先把胶条放4度冰箱了,大约过了3小时做的第二向,蛋白会大量分解吗?

作者: dongdongqiang 时间: 2012-12-3 15:16

能用36度温浴么，蛋白不会降解么，我都是把蛋白带裂解液放在冰上

作者: dongdongqiang 时间: 2012-12-3 15:17

应该不会，不过最好放在--20度，2，3天没问题。时间长的话要放在--80度

作者: qianqin1977 时间: 2012-12-3 15:17

大家有没有做动物组织双向电泳的啊？

作者: qianqin1977 时间: 2012-12-3 15:18

大家有没有做动物组织双向电泳的啊？为什么我的电泳染色后不显影啊？请问有谁知道什么原因会导致不显影吗？

作者: xingyi08 时间: 2012-12-3 15:19

Powdered fruit or peel tissue (0.2 g) was placed in a 2.0 mL microfuge tube and the protein precipitated at 2207C for 45 min with 1.75 mL of a precipitation solution (10%TCA in ice-cold acetone). The precipitated protein was centrifuged for 10 min at 10 0006g at 297C. The supernatant was discarded and the pellet rinsed with 2 mL of ice-cold acetone and stored at 2207C for 1 h to remove residual TCA then further centrifuged for 15 min at 10 0006g at 2207C. Acetone rinses were repeated until a white pellet was obtained. The protein pellet was dried under vacuum for 5 min and then dissolved in varying volumes of buffer containing 5 M urea, 2 M thiourea, 2%CHAPS, 2% N-decyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propanesulfonate, 20 mM DTT, 5 mM tris(2- carboxyethyl) phosphine hydrochloride, and two carrier ampholytes 0.5%pH 4–6.5 and 0.25%pH 3–11 nonlinear.

作者: pengke1983 时间: 2012-12-3 15:20

我也发个植物提取的方法！

本人主要做水稻蛋白组学，这是实验室总结的水稻及其它植物蛋白提取的方法，与大家分享！ TCA/丙酮法：液氮研磨每400mg叶片加1mlTCA抽提液（10%TCA，0.07%β-巯基乙醇，丙酮配置，-20摄氏度预冷）——震荡——-20摄氏度沉淀过夜——15000rpm/min离心15min，弃上清。——1ml冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇，-20摄氏度预冷），震荡，——-20摄氏度沉淀2小时，——15000rpm/min离心15min，弃上清——加1ml80%冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇，-20摄氏度预冷）震荡，——-20摄氏度沉淀2小时，——15000rpm/min离心15min，弃上清，——加1ml冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇，-20摄氏度预冷）震荡，——-20摄氏度沉淀2小时，——15000rpm/min离心15min，弃上清，——沉淀真空干燥成干粉，-20摄氏度保存。

作者: DDD 时间: 2012-12-3 15:20

有没有极端细菌方面的蛋白提取方法？？

作者: fox_79 时间: 2012-12-3 15:22

我是新手，问个很弱的问题：苹果果肉蛋白可以做2D电泳吗？为什么看到的文章都是做SDS-PAGE的？是不是等点聚焦时会有问题？

作者: fei1226com 时间: 2012-12-3 15:22

我通常用TCA/丙酮法

作者: ending 时间: 2012-12-3 15:23

版主，你那里有有关提取植物根蛋白质的方法吗？我们实验室是新开始做蛋白质的很多都不成熟，我们的胶要自己配，你那里有详细的配置过程吗？如能回答不胜感激，急急急急！谢谢！

作者: 3N4G 时间: 2012-12-3 15:23

版主，你那里有有关提取植物根蛋白质的方法吗？我们实验室是新开始做蛋白质的很多都不成熟，我们的胶要自己配，你那里有详细的配置过程吗？如能回答不胜感激，急急急急！谢谢！

你指的是一向还是二向胶？

作者: dog002 时间: 2012-12-3 15:25

我做细菌蛋白的,小小献丑一下试剂： 1. 10mM Tris/HCl pH 7.0 2. 样品溶解液 8M尿素 2M硫脲 50mM DTT 2% CHAPS 0.2% Carrier Ampholytes 3-10 0.00025%溴酚兰 SW定容至25ml 3. 冰丙酮一.抽提蛋白 1.平板上挑取单菌落接种液体培养基，过夜培养； 2.1：100接种100ml菌液，培养14h； 3.5000rpm， 4℃离心5min收集菌体，20mM Tris/HCl洗三次，重悬于5mlTris/HCl； 4.超声波裂解：power level 5，3min/次，裂解4次； 5.加入DNaseⅠ，RNaseA37℃，作用30min； 6.加入20ml样品溶解液溶解； 7.溶解的样品13,000g, 4℃离心20min，取上清； 8.加入三倍体积丙酮-20℃沉淀2h以上； 9.13,000g, 4℃离心20min，收集沉淀； 10.用冰丙酮洗三次，保存于-20℃备用。二.Bradford法测定蛋白浓度 1）称取0.01g 菌体蛋白，用350μl样品溶解液彻底溶解； 2）8,000 rpm，4℃，3min 离心，取上清； 3）称取3mg BSA溶解于3ml超纯水中，在试管中依次稀释为0，200，400，600，800，1000μg/ml的标准液各100μl； 4）样品蛋白分别稀释20倍和50倍，取100μl备用； 5）在100μl BSA和样品稀释液中各加5ml Bradford工作液，振荡器混匀； 6）打开TU-1810紫外分光光度计，测定BSA标准曲线,测定样品稀释液浓度；三.被动水化12h 四.聚焦电压模式设置： S1 250v 慢速 30min 除盐 S2 1000v 快速 60min 除盐 S3 4000v 线性 3h 升压 S4 4000v 快速 24,000伏小时聚焦 S5 500v 快速任意时间保持选择放置的胶条数；每根胶条的极限电流40μA；等电聚焦温度：17℃。

作者: shenkunjie 时间: 2012-12-3 15:25

操作步骤一、处理标本－80°C 取出标本置于碎冰盒中加入PMSF30ul，PBS1ml洗涤，共3次，滤纸吸干（重复三次），至上清无红细胞 (开启冷冻离心机预冷) 将组织剪碎后移至匀浆器（高压灭菌）中，加入30ul ,1mol/l PH6.8Tris –碱冰浴中完全匀浆加入NE5ul，室温下匀浆，室温放置20-30min 最后5分钟，现配裂解液（上样缓冲液I 1ml ，DTT 0.012g ，IPG buffer 5ul ，蛋白酶抑制剂 10ul）分次加入裂解液，冰浴匀浆匀浆器低速离心1500r/min ×5min（Wash I－20°C预冷）吸取匀浆液至1.5mlEP管（4°C，12000r/min×30min）吸取上清（200ul枪至1.5mlEP管中），记录体积加入3倍体积的沉淀剂I（precipitating agent I）漩涡混匀，冰上孵育15min 加入3倍体积的沉淀剂II（precipitating agent II）漩涡混匀，12000r/min×5min倒掉上清，滤纸吸弃液体蛋白颗粒向外，高速离心15-30s，小枪吸掉上清加入3-4倍于颗粒体积（4oul）的洗剂I（wash reagent I），漩涡混匀，彻底洗涤蛋白颗粒 12000r/min×5min，小枪吸弃液体加足够聚合蛋白颗粒的超纯水（25ul），不应太多，漩涡混匀加入－20°C预冷至少1hr的洗剂II1ml（为样本量的10倍，也至少为加水量的10倍）加入洗剂II辅助剂（wash II additive）5ul，漩涡1min，－20°C孵育30min，每隔10min漩涡一次（20-30s/次） 12000r/min×5min，吸弃液体，瞬时离心15-30s，彻底吸弃洗涤剂室温风干（不超过5min）至颗粒半透明（不能太干）（现配裂解液）加入原样本量的裂解液复融，漩涡30s混匀，室温孵育3-5min（漩涡混匀1min或是来回上下颠倒混匀）至蛋白质差不多溶解，太稠，再加适量裂解液室温下（20°C）12000r/min×2-5min（使蛋白样品澄清，储存剩余的蛋白样品于一干净的Ep管中用于更迟的分析，－80°C保存）取10ul样本，加入90ul超纯水（10倍稀释）取10ul 稀释液，加入3.0ml 考马斯G-250比色入＝595nm，G-250空白调零，每个样本三个平行，记录A值，根据标准曲线算出蛋白浓度根据上样量确定上样体积，并根据上样体积分装之0.5mlEp管中，冰盒保存，剩余样本－80°C存(上样量/（品浓度×10)上样体积) 二、溶胀；－20°C取出IPG胶条，室温下恢复常温（10min）－80°C取出样本，恢复液态。Count：（13cm PH3-10 250ul：上样体积＋IPG buffer 1.5ul＋DTT 5ul〔0.02g＋125ul 超纯水现配〕＋裂解液＋溴芬兰 1ul＝250ul）注：17cm，PH3-10 340ul： IPG buffer 2 ul，DTT 7ul 将溶胀盘（clean）调水平把样品从左向右缓慢加入（切勿产生气泡）撕开胶条保护膜，胶面朝下，正极与正极保持一致，缓慢放下，赶走胶下所以气泡放置1hr（盖上盖子），1hr后加入矿物油（先负极端加到胶条1/3，然后正极加入，混合）翌日溶胀结束（一般12-14hr）三、等电聚焦 1、从溶胀盘中把胶条用滤纸将矿物油吸干后转入电泳槽中，胶面朝上，胶条阳极端与旁标的数字对齐，在胶条的两端（接触到溶胀部位），放上10uL超纯水湿润的盐桥，夹上夹子（盐桥一定要放正，否则跑出的溴芬兰带会歪掉） 2、从胶条中间开始加入矿物油，让有流满整个槽子，但不能太满，胶条及胶条所在槽加新油，其他槽加回收油（不能让导线暴露在空气中） 3、设好程序：17°C 50uA 13cm S1 250V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 8000V 线性 4hr 升压 S4 8000V 快速 40，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速任意时间保持 4、设好程序： S1 500V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 10000V 线性 4hr 升压 S4 10000V 快速 60，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速任意时间保持四、凝胶电泳 1、在等电聚焦时，把胶制好，注意不要干胶。 13cm 胶条配方（边加边搅拌）超纯水 17.7ml 30％丙烯酰胺 25.95ml Tris –碱（PH8.8） 15ml 10％SDS（室温） 600ul 10％AP（现配） 600ul TEMED 24ul 18cm胶条配方（100ml）超纯水 29.62ml 30％丙烯酰胺 43.27ml Tris –碱（PH8.8） 25ml 10％SDS（室温） 1000ul 10％AP（现配） 1000ul TEMED 40ul 18cm胶条配方（80ml）超纯水 23.7ml 30％丙烯酰胺 34.62ml Tris –碱（PH8.8） 20ml 10％SDS（室温） 800ul 10％AP（现配） 800ul TEMED 32ul 注意：AP与TEMED同时加入！ 2、胶条从－20°C转到室温，放10min，同时取出胶条平衡母液（-20°C），室温解冻。平衡液I：0.1gDTT，10ml平衡母液平衡液II：0.25g碘乙酰胺，10ml平衡母液摇床准确平衡15min，配制电泳缓冲液（10×电泳缓冲液 50ml加入双蒸水450ml），快结束时候把胶条转移到另外两个槽，加入平衡液II，还有5min时候溶解琼脂糖，双蒸水系胶3次，侧着架子把水吸干。 3、平衡结束转移胶条至滤纸，用超纯水冲洗上胶，加Marker （10ul 滤纸）在阴极端，用琼脂糖封胶。 4、上胶到电泳槽中，继续用琼脂糖封胶，大开冷凝器（10°C）待琼脂糖凝固后，加入电解缓冲液，上盖。 5、开始电泳，设定电流为5mA/gel，一般30min 后溴芬兰跑出胶条成一条直线，此时加大电流到30mA/gel。（350V，30W，5.5hr）五、染色脱色 1、夹板中取出凝胶，贴到考马斯亮兰R -250中，切角标记，小号30°，大号45°，切到Marker 的对角。（0.2％考兰＋20％冰醋酸，对倍稀释染色） 2、振荡2hr，结束回收染液。 3、结束时换一盆装好月1000ml的双蒸水，漂洗1-2次。 4、配制脱色液：80ml冰醋酸＋250ml无水乙醇＋ddH2O至1000ml，脱色月50min。 5、在配置脱色液，月1hr左右摇至背景干净，清晰可见点。 6、双蒸水终止脱色，最后换双蒸水浸泡，扫描，封上保鲜膜4°C保存。

作者: shenkunjie 时间: 2012-12-3 15:26

动物组织

操作步骤一、处理标本－80°C 取出标本置于碎冰盒中加入PMSF30ul，PBS1ml洗涤，共3次，滤纸吸干（重复三次），至上清无红细胞 (开启冷冻离心机预冷) 将组织剪碎后移至匀浆器（高压灭菌）中，加入30ul ,1mol/l PH6.8Tris –碱冰浴中完全匀浆加入NE5ul，室温下匀浆，室温放置20-30min 最后5分钟，现配裂解液（上样缓冲液I 1ml ，DTT 0.012g ，IPG buffer 5ul ，蛋白酶抑制剂 10ul）分次加入裂解液，冰浴匀浆匀浆器低速离心1500r/min ×5min（Wash I－20°C预冷）吸取匀浆液至1.5mlEP管（4°C，12000r/min×30min）吸取上清（200ul枪至1.5mlEP管中），记录体积加入3倍体积的沉淀剂I（precipitating agent I）漩涡混匀，冰上孵育15min 加入3倍体积的沉淀剂II（precipitating agent II）漩涡混匀，12000r/min×5min倒掉上清，滤纸吸弃液体蛋白颗粒向外，高速离心15-30s，小枪吸掉上清加入3-4倍于颗粒体积（4oul）的洗剂I（wash reagent I），漩涡混匀，彻底洗涤蛋白颗粒 12000r/min×5min，小枪吸弃液体加足够聚合蛋白颗粒的超纯水（25ul），不应太多，漩涡混匀加入－20°C预冷至少1hr的洗剂II1ml（为样本量的10倍，也至少为加水量的10倍）加入洗剂II辅助剂（wash II additive）5ul，漩涡1min，－20°C孵育30min，每隔10min漩涡一次（20-30s/次） 12000r/min×5min，吸弃液体，瞬时离心15-30s，彻底吸弃洗涤剂室温风干（不超过5min）至颗粒半透明（不能太干）（现配裂解液）加入原样本量的裂解液复融，漩涡30s混匀，室温孵育3-5min（漩涡混匀1min或是来回上下颠倒混匀）至蛋白质差不多溶解，太稠，再加适量裂解液室温下（20°C）12000r/min×2-5min（使蛋白样品澄清，储存剩余的蛋白样品于一干净的Ep管中用于更迟的分析，－80°C保存）取10ul样本，加入90ul超纯水（10倍稀释）取10ul 稀释液，加入3.0ml 考马斯G-250比色入＝595nm，G-250空白调零，每个样本三个平行，记录A值，根据标准曲线算出蛋白浓度根据上样量确定上样体积，并根据上样体积分装之0.5mlEp管中，冰盒保存，剩余样本－80°C存(上样量/（品浓度×10)上样体积) 二、溶胀；－20°C取出IPG胶条，室温下恢复常温（10min）－80°C取出样本，恢复液态。Count：（13cm PH3-10 250ul：上样体积＋IPG buffer 1.5ul＋DTT 5ul〔0.02g＋125ul 超纯水现配〕＋裂解液＋溴芬兰 1ul＝250ul）注：17cm，PH3-10 340ul： IPG buffer 2 ul，DTT 7ul 将溶胀盘（clean）调水平把样品从左向右缓慢加入（切勿产生气泡）撕开胶条保护膜，胶面朝下，正极与正极保持一致，缓慢放下，赶走胶下所以气泡放置1hr（盖上盖子），1hr后加入矿物油（先负极端加到胶条1/3，然后正极加入，混合）翌日溶胀结束（一般12-14hr）三、等电聚焦 1、从溶胀盘中把胶条用滤纸将矿物油吸干后转入电泳槽中，胶面朝上，胶条阳极端与旁标的数字对齐，在胶条的两端（接触到溶胀部位），放上10uL超纯水湿润的盐桥，夹上夹子（盐桥一定要放正，否则跑出的溴芬兰带会歪掉） 2、从胶条中间开始加入矿物油，让有流满整个槽子，但不能太满，胶条及胶条所在槽加新油，其他槽加回收油（不能让导线暴露在空气中） 3、设好程序：17°C 50uA 13cm S1 250V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 8000V 线性 4hr 升压 S4 8000V 快速 40，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速任意时间保持 4、设好程序： S1 500V 线性 1hr 除盐 S2 1000V 快速 1hr 除盐 S3 10000V 线性 4hr 升压 S4 10000V 快速 60，000V/hr 聚焦 S5 500V 快速任意时间保持四、凝胶电泳 1、在等电聚焦时，把胶制好，注意不要干胶。 13cm 胶条配方（边加边搅拌）超纯水 17.7ml 30％丙烯酰胺 25.95ml Tris –碱（PH8.8） 15ml 10％SDS（室温） 600ul 10％AP（现配） 600ul TEMED 24ul 18cm胶条配方（100ml）超纯水 29.62ml 30％丙烯酰胺 43.27ml Tris –碱（PH8.8） 25ml 10％SDS（室温） 1000ul 10％AP（现配） 1000ul TEMED 40ul 18cm胶条配方（80ml）超纯水 23.7ml 30％丙烯酰胺 34.62ml Tris –碱（PH8.8） 20ml 10％SDS（室温） 800ul 10％AP（现配） 800ul TEMED 32ul 注意：AP与TEMED同时加入！ 2、胶条从－20°C转到室温，放10min，同时取出胶条平衡母液（-20°C），室温解冻。平衡液I：0.1gDTT，10ml平衡母液平衡液II：0.25g碘乙酰胺，10ml平衡母液摇床准确平衡15min，配制电泳缓冲液（10×电泳缓冲液 50ml加入双蒸水450ml），快结束时候把胶条转移到另外两个槽，加入平衡液II，还有5min时候溶解琼脂糖，双蒸水系胶3次，侧着架子把水吸干。 3、平衡结束转移胶条至滤纸，用超纯水冲洗上胶，加Marker （10ul 滤纸）在阴极端，用琼脂糖封胶。 4、上胶到电泳槽中，继续用琼脂糖封胶，大开冷凝器（10°C）待琼脂糖凝固后，加入电解缓冲液，上盖。 5、开始电泳，设定电流为5mA/gel，一般30min 后溴芬兰跑出胶条成一条直线，此时加大电流到30mA/gel。（350V，30W，5.5hr）五、染色脱色 1、夹板中取出凝胶，贴到考马斯亮兰R -250中，切角标记，小号30°，大号45°，切到Marker 的对角。（0.2％考兰＋20％冰醋酸，对倍稀释染色） 2、振荡2hr，结束回收染液。 3、结束时换一盆装好月1000ml的双蒸水，漂洗1-2次。 4、配制脱色液：80ml冰醋酸＋250ml无水乙醇＋ddH2O至1000ml，脱色月50min。 5、在配置脱色液，月1hr左右摇至背景干净，清晰可见点。 6、双蒸水终止脱色，最后换双蒸水浸泡，扫描，封上保鲜膜4°C保存。

作者: remenb 时间: 2012-12-3 15:26

2-D做的过程中有很多问题呢，呵呵，大家交流一下问题吧

作者: yychen 时间: 2012-12-3 15:27

蛋白浓度测定方法

蛋白浓度测定方法 BCA法测蛋白浓度步骤：准备工作液（working reagent）：50A:1B和标准品（至少5个） 25ul样品加200ulWR{ 2.5uL稀释10倍（2.5uL+22.5uL）} 震荡30秒 37℃孵箱内孵育30分钟冷却至室温后测562nm处紫外（使用程序27） Black 0.87s Auto zero 1. stock 2000 2. 八个标准梯度 Folin法测定蛋白含量 1. 用品和仪器：分光光度剂，试管及试管架，微量自动取液仪（20，100，200，1000UL） 2. 试剂：试剂甲：贮液A(4g/100mlNa2CO3),贮液B(0.2mol/100lNaOH),贮液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),贮液D（2g/100ml 酒石酸钾钠）临用前将A和B等体积混合为碳酸钠－氢氧化钠溶液，C与D混合盛Folin-酚试剂甲，一天内有效试剂乙：取乌酸钠100G，目酸钠25G，置于2000ml膜口回流装置内，加蒸馏水700ml，85％磷酸50ml和浓盐酸100ml，充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10小时（烧瓶中加入玻璃珠以防溶液外溅）再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液溴数滴，在通风厨开口煮沸15分钟，以除去多余的溴，冷却后定容与1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，颜色为鲜黄色，置于棕色瓶中，可在冰箱长期保存，颜色变绿，在加几滴溴，煮沸数分钟，恢复原色试剂乙在使用前应该确定其酸度，使之滴定标准氢氧化钠试剂(1mol/l),以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红－紫红－紫灰－墨绿即可为终点，酸度为2MOL/L将其稀释到1mo/l即可标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清蛋白3mg溶于双证水中，定容于10ML,浓度为0.3mg/ml 3实验方法：1。取16mm*150mm试管13支，标明号码，放置与试管架，在1－11号试管中分别加入标准牛蛋白血清（0.3mg/ml）0,0.1,0.2--------1.0ml,补足双蒸水至每管体积1.0ml，在12，13管中加入待测样品100UL，并补足双蒸水至1。0ml 3. 加入5.0ml新配置的试剂甲，立即混匀，在室温下放置10分钟 4. 各管中加入0.5ml试剂乙，充分混匀，（用振荡器），然后室温放置30－60min 5. 将标准样及待测样品在可见光光度计上比色，如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色，如果在100ug/ml之内，则在550nm波长下比色 6. 根据已知含量的标准样品测得的光吸收值做标准曲线，然后根据待测样品的光吸收值在标准曲线上查出蛋白含量酪安酸差色光谱法 1. 打开分光光度剂，预热30分钟，是紫外灯处于稳定发光状态 2. 在2容积为1mlde 微量石英比色杯中分别加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸缓冲液，把盛有PH12.0缓冲液的比色杯放入样品杯中放入支架上，把盛有PH7.4缓冲液的比色杯放入到参比杯的支架上，然后准确的测出295nm波长下的光吸收值，或用250－350nm扫描 3. 在上述的2个比色杯中分别加入100UL的待测样品液，小心振荡混匀 4. 重复2操作 5. 计算蛋白浓度：﹝(PH为12.0A295-PH为7.4A295)/2.330×N﹞×W N是蛋白分子中酪安酸毫摩尔消光系数之差 W是样品稀释倍数紫外光吸收法测定蛋白浓度 1．用品和仪器：紫外分光光度剂，微量自动取液仪 2．试剂：标准蛋白质溶液：准确称重的纯净蛋白质，配成1mg/ml储液置于4度中备用 0.1mol/l磷酸缓冲液，PH7.4;0.1mol/l磷酸缓冲液，PH12.0 3.试验程序： 1，在2个洁净干净的石英比色杯中（内径1cm）中加入蒸馏水或其他用于溶解标准蛋白质与待测样品的缓冲液，其中一个作为参比杯（在以后测量不变），另一个作为样品杯，放入分光光度剂的相应位置 2，记录下空白杯在280260nm处的光吸收值，或对之进行250－350nm波长范围的基线扫描 3，移去样品比色杯中的蒸馏水或是缓冲液，干燥比色杯（用滤纸吸取残液） 4，在样品比色杯中加入待测样品液，在实验中提取样品30ul加入2970ul双证水，混匀，样品液事先通过离心或用0.2um孔径的滤膜过滤 5，重复2步骤 6．蛋白含量计算：蛋白浓度（mg/ml）=1。55A280—0.76A260

作者: yychen 时间: 2012-12-3 15:31

蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)

蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术) 1 原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 2 操作过程 SDS-PAGE电泳→转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭→一抗→洗涤→酶标二抗反应洗涤→显色或化学发光显影 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. 3 注意的问题（1）蛋白质电泳常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。（2）转膜戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极排去滤纸、胶和膜间的气泡。电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置（3）封闭用5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）时间：室温2h或4ºC过夜（4）显色或显影显色辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定（5）膜的再利用化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping －2ME ） Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交二、ELISA 1 原理： ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。 ELISA 常用的酶和底物辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色，检测波长492nm TMB，蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）, 黄色检测波长405nm ELISA各步骤的反应时间包被：24－36h，蛋白浓度为1－5ug/ml 封闭：37ºC 2h 或4ºC过夜（3％BSA）样本反应时间：37ºC 45min-1h 酶标抗体反应时间： 37ºC 45min-1h 显色时间：15min(避光）设对照可以一次包被多块板，冻存备用 2 类型（1）间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。 (2) 双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体单克隆抗体＋单克隆抗体后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。双抗体夹心法测抗原的方法：捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含0.1％Tween的PBS)→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测 (3)竞争法测抗原 1）抗体固相测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测 2）抗原固相测抗原其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法: a: 抗原包被96孔板； b:封闭; c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板 e: 洗涤 f：加入酶标二抗 g：洗涤 h：显色和检测（4）IgM抗体的检测 1）间接法：间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。

作者: yychen 时间: 2012-12-3 15:32

因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。方法： a: 抗原包被96孔酶标板； b:封闭; c: 待测血清与A蛋白反应一定时间后离心 d: 吸取上清液加入96孔酶标板 e: 洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体 g：洗涤 h：显色和检测 2）捕获包被法（夹心法）先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM)。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。方法： a: 抗人IgM抗体包被96孔酶标板； b:封闭; c: 加入待测血清； d: 洗涤96孔酶标板 e: 加入相应抗原 f：加入抗原特异的酶标抗体 g：洗涤 h：显色和检测（5） ABS-ELISA技术（Avidin Biotin system-ELISA 原理亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。操作过程：抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和检测三免疫荧光技术利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。（一）细胞膜蛋白分子的检测原理：细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量 1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗CD分子的抗体→4ºC反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析。 2 间接法：细胞＋抗CD分子的抗体→4ºC 反应30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标) 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。样本处理和染色方法 1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

作者: yychen 时间: 2012-12-3 15:33

3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。（二）细胞内蛋白分子的检测细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。操作过程：（1）直接法：细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或流式细胞计分析（2）间接法：细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→针对蛋白的特异抗体→洗涤→荧光素标记的二抗→洗涤 → 荧光显微镜观察或流式细胞计分析凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。 1 悬浮细胞的染色：（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1×106），PBS洗2次，（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。（5）加入 FITC标记的TFAR19单抗，4°C反应30min （6）荧光细胞洗液洗2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。 2：贴壁细胞的原位染色（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。四免疫组织化学技术原理：是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组化染色技术的分类免疫荧光法（Immunofluorescence technique）免疫酶法（Immunoperoxidase technique）免疫金银法（（Immunogold technique） ABC法（ Avidin-Biotin Complex）五蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术 1 GST融合蛋白进行Pulldow实验（1）原理细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用（2）方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行 2 免疫共沉淀（1）原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用

作者: sunnyB 时间: 2012-12-3 15:33

Saravanan R S, Rose J K C. 2004. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics, 4: 2522-2532. Shen S H, Jing Y X, Kuang T Y. 2003a. Proteomics approach to identify wound-response related proteins from rice leaf sheath. Proteomics, 3: 527-535. Shen S H, Sharma A, Komatsu S. 2003b. Characterization of proteins responsive to Gibberellin in the leaf-sheath of rice Oryza sativa L seedling using proteome analysis. Biol Pharm Bull, 26: 129-136. Chan, Z.L., Qin, G.Z., Xu, X.B., Li, B.Q., and Tian, S.P. 2007. Proteome approach to characterize proteins induced by antagonist yeast and salicylic acid in peach fruit. J. Proteome Res. 6: 1677-1688. 版主有你的这几篇参考文献的原文吗？

作者: zwsyrt 时间: 2012-12-3 15:34

好贴啊，我刚做蛋白不久，暂时没有什么好的protocols，以后有了再跟贴

作者: bring 时间: 2012-12-3 15:35

我也刚刚开始尝试做2-D蛋白电泳，请问有没有人做微生物菌体蛋白的？

作者: qqq111 时间: 2012-12-3 15:36

这个主意确实不错，自己的PROTOCOL, 经过实验验证了的就是无价之宝。，可惜我现在还没有跑出好的胶图，等成功了，我也把自己的PROTOCOL 给大家分享

作者: 眼药水~ 时间: 2012-12-3 15:39

有没有做昆虫蛋白质组学研究的？

作者: bamboo16 时间: 2012-12-3 15:40

有没有提取昆虫组织蛋白的好方法啊？

作者: c86v 时间: 2012-12-3 15:40

植物叶片大亚基沉淀？怎么沉呢

作者: glass 时间: 2012-12-3 15:40

我买配好的胶溶液，效果很好

作者: hold住 时间: 2012-12-3 15:41

我用的是trizol法提取蛋白，感觉效果还挺不错

作者: flower-201 时间: 2012-12-3 15:41

样品制备

样品制备蛋白含量低怎么办？

作者: zsxan1990 时间: 2012-12-3 15:42

求助

我也是样品制备后蛋白含量很低

作者: vcve 时间: 2012-12-3 15:43

我也是要大量的蛋白，在纯化植物微管蛋白，分析，痛苦中。

作者: BOSS2011 时间: 2012-12-3 15:43

Here is a protocol that I developed to purify small and hydrophobic peptides (4 kDa). The end purpose was for antibody production. Peptides were passively extracted from SDS gel slices. Cells (BL21 Star™(DE3) pLysS) were lysed at room temperature using 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 5 mM EDTA. Inclusion bodies were collected at 12000g for 30 min at room temperature and followed by 25000g for 10 min after resuspending in the lysis buffer. The pellet was solubilized with Laemmli loading buffer and fractionated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Laemmli 1970; Schägger 1994) using a Tris-Tricine buffer. Protein containing gel slices were frozen in liquid N2 and ground into small pieces. Expressed proteins were then eluted passively at 37°C by soaking in 1% SDS (~500 μl for every 200 μl Vol gel slice) for 1.5 h with constant motion. Eluted proteins along with SDS were injected into rabbits. Surprisingly, they were alive after injection and produced great antiserum. Hope this may help someone. Cheers,

作者: tudou85 时间: 2012-12-3 15:43

Ttizol法提取蛋白没人做吗？效果怎么样，最好是植物蛋白的

作者: gogo 时间: 2012-12-3 15:44

楼主请问TCA/丙酮是如何配制的，是不是10%TCA，0.07%β-巯基乙醇，丙酮配置

作者: shenkunjie 时间: 2012-12-3 15:45

忘了告诉楼主，我也在做药用植物蛋白质组，过程中有较多的疑惑，以后再逐一请教！谢谢分享了如此多的经验知识，祝一切顺利！

作者: birdfish 时间: 2012-12-3 15:45

动物组织蛋白提取方法

操作步骤处理标本－80°C 取出标本置于碎冰盒中加入PMSF30ul，PBS1ml洗涤，共3次，滤纸吸干（重复三次），至上清无红细胞 (开启冷冻离心机预冷) 将组织剪碎后移至匀浆器（高压灭菌）中，加入30ul ,1mol/l PH6.8Tris –碱冰浴中完全匀浆加入NE5ul，室温下匀浆，室温放置20-30min 最后5分钟，现配裂解液（上样缓冲液I 1ml ，DTT 0.012g ，IPG buffer 5ul ，蛋白酶抑制剂 10ul）分次加入裂解液，冰浴匀浆匀浆器低速离心1500r/min ×5min（Wash I－20°C预冷）吸取匀浆液至1.5mlEP管（4°C，12000r/min×30min）吸取上清（200ul枪至1.5mlEP管中），记录体积加入3倍体积的沉淀剂I（precipitating agent I）漩涡混匀，冰上孵育15min 加入3倍体积的沉淀剂II（precipitating agent II）漩涡混匀，12000r/min×5min倒掉上清，滤纸吸弃液体蛋白颗粒向外，高速离心15-30s，小枪吸掉上清加入3-4倍于颗粒体积（4oul）的洗剂I（wash reagent I），漩涡混匀，彻底洗涤蛋白颗粒12000r/min×5min，小枪吸弃液体加足够聚合蛋白颗粒的超纯水（25ul），不应太多，漩涡混匀加入－20°C预冷至少1hr的洗剂II1ml（为样本量的10倍，也至少为加水量的10倍）加入洗剂II辅助剂（wash II additive）5ul，漩涡1min，－20°C孵育30min，每隔10min漩涡一次（20-30s/次）12000r/min×5min，吸弃液体，瞬时离心15-30s，彻底吸弃洗涤剂室温风干（不超过5min）至颗粒半透明（不能太干）（现配裂解液）加入原样本量的裂解液复融，漩涡30s混匀，室温孵育3-5min（漩涡混匀1min或是来回上下颠倒混匀）至蛋白质差不多溶解，太稠，再加适量裂解液室温下（20°C）12000r/min×2-5min（使蛋白样品澄清，储存剩余的蛋白样品于一干净的Ep管中用于更迟的分析，－80°C保存）取10ul样本，加入90ul超纯水（10倍稀释）取10ul 稀释液，加入3.0ml 考马斯G-250比色入＝595nm，G-250空白调零，每个样本三个平行，记录A值，根据标准曲线算出蛋白浓度根据上样量确定上样体积，并根据上样体积分装之0.5mlEp管中，冰盒保存，剩余样本－80°C存(上样量/（品浓度×10)上样体积)

作者: zhenxin 时间: 2012-12-3 15:46

本人做的是马铃薯蛋白质组学，其块茎蛋白的提取方法一般为：改良三氯乙酸／丙酮沉淀法根据Görg等（2000）和Hajduch等（2001）的方法稍有改动。其步骤为：取材料约1 g，研磨成细粉末后，按植物材料鲜重1 : 2（w/v）的比例加入蛋白质提取缓冲液2 mL（40 mM Tris-HCl，pH 7.0）。将研碎样品摇匀，并在4 oC条件下放置1 h，充分溶解蛋白质。放置后的样品摇匀，15000 × g离心5 min，上清液同条件下再次离心10 min，收集上清液加入5~10倍体积的预冷丙酮。涡旋振荡后静置于-20 oC，过夜沉淀，12000 × g离心15 min，沉淀重悬于含0.07% β-巯基乙醇的等体积预冷丙酮溶液里（1~2次），12000 × g离心5 min，真空干燥沉淀，得到的粗蛋白质干粉用分析天平进行称重后，-70 oC保存备用，或直接进行下一步提取。

作者: flower-201 时间: 2012-12-3 15:48

求助

请问有做细菌分泌蛋白的吗？能不能介绍下啊？十分感谢~

作者: DNA 时间: 2012-12-3 15:50

能分享一下植物叶片蛋白提取的方法吗？ PS：植物叶片中的高峰度蛋白如Rubisco会干扰电泳结果吗？需不需要用什么专一性抑制剂除掉啊？

作者: tangxin_80 时间: 2012-12-3 15:50

请问能分享一下植物叶片蛋白提取的方法吗？本人刚开始做，中间有很多问题，希望高手能指点一二，非常感谢~~ PS：植物叶片中的高峰度蛋白如Rubisco会干扰电泳结果吗？需要排除干扰吗？应该怎样去除啊？用什么抑制剂比较好？

作者: jrwyyplt 时间: 2012-12-3 15:51

请问能分享一下植物叶片蛋白提取的方法吗？叶片中的高峰度蛋白如Rubisco需要用专一性抑制剂降低吗？

作者: wood533 时间: 2012-12-3 16:00

Protein Extraction from Drosophila

Protein Extraction from Drosophila Protein extracts were prepared from salivary glands dissected from third instar larvae homogenized in a buffer comprising: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.2% Triton X-100, 0.2% NP40, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1.5 μg/ml aprotinin.

作者: 66小飞侠 时间: 2012-12-3 16:00

谁有植物膜蛋白的提取方法

七次跨膜蛋白的提取方法谁有？传上来分享下！

作者: sunnyB 时间: 2012-12-3 16:00

质谱结果中出现很多unnamed protein product 该怎么处理

后续的验证试验该怎么做,有没有专门的生物公司提供全套服务的

作者: DONT 时间: 2012-12-3 16:01

质谱结果中出现很多unnamed protein product 该怎么处理

后续的验证试验该怎么做,有没有专门的生物公司提供全套服务的

作者: remenb 时间: 2012-12-3 16:02

植物膜蛋白的提取

哪位做植物膜蛋白的提取，我做的是植物的跨膜蛋白相关，但是在提取膜蛋白的过程中遇到了麻烦，希望得到资深蛋白研究大侠的帮助。不胜感激

作者: xyw5 时间: 2012-12-3 16:03

怎么没有细菌的呀？

作者: standbyme 时间: 2012-12-3 16:03

做小麦谷蛋白电泳

跑的条带很不清晰，也不知道是什么环节出了问题

作者: yychen 时间: 2012-12-3 16:04

Phenol extraction of proteins

Phenol extraction of proteins is based on the protocol described before [8], but we carried out it in the presence of SDS (designated as phenol/SDS extraction). About 0.05–0.1 g of the dry powder of leaf tissue was resuspended in 0.8 mL phenol (Tris-buffered, pH 8.0; Sigma St. Louis, MO, USA) and 0.8 mL dense SDS buffer (30% sucrose, 2% SDS, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 5% 2-mercaptoethanol) in a 2.0 mL microtube. The mixture was vortexed thoroughly for 30 s and the phenol phase was separated by centrifugation at 10 000g for 3 min. The upper phenol phase was pipetted to fresh microtubes (0.2 mL for 1.5 mL tube, 0.4 mL for 2.0 mL tube). After phase separation, white SDS complex often appears at the interphase. Be careful not to disturb the interphase by pipetting. If the recovered phenol phase is not clear, pool phenol phase together and centrifuge again. At least 5 volumes of cold methanol plus 0.1 M ammonium acetate was added to the phenol phase and the mixture was stored at 20C for 30 min. Precipitated proteins were recovered at 10 000g for 5 min, and then washed with cold methanolic ammonium acetate twice and cold 80% acetone twice. The final pellet was dried and dissolved in a buffer of choice, such as Laemmli buffer [10] or 2-DE rehydration solution (8 M urea, 4% CHAPS, 2% IPG buffer, 20 mM dithiothreitol)

作者: moonlight45 时间: 2012-12-3 16:04

有没有容易出错的地方多提提啊，打算着手做呢？双向电泳的胶条那个公司的好啊？

作者: 04906 时间: 2012-12-3 16:05

求助

有哪位高手指点下：细菌培养液中提取其分泌蛋白的方法。谢谢啦

作者: wu11998866 时间: 2012-12-3 16:06

结核杆菌（菌体）分泌蛋白的制备请哪位高手指点下新人：如何在结核杆菌培养液中分离其分泌蛋白（具体点，因为没做过实验）。深表谢意。

作者: redbutterfly 时间: 2012-12-3 16:07

current use for sample preparation for gel sample

Preparation for gel sample  Precast gels (INVITROGEN, BioRad)‏  Reduction and alkylation before gel run  Reduce with DTT, DTE or TCEP  Alkylate with Iodoacetamide  See sample prep handbook  Disolve the sample in SDS-buffer without reducing agent  no -mercaptoethanol, no DTT, no DTE  Reduce with 10 mM DTT, DTE, or TCEP  Never use -mercaptoethanol !!!!!!  Add 1/10 of the sample volume 100 mM stock solution  DTT and DTE: 5 – 10 min at 100 C  TCEP: 15 min at 60 C  Cool down to RT  Add 20 mM Iodacetamide and incubate for 30 min at RT  Load and run gel Note: o Leave one lane free between each lane to be cut o Do not overload gel o Run the gel under optimal conditions (Voltage)‏  Coomassie blue stain (colloidal preferred)‏  If you use own Coomassie solution – make it fresh, also destainer  Silver stained gels will be rejected  Stain in new 10 x 10 cm quadratic containers  Do not reuse old ones (contamination)‏  Scan gel (pack between plastic sheets to avoid contamination)‏  Clearly label lanes/bands/areas to be cut and analysed  2-D gel spots‏

作者: redbutterfly 时间: 2012-12-3 16:07

Preparation for gel sample  Precast gels (INVITROGEN, BioRad)‏  Reduction and alkylation before gel run  Reduce with DTT, DTE or TCEP  Alkylate with Iodoacetamide  See sample prep handbook  Disolve the sample in SDS-buffer without reducing agent  no -mercaptoethanol, no DTT, no DTE  Reduce with 10 mM DTT, DTE, or TCEP  Never use -mercaptoethanol !!!!!!  Add 1/10 of the sample volume 100 mM stock solution  DTT and DTE: 5 – 10 min at 100 C  TCEP: 15 min at 60 C  Cool down to RT  Add 20 mM Iodacetamide and incubate for 30 min at RT  Load and run gel Note: o Leave one lane free between each lane to be cut o Do not overload gel o Run the gel under optimal conditions (Voltage)‏  Coomassie blue stain (colloidal preferred)‏  If you use own Coomassie solution – make it fresh, also destainer  Silver stained gels will be rejected  Stain in new 10 x 10 cm quadratic containers  Do not reuse old ones (contamination)‏  Scan gel (pack between plastic sheets to avoid contamination)‏  Clearly label lanes/bands/areas to be cut and analysed  2-D gel spots‏

作者: redbutterfly 时间: 2012-12-3 16:08

Preparation for gel sample

Preparation for gel sample Precast gels (INVITROGEN, BioRad)‏ Reduction and alkylation before gel run Reduce with DTT, DTE or TCEP Alkylate with Iodoacetamide See sample prep handbook Disolve the sample in SDS-buffer without reducing agent  no -mercaptoethanol, no DTT, no DTE Reduce with 10 mM DTT, DTE, or TCEP Never use -mercaptoethanol !!!!!! Add 1/10 of the sample volume 100 mM stock solution DTT and DTE: 5 – 10 min at 100 C TCEP: 15 min at 60 C Cool down to RT Add 20 mM Iodacetamide and incubate for 30 min at RT Load and run gelNote:o Leave one lane free between each lane to be cuto Do not overload gelo Run the gel under optimal conditions (Voltage)‏ Coomassie blue stain (colloidal preferred)‏ If you use own Coomassie solution – make it fresh, also destainer Silver stained gels will be rejected Stain in new 10 x 10 cm quadratic containers Do not reuse old ones (contamination)‏ Scan gel (pack between plastic sheets to avoid contamination)‏ Clearly label lanes/bands/areas to be cut and analysed 2-D gel spots‏

作者: wmp1234 时间: 2012-12-3 16:09

湿转（wb转膜）配置湿法电转液： 25mM Tris, 192mM glycine,20% v/v methanol, pH 8.3 3.0275 g Tris; 14.413 g Gly; 200 ml 甲醇蒸馏水稀释到1 L. 至冰 PVDF膜：甲醇（乙醇）浸润10mi=> 纯净水 5min * 2 => 电转液 10 min 滤纸：电转液〉10 min Gel: 电转液 30 min 电转液倒入电泳槽中，浸泡夹心板，多孔垫片。这几步共需要 1.5 L左右的电转液。 1）红色（+）——〉黑色（-）依次安装白色边盒-〉多孔垫片-〉滤纸-〉PVDF膜-〉gel-〉滤纸-〉多孔垫片-〉黑色边盒左上角剪角，P.S安装过程尽量避免产生气泡 2）转膜三明治装入电转移，并在电泳槽中加入预冻冰盒，电转仪入盆，用冰包埋。 3）电流 = 凝胶面积*2 mA （30mA）电转 2-4 小时。参考转膜时间： 30V过夜，60V3h，100V2h 实验对象对肝癌与肝永生细胞

作者: JK.jon 时间: 2012-12-3 16:09

有没有动物细菌蛋白的的提取方法

作者: xyw5 时间: 2012-12-3 16:09

请问，蛋白质提取的缓冲溶液中，只注明mM的量是多少?

作者: www.1 时间: 2012-12-3 16:10

昆虫双向电泳概论

1 样品处理，经液氮冷冻后置于-80℃备用。 2 总蛋白的抽提及浓度测定（1）蛋白裂解液裂解及后续处理
用Bradford法定量蛋白含量，然后根据所需蛋白量分装至离心管中-20℃保存备用。
（2）Brandford法测定蛋白质浓度蛋白样品浓度测定：用Brandford法，测定标准蛋白和样品的595nm吸收峰处的吸光光度值，采用标准曲线法测定并计算确定样品蛋白质的浓度

作者: www.1 时间: 2012-12-3 16:11

   BSA（μL）    ddH2O (μL)    Brandford(mL)    A595
对照    0    300    3    0.000
1    7.5    292.5    3
1    7.5    292.5    3
2    15    285    3
2    15    285    3
3    22.5    277.5    3
3    22.5    277.5    3
4    30    270    3
4    30    270    3
5    37.5    262.5    3
5    37.5    262.5    3
裂解液    5    295    3
样品    5    295    3
样品    5    295    3
表1 蛋白浓度Brandford法 3 双向电泳过程
（1）样品上样：分析用胶蛋白上样量100 μg/块，制备用胶蛋白上样量200 μg/块。蛋白样品水化液(8 mol／L Urea，2％ CHAPS，2.8％ DTT，0.5％ IPG缓冲液)分装为500/管。上样之前先对样品进行如下操作：样品从-20℃冰箱取出后在冰上进行解冻；低速离心沉淀掉离心管壁上的水分；混匀0.5min；15000rpm，15℃离心2min；取100μg体积的蛋白溶液与水化液混合（总体积500μL）；混匀1min;离心15000rpm，15℃，2min。
（2）等电聚焦：胶条采用Ph3-10,24 cm的线性干胶条，在IPGphor中25℃按如下程序自动进行溶胀和等电聚焦：30 V，6 h；60 V，6 h；500 V，1 h；1 000V，1 h；1 000 V~4 000 V，1 h；4 000 V~8 000 V，1 h；8 000 V，73 000 V·hr。共约26 h 30 min，等电聚焦总电压时约83 000 V·hr。
（3）胶条平衡：聚焦结束后，先用平衡液I（50 mmol／L Tris-HCI pH 6.8，6 mol／L Urea，30％ Glycerol，2％ SDS，2％ DTT）轻微振荡平衡10 min，再换平衡液II（2％DTT换成2．5％ iodoacetamide，其余组分不变）轻微振荡平衡10 min。
（4）转向：平衡好的胶条转移至提前灌制好的聚丙烯酰胺凝胶上，并用琼脂糖封胶液(0.5%琼脂糖，0.002%（W/V）1%溴酚蓝储备液)封住胶条。
主要实验仪器：等电聚焦系统IPGphor及其附件，SDS-PAGE垂直电泳系统Ettan Daltsix及其附件，电泳循环水浴MultiTemp。
4染色过程方法（1）银染过程：固定(Fix)60minà敏化(Sensitization)30minà水洗(Wash)3次每次5minà银染 (Silver)20minà水洗(Wash)2minà显色(Develop)2minà终止(Stop)10minà水洗(Wash)3次每次5min。（2）荧光染色步骤：固定(Fix)30~60minà水洗(Wash)3次每次15minà染色(Stain)（避光）1.5~2hà褪色（褪色液）3次每次30minà水洗(Wash)3次每次5min。所有步骤军在摇床上进行，摇速40~60转/分钟。（3）试剂配制：
银染法：
固定液 100ml醋酸+400ml乙醇+500mlmilli-q
敏化液 300ml乙醇+3.14g乙酸钠+68g醋酸钠+700ml milli-q
银染液 2.5gAgNO3+1000mlmilli-q
显色液 25gNaCO3+400ul甲醛+1000ml milli-q
终止液 14.6gEDTA+1000ml milli-q Pro-QDiamond染色：固定液 500ml甲醇+100ml乙酸+400ml milli-q 褪色液 50ml 1M Ph4.0乙酸钠溶液+200ml乙腈+750ml milli-q 5双向电泳胶的扫描总蛋白电泳凝胶的扫描采用本实验室的ImageScanner扫描仪(Bioscience, Amersham)。磷酸化修饰的蛋白电泳胶的扫描，采用科学楼的TyphoonScanner扫描仪(moleculardynamics, part of Amersham Pharmacia Biotech)，激发波长为580nm，吸收波长为532nm。 6双向电泳图分析及割点
采用PharmaciaBiotech公司生产的ImageMaster 2D Platinum 6.0软件，检测蛋白斑点，分析不同样品双向电泳图谱的差异。蛋白斑点绝对含量由该软件对斑点面积和斑点颜色自动检测、计算获得。
割点采用手工方式进行，割点之前事先对要割取的蛋白点进行编号，为避免杂质污染全程操作均须戴帽子和口罩，将切割好的蛋白点放入已编号的离心管中。

作者: dog002 时间: 2012-12-3 16:12

新手上路学习了

研一，刚开始接触此方面，感觉植物蛋白的提取方法很多，有没有谁做过血清的蛋白质组提取，可以直接用于2DE，如何设计实验步骤除去血清中的盐类、脂类、氨基酸、酚类、糖类以及核酸等，谢谢

作者: ROSE李 时间: 2012-12-3 16:12

新手，新人，新领域！现在有个烟草叶片差异蛋白质组学小项目，有没有哪位可以告诉我，我可不可以在取样后把烟草叶片冻起来，等待时间充足再磨碎取总蛋白质？冷冻保存的时间和温度是多少为宜？

作者: 66+77 时间: 2012-12-3 16:13

我感觉用bardford法测定蛋白质浓度有些不准，因为裂解液中本身就含有去污剂，还原剂等干扰物质

作者: wawa 时间: 2012-12-3 16:19

植物蛋白提取

蛋白提取 (1)取0.5～1.0 g材料，用液氮研磨充分。 (2)加入10 m1预冷的三氯乙酸(TCA)提取液(10％TCA，0.07％DTT，溶解在丙酮中)。充分混合后，放在—20℃1 h。（DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2，常用还原剂，有抗氧化作用） (3)35000 g离心15 min，取沉淀。 (4)加入10 m1预冷的样品洗涤液(0.07％DTT，溶解在丙酮中)，充分混合后，放在—20℃1 h。 (5)12000 g离心15 min，取沉淀。 (6)重复步骤(4)和(5)两遍。 (7)去掉上清后，用parafilm封口，用针在膜上扎几个小洞，冷冻干燥。 (8)放于一80℃，或直接进行下一步提取。 (9)取适量干燥后的样品粉末，按20ul／mg的比例加入样品溶解液(9 M尿素，4％CHAPS，1％IPG缓冲液pH 3-10，1％DTT，35mM Tris)。 (10)放在36℃(不能高于37X2)的水浴中1 h，不时振荡。 (11)室温下12000 g离心15 min，取上清(可分两步离心)。 (12)在上清中加入至少4倍体积的预冷丙酮，振荡，放在一20℃1 h，在4℃下12000 g离心10 min，取沉淀，加入适量体积的水或样品溶解液。必要时(如果盐离子浓度比较高)重复此步骤一遍。 (13)放于--80℃，或直接用于电泳。

作者: ritou1985 时间: 2012-12-3 16:19

现在正在做 ,等有时间了我把总结出来的资料和谷友们分享,现在实验正紧,见谅!正在整理中先向各位学习一下,谢谢!

作者: DDD 时间: 2012-12-3 16:20

求用2-DE鉴定体外培养的动物细胞Co-IP的实验方案

作者: 49888 时间: 2012-12-3 16:20

TCA/丙酮沉淀法
取新鲜水稻叶片1 g，液氮充分研成粉状后，再加入10倍体积的10％TCA/丙酮（含20mM DTT）----我加了大概有20ml（我用50ml的管提取的）。涡旋后静置于-20℃沉降蛋白过夜；随后在16000×g 4℃离心30min，弃上清液---我用枪吸掉的。沉淀重悬于的三倍体积-20℃预冷的90%丙酮溶液（含20mM DTT）（3次）每次大概加的体积为20ml。期间用玻璃棒打碎沉淀，让沉淀充分悬浮起来，且每次期间加完丙酮后放置-20度沉淀1小时后再离心。最后一次离心16000×g 4℃离心30min弃上清。室温风干沉淀，然后加裂解液直接裂解或者-80℃保存。这期间一直用的50ml管提取的。
希望版主给予修改指正！

作者: ero11 时间: 2012-12-3 16:21

有没有关于细菌蛋白的提取，具体点

作者: 33号 时间: 2012-12-3 16:21

做根的话不推荐TCA丙酮法，浓度十分低，需要材料多，可以试试酚抽提，

作者: 911 时间: 2012-12-3 16:22

请问植物花的雌雄蕊用什么方法提取合适？有木有大虾知道的？？

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